五灵脂关联的熊果酸减轻白消安诱导的猪精原干细胞氧化损伤：AKT相关信号的潜在参与

《Antioxidants》：Wulingzhi-Associated Ursolic Acid Alleviates Busulfan-Induced Oxidative Injury in Porcine Spermatogonial Stem Cells: Potential Involvement of AKT-Associated Signaling

　　

五灵脂（Wulingzhi, WLZ）是一种含有多种化学成分的传统中药，具有抗氧化和细胞保护活性；然而，其保护精原干细胞免受化疗诱导氧化损伤的潜力尚不清楚。本研究在白消安诱导的猪精原干细胞（porcine spermatogonial stem cells, PSSCs）氧化损伤模型中，通过整合超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry, UHPLC–MS/MS）化学轮廓分析、网络药理学、分子对接和体外实验，研究了WLZ的保护作用，并探索了潜在的生物活性化合物及相关分子机制。通过UHPLC–MS/MS对WLZ进行化学轮廓分析，随后与从BATMAN-TCM和HERB数据库检索到的成分进行整合，建立了一个包含89种候选化合物的综合库。网络药理学和分子对接计算将熊果酸（ursolic acid, UA）优先确定为WLZ相关的候选成分，并将AKT1确定为后续实验评估的候选调控靶点。实验评估表明，WLZ和UA均能减轻白消安诱导的氧化损伤，表现为细胞活力提高、活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累减少和抗氧化能力恢复。UA的保护作用与AKT1转录本表达的变化相关，并被AKT抑制剂Miransertib减弱。相比之下，在缺乏UA的情况下，PI3K–AKT通路激动剂Recilisib独立地改善了白消安暴露的PSSCs中的抗氧化相关参数。UA处理还伴随着Nrf2及抗氧化基因SOD、CAT和GPX1转录水平的升高。这些发现表明，从整合的WLZ候选化合物库中优先确定的UA能独立减轻白消安诱导的PSSCs氧化损伤，并提示AKT相关信号可能参与了所观察到的抗氧化反应。本研究提供了WLZ和UA可减轻白消安诱导的PSSCs氧化损伤的初步体外证据，并支持进一步研究它们对化疗相关雄性生殖毒性的潜在保护作用。

研究背景与目的

癌症治疗，尤其是烷化剂如白消安的使用，虽显著提高了患者生存率，但其引起的男性生殖毒性，特别是对精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）的损伤，已成为影响幸存者生活质量的重要远期并发症。白消安通过诱导活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累，导致线粒体功能障碍、DNA损伤和凋亡，损害SSC的存活和自我更新。因此，寻找能够保护SSCs免受化疗氧化损伤的药物具有重要意义。五灵脂（Wulingzhi, WLZ）作为一种传统中药，具有抗氧化和细胞保护活性，但其对化疗所致雄性生殖毒性的保护作用及其活性成分和分子机制尚不明确。本研究旨在利用猪精原干细胞（porcine spermatogonial stem cells, PSSCs）作为体外模型，探究WLZ对白消安诱导氧化损伤的保护作用，并通过化学分析、网络药理学和分子对接等技术手段，筛选其潜在活性成分和作用靶点。

主要技术方法

研究人员采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC–MS/MS）对WLZ进行化学轮廓分析，并结合BATMAN-TCM和HERB数据库构建了包含89种候选化合物的综合化合物库。通过网络药理学预测WLZ成分与精子发生功能障碍相关疾病的共同靶点，并进行蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。利用AutoDock Vina软件对优先化合物与候选枢纽靶点进行分子对接。最后，在体外培养的PSSCs中进行功能验证实验，包括细胞活力检测（CCK-8法）、细胞内ROS水平测定（CM-H₂DCFDA探针）、氧化应激指标（超氧化物歧化酶SOD活性、谷胱甘肽GSH含量、丙二醛MDA水平）检测以及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达。此外，还使用了AKT抑制剂Miransertib和PI3K–AKT通路激动剂Recilisib进行药理调控。

研究结果

1. 1.
   WLZ减轻白消安诱导的PSSCs氧化损伤：白消安处理PSSCs后，细胞活力下降，细胞内ROS水平升高。在100μM和300μM白消安暴露下，一定浓度范围的WLZ（1和10μg/mL）均可显著改善细胞活力并降低ROS水平，表明WLZ在不同程度的白消安损伤模型中均具有保护作用。
2. 2.
   WLZ化学轮廓分析与综合化合物库构建：通过UHPLC–MS/MS在WLZ中注释了53种化合物。结合数据库检索，经去重后建立了包含89种独特化合物的WLZ候选化合物综合库。结构分类显示，萜类和环烯醚萜类化合物数量最多，其次是黄酮类、异黄酮类和呫吨酮类。
3. 3.
   网络药理学确定候选靶点和通路：从WLZ的89种候选成分预测到309个靶点，并与三个临床生殖障碍疾病（低促性腺激素性性腺功能减退症、睾丸发育不全、睾丸无精症）相关的2288个疾病靶点取交集，得到162个共同靶点。PPI网络分析经过三轮拓扑过滤，确定了八个候选枢纽靶点：AKT1、JUN、MAPK14、TP53、MAPK3、EP300、RELA和STAT3。基因本体论（GO）富集分析显示这些靶点涉及氧化应激等生物学过程。KEGG富集分析显示这些靶点富集于磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K–AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和肿瘤坏死因子（TNF）等信号通路。
4. 4.
   分子对接结果：对候选枢纽靶点进行KEGG分析，再次确认其与氧化应激和炎症信号通路的关联。分子对接结果显示，熊果酸（UA）与AKT1的结合能最低（-11.5 kcal/mol），其次是与EP300、MAPK14和MAPK3的结合，提示UA可能与这些靶点有较强的结合潜力。
5. 5.
   UA减轻白消安诱导的PSSCs氧化损伤：在PSSCs中，1μM的UA在不影响基础活力的前提下，能有效逆转白消安导致的细胞活力下降和ROS积累。UA处理还恢复了SOD活性和GSH含量，降低了MDA水平，并上调了Nrf2、SOD、CAT和GPX1的mRNA表达，这些效应与WLZ的作用相似。
6. 6.
   药理调控AKT相关信号对抗氧化反应的影响：白消安降低了AKT1的mRNA表达，而WLZ和UA处理使其表达回升。AKT抑制剂Miransertib减弱了UA对ROS清除、抗氧化酶活性和基因表达的改善作用。相反，PI3K–AKT通路激动剂Recilisib在缺乏UA的情况下，也能独立改善白消安暴露PSSCs的抗氧化相关参数。这表明AKT相关信号可能参与了氧化应激的调控。

结论与讨论

该研究证实，WLZ及其候选活性成分UA能有效减轻白消安诱导的PSSCs氧化损伤，其机制可能与恢复细胞氧化还原平衡和上调内源性抗氧化防御系统有关。网络药理学和分子对接结果提示AKT1可能是关键的调控节点，随后的药理实验也表明AKT相关信号可能参与了UA介导的抗氧化保护作用。这项研究为WLZ和UA用于防治化疗相关的男性生殖毒性提供了初步的体外证据。研究的局限性在于未能在实验中直接确认UA在WLZ提取物中的实际含量和贡献，药理实验缺乏必要的对照组来完全证明AKT依赖性机制，且未评估对DNA损伤和SSC功能的影响。未来需要通过更精确的化学分析、基因干预和体内实验来验证这些发现和阐明具体机制。

研究结论翻译

本研究探讨了WLZ对白消安诱导的PSSCs氧化损伤的保护作用及其潜在的药理学基础。整合的化学轮廓分析、网络药理学和分子对接将UA确定为WLZ的候选关联化合物，并将AKT1确定为实验评估的候选调控靶点。UA减轻了白消安诱导的氧化损伤，减少了ROS积累，并改善了细胞的抗氧化能力，重现了WLZ的几种保护效果。Miransertib减弱了UA的几种抗氧化反应，而Recilisib在无UA的情况下独立改善了白消安暴露PSSCs的抗氧化相关参数。这些发现表明AKT相关信号与抗氧化保护之间存在潜在关联。总之，这些结果支持UA是一种具有保护活性的WLZ候选关联成分，能够抵抗白消安诱导的PSSCs氧化损伤，并为后续研究其调控机制及对化疗相关雄性生殖损伤的潜在相关性奠定了基础。