一氧化氮（NO）是运动纤毛的重要调节因子。协调的纤毛摆动驱动黏液、细胞外液或细胞在组织表面运动，并在胚胎发育过程中驱动正确的器官左右不对称性的建立。NO与纤毛功能之间的联系在原发性纤毛运动障碍（PCD）中尤为明显，其中鼻NO降低是该病的诊断性标志，尽管其究竟是纤毛功能障碍的成因还是结果仍不清楚。对PCD及其他气道疾病的研究还表明，NO水平并不必然与一氧化氮合酶（NOS）表达或活性相关，提示纤毛组织中的NO生物利用度受额外机制调控。尽管数十年来已有证据将NO与纤毛功能相联系，但关于NO在纤毛细胞内如何产生与调控、NO信号在纤毛微环境中如何实现空间组织、以及其如何到达轴丝以调控纤毛结构与运动等基本问题仍然存在。本综述围绕可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）–环鸟苷酸（cGMP）信号、S-亚硝基化以及新兴的氧化还原依赖机制来探讨上述问题，这些机制调控运动纤毛中NO的生物利用度。
1. 引言
一氧化氮（NO）产生的起源及其作为信号分子的作用可追溯至现代真核生物的共同祖先，其中NO最初很可能作为代谢副产物生成。随着大气氧含量升高与有氧代谢的演化，NO逐渐获得调控功能，并成为生物学中最普遍存在的信号分子之一。目前已知NO调控众多生理过程，包括血管张力、神经传递、免疫应答与线粒体功能。就纤毛功能而言，NO正向调控纤毛运动的证据可追溯至三十多年前。20世纪90年代初的独立研究表明，药理学抑制一氧化氮合酶（NOS）可降低哺乳动物气道上皮细胞的纤毛摆动频率，而该效应可被L-精氨酸或NO供体所挽救，从而提供了内源性NO是气道纤毛功能关键生理调节因子的直接证据。随后，Jain等证明促炎细胞因子TNF-α与IL-1β通过诱导内源性NO产生来刺激气道纤毛摆动频率，这与炎性细胞因子能够诱导气道上皮细胞NOS2/iNOS表达的能力相一致。然而，在以低NO为特征的疾病中，新近研究未能建立NO水平降低与任何特定NOS亚型表达之间的一致关系。这在原发性纤毛运动障碍（PCD）中尤为明显：尽管存在气道炎症且iNOS表达得以保留，鼻NO仍显著偏低，提示NO生物利用度降低不能简单归因于NOS表达下降。支持NO在调控纤毛中具有功能作用的另一证据来自以下研究：临床相关浓度的乙醇刺激气道上皮释放NO，从而导致纤毛摆动频率增加。在发现NO影响纤毛运动之后不久，经典NO受体可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）参与纤毛细胞中NO信号转导即被确立为介导NO依赖性大鼠气道上皮纤毛摆动频率刺激的主要机制。
在随后的十年中，NO与气道健康之间的关联日益明显，NO测量成为呼吸系统疾病中的重要临床工具。在最初观察到PCD患者鼻NO水平显著降低之后，后续研究确立了鼻NO作为PCD敏感筛查标志物的地位。低鼻NO还与纤毛功能降低及不动纤毛比例升高相关，进一步将NO生物利用度与纤毛功能障碍相联系。美国胸科学会（ATS）与欧洲呼吸学会（ERS）对鼻NO测量的标准化确立了统一采样流程，并推动其与基因检测及纤毛结构与功能分析一同纳入PCD诊断的国际指南。NO生物利用度改变并不限于PCD，也见于其他与黏液纤毛清除受损相关的气道疾病。在囊性纤维化与慢性鼻窦炎中鼻NO同样降低，尽管程度通常较轻；而在慢性阻塞性肺疾病（COPD）中也可观察到呼出气NO水平改变，不过这些变化随疾病严重程度、炎症表型与吸烟状态而异。重要的是，鼻NO与呼出气NO代表不同的测量：鼻NO主要反映到达鼻腔与鼻旁窦气相的NO，而呼出气NO主要反映源自下呼吸道的NO。两种测量均不直接反映细胞NO产生或局部NO生物利用度。尽管可测NO水平改变与纤毛功能障碍之间存在强关联，但导致NO生物利用度改变的机制仍知之甚少，且很可能超出NOS依赖性NO产生的变化范围。
NO调控纤毛功能存在多种可能机制。其中最明确的是经典NO–sGC–cGMP通路，其中NO激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），升高cGMP并激活下游效应器，最终调控轴丝活性与纤毛摆动频率（图1）。NO还可通过半胱氨酸残基的可逆S-亚硝基化调控蛋白功能，这一信号机制日益被视为NO生物学的主要介导方式。S-亚硝基硫醇（SNO）是重要的内源性NO生物活性载体，通过S-亚硝基化调控蛋白功能，越来越多的证据表明S-亚硝基化与sGC激活代表互补而非互斥的NO信号通路。NO影响细胞信号的另一机制是通过其与ROS的相互作用。在氧化应激与氧化还原失衡条件下，NO易与活性氧特别是超氧化物反应，生成过氧亚硝酸盐等活性氮 species，后者可修饰蛋白并改变细胞功能。ROS本身是运动纤毛功能的公认调节因子，在生理与病理条件下均影响纤毛摆动频率与黏液纤毛清除，但ROS如何影响运动纤毛中NO的可利用性与信号传导仍未被表征。尽管三十多年的研究已证明NO调控纤毛功能，但将NO产生与轴丝活性变化相联系的分子机制仍出人意料地不明确。基本问题包括：哪些NOS亚型产生相关NO、NO在纤毛细胞内的何处产生、新近鉴定的珠蛋白等调节因子如何控制NO生物利用度、NO信号相对于轴丝如何空间组织、以及sGC–cGMP信号、S-亚硝基化与氧化还原依赖机制如何汇聚于纤毛机器。本综述讨论运动纤毛NO信号传导研究进展，并强调该领域的主要机制空白与新兴方向。
图1. NO来源与经典NO信号。一氧化氮（NO）由一氧化氮合酶（NOS）以L-精氨酸为底物产生，或通过涉及亚硝酸盐还原的替代途径产生。珠蛋白通过与NOS相互作用及亚硝酸盐代谢调控NO生物利用度。NO激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），增加cGMP生成并激活蛋白激酶G（PKG）。该通路受磷酸二酯酶5（PDE5）调控，并可被sGC刺激剂与激活剂药理学增强。实线箭头表示已确立通路，虚线箭头表示推测或尚未完全表征的机制。
2. 运动纤毛中钙–NO信号的保守性
运动纤毛是特化的细胞突起，由锚定于基体的9 + 2微管轴丝构成，基体作为纤毛组装、定向与蛋白进入的结构模板。纤毛可作为单一细胞器存在，也可每细胞数百根，每条轴丝与自身基体相关联。基体来源于中心粒，与纤毛一起代表一种进化上古老的结构，已在最后真核共同祖先中存在。事实上，9+2轴丝架构在真核生物中高度保守，在不同生物中维持基本保守的功能。运动纤毛与鞭毛存在于单细胞真核生物中，包括藻类、纤毛虫与领鞭毛虫，在那里支持运动、摄食与环境感知。它们在动物界也广泛分布，从海洋无脊椎动物（驱动幼虫游泳、摄食与配子运输）到脊椎动物（在多个器官中推动细胞外液）。在胚胎节点，运动纤毛产生建立左右不对称所需的向左液流；而在呼吸道、生殖道与脑室的多纤毛上皮中，协调的纤毛摆动分别驱动黏液运输、配子运动与脑脊液循环。
纤毛运动最明确的细胞内调节因子之一是钙，其通过分布于整个轴丝的钙敏感蛋白调节纤毛摆动频率与波形。在单细胞绿藻莱茵衣藻中，细胞内Ca2+变化通过钙调蛋白、LC4、centrin与calaxin等保守钙传感器调控鞭毛波形、趋光性与轴丝动力蛋白活性，表明运动性的钙依赖性调控早于多细胞动物的出现。同样，四膜虫纤毛虫提供了钙介导运动性调控的最优雅范例之一，其中膜去极化触发Ca2+流入纤毛，产生钙调蛋白依赖性轴丝动力蛋白活性快速切换，逆转纤毛波形并使生物体向后游动。事实上，钙调蛋白及钙调蛋白相关复合物定位于径向辐条，在那里调控中央器与轴丝动力蛋白之间的通讯，而若干内臂动力蛋白组分直接受钙依赖机制调控，控制纤毛弯曲幅度与波形。尽管轴丝动力蛋白的钙依赖性调控在进化上保守，其生理输出在不同生物中已多样化。在脊椎动物中，钙不诱导纤毛摆动逆转，而是调节纤毛摆动频率、波形与摆动协调性，参与黏液纤毛清除、卵母细胞运输、精子运动、脑脊液循环与胚胎左右模式形成。
鉴于钙调蛋白是轴丝内高度保守的钙传感器，神经元nNOS（NOS1）与内皮eNOS（NOS3）均受Ca2+/钙调蛋白激活，且nNOS与eNOS已定位于运动纤毛并被证明调控纤毛摆动频率，很容易推测NOS的钙依赖性激活代表一种进化上保守的机制，将钙信号与NO产生相联系以调控纤毛运动。该假说得到哺乳动物气道上皮生理学研究的支持，这些研究表明ATP诱导的细胞内Ca2+升高需要激活NO–sGC–cGMP通路才能刺激纤毛摆动频率，因为药理学抑制NOS、sGC或PKG可消除钙依赖性反应。进一步证明钙依赖性NO信号调控轴丝蛋白的磷酸化与去磷酸化，提供NO将钙信号与纤毛机器翻译后调控相联系的直接证据。
后续研究表明多种生理刺激汇聚于这一钙–NO信号轴。在气道上皮细胞中，与打喷嚏相关的机械刺激触发ATP释放、细胞内Ca2+升高与NOS依赖性NO产生，导致纤毛摆动频率增加与黏液纤毛清除增强。类似地，细菌脂多糖激活机械敏感TRPV4通道，产生Ca2+依赖性NO生成，增加纤毛摆动频率的同时增强先天免疫防御。细菌产物激活苦味受体同样刺激Ca2+依赖性NO产生以加速黏液纤毛清除；该反应在囊性纤维化中因CFTR依赖性NO信号降低而受损。重要的是，Ca2+与NO信号在运动纤毛与鞭毛调控中的相互作用强烈依赖细胞与生理背景。生殖道提供了尤为显著的例子。在受精前后，输卵管中NO产生增加促进精子鞭毛运动，与超激活相关，其特征为鞭毛弯曲增加与更不对称的波形，涉及NO依赖性细胞内Ca2+信号调控。相反，在输卵管纤毛上皮细胞中，ATP诱导的纤毛摆动频率Ca2+依赖性增加被孕酮诱导的NOS依赖性NO信号所减弱。在功能上，NO抑制上皮纤毛运输而促进精子活动，可能有利于精子–卵母细胞相遇与受精。
3. 纤毛细胞中NO的来源
NO是长期寻求的内皮源性舒张因子（EDRF）这一发现彻底改变了细胞信号领域，并获1998年诺贝尔生理学或医学奖。在内皮中，NO由内皮NOS（eNOS/NOS3）响应流体剪切应力以L-精氨酸合成，扩散至下方平滑肌并激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），导致环鸟苷酸（cGMP）依赖性血管舒张。在此，NO产生本身受初级纤毛调控，其中多囊蛋白-1/多囊蛋白-2（PC1/PC2）机械感觉复合物检测流体流动，触发细胞内Ca2+信号并促进Ca2+/钙调蛋白依赖性NO合成。这些发现确立了纤毛机械感觉与NO产生之间早期的直接联系，并提出运动纤毛中可能存在类似机制。
运动纤毛细胞中NO的主要酶源是一氧化氮合酶（NOS）。三种哺乳动物NOS亚型——神经元型（nNOS/NOS1）、诱导型（iNOS/NOS2）与内皮型（eNOS/NOS3）——均已在运动纤毛细胞中被报道，尽管它们对局部NO产生的相对贡献仍不清楚。nNOS与eNOS为组成型表达并受Ca2+/钙调蛋白激活，而iNOS组成型结合钙调蛋白并主要在转录水平受调控。eNOS已在上皮细胞纤毛区顶端部分、输卵管纤毛上皮、室管膜与睾丸中被检测到，也有报道定位于基体。神经元NOS已定位于人与小鼠气道纤毛。在小鼠气管多纤毛细胞中，nNOS定位于基体、基足以及顶端肌动蛋白与微管网络。nNOS缺失破坏平面细胞极性、纤毛组织与定向液流。与在细胞极性决定中更广泛作用相一致，非洲爪蟾胚胎中nNOS直系同源物被发现调控胚胎轴伸长过程中的细胞极化。iNOS对运动纤毛的贡献定义较不明确。iNOS主要受炎症刺激调控，是炎症期间气道NO的重要来源。哮喘提供了明确范例，其中iNOS在支气管上皮中被诱导，与健康对照相比iNOS表达增加且呼出气NO分数（FeNO）升高，后者现广泛用作气道炎症的临床生物标志物。然而，在以黏液纤毛清除受损为特征的疾病中，这种关系在很大程度上失效，关于NOS表达与NO水平的现有数据常相互矛盾。
PCD最清晰地说明了NOS表达与可测气道NO之间的脱节。来自鼻上皮细胞转录分析的一些证据表明iNOS表达与鼻NO相关，且在PCD中较继发性纤毛运动障碍降低。然而，其他研究表明尽管PCD特征性鼻NO显著降低，iNOS表达在很大程度上得以保留。对PCD患者上气道组织的研究显示，尽管鼻NO显著降低，iNOS免疫反应性仍突出存在于纤毛上皮细胞顶端极，且与对照相当。类似地，PCD患者气道上皮培养物表达iNOS、eNOS与nNOS并保留产生NO的能力，尽管其响应炎症刺激增加NO产生的能力似乎取决于刺激的性质与持续时间。具体而言，iNOS对炎症刺激的反应多变。在肺炎链球菌感染早期，健康纤毛上皮细胞增加iNOS表达与NO产生，而PCD细胞未能诱导任一反应。相反，暴露于流感嗜血杆菌或促炎细胞因子的PCD培养物显示NO产生增加，与非PCD培养物相当。这些差异可能反映病原体、暴露持续时间与炎症背景，而非PCD中iNOS的组成性缺失。因此，尽管低鼻NO是PCD显著一致的特征，iNOS表达与可诱导性在该病中并未一致降低。重要的是，鼻NO与呼出气NO是呼吸道不同区域到达气相的NO测量，不应被视为等同于细胞NO产生或局部NO生物利用度。
若干观察表明NO在PCD气道中合成但未到达气相，提示低鼻NO不一定反映细胞NO产生的相应降低。气道中产生的NO可发生氧化及其他氧化还原反应，形成更稳定的代谢物，包括亚硝酸盐与硝酸盐以及S-亚硝基硫醇。这些代谢物在PCD儿童中并未降低，提示NOS活性并未降低到低鼻NO所暗示的程度。PCD气道上皮细胞积累3-硝基酪氨酸与硝酸盐，同时PCD气道表现出更高浓度的H2O2，并比对照细胞更快消耗气相NO，该效应可被超氧化物歧化酶与NADPH氧化酶抑制所逆转，表明在某些情况下NO是在局部被氧化而非从未形成。气道解剖结构独立贡献：额窦与蝶窦发育不全或发育不良在PCD中较继发性纤毛运动障碍明显更常见，并与鼻NO呈负相关，因此NO产生与储存表面积减少会降低鼻NO，而气道细胞内iNOS表达或活性并无任何变化。流量分区测量进一步定位缺陷，PCD中支气管NO通量降低而肺泡NO与健康受试者无法区分。
囊性纤维化（CF）与COPD进一步说明NOS表达与气道NO之间的分离。在CF中，尽管该病具有特征性炎症环境，气道上皮中iNOS显著降低。CF支气管上皮细胞中iNOS缺失且不能被细胞因子刺激诱导，而在浸润炎症细胞中仍易于检测到。随后在小鼠与人CF气道细胞中证明上皮iNOS表达降低，并与CFTR功能相联系。然而CF气道含有丰富的NO氧化产物，即使在呼出气NO未升高时，痰或呼出气冷凝物中也检测到亚硝酸盐与硝酸盐增加。精氨酸酶活性增加可能通过与NOS竞争L-精氨酸进一步限制NOS依赖性NO产生。在COPD中关系相反：肺组织中iNOS阳性细胞与NOS表达增加，而呼出气NO未升高到哮喘中所见程度，其增加主要局限于肺泡腔并与疾病严重程度相关。总之，这些观察表明NOS表达单独是气道NO可利用性的不良预测因子，且NOS表达、NO产生及其下游代谢物之间的关系在不同气道疾病中差异很大。
4. 珠蛋白成为运动纤毛NO信号调控因子
对NOS表达与NO水平之间明显脱节的一种可能解释是存在控制NOS活性与局部NO生物利用度的额外调控机制。近期研究已鉴定珠蛋白家族成员为NO信号的重要调节因子，超出其经典氧运输作用。细胞珠蛋白（Cygb）最近被鉴定为通过与NOS分子相互作用调控运动纤毛中NOS依赖性NO产生的上游调节因子。在斑马鱼左右组织者中，细胞珠蛋白与Nos2b（斑马鱼eNOS同源物）共定位于纤毛细胞并促进局部NO产生。细胞珠蛋白缺失降低NO生物利用度、缩短纤毛、改变轴丝超微结构并破坏左右模式形成。类似地，细胞珠蛋白缺陷小鼠表现气管NO水平降低与气道纤毛缩短，确立Cygb为NO信号与运动纤毛功能的保守调控因子。
除调控NOS活性外，珠蛋白还通过亚硝酸盐代谢成为NO生物利用度的生理相关调节因子。在缺氧条件下，脱氧亚铁珠蛋白（Fe2+）将亚硝酸盐（NO2?）还原为NO，在氧依赖性NOS活性受限时提供替代NO来源。亚硝酸盐还原酶活性已在若干珠蛋白中得到证明，包括血红蛋白、细胞珠蛋白与鱼类特异性Globin X。珠蛋白依赖性亚硝酸盐还原的生理相关性已在多个生物系统中得到证明，在鱼类中亚硝酸盐补充促进斑马鱼心脏再生的发现说明了亚硝酸盐衍生NO的潜在作用。此外，珠蛋白表达本身受环境氧可利用性与热应激动态调控，在鱼类与哺乳动物中均如此，将珠蛋白功能与生理适应相联系。
珠蛋白作为NO信号局部调控因子的新兴作用进一步得到其他珠蛋白家族成员研究的支持。内皮血红蛋白α被证明调控血管内皮细胞中eNOS衍生NO信号，确立珠蛋白作为红细胞之外组织特异性NO生物利用度调节因子的概念。该概念随后扩展至气道上皮，其中血红蛋白在分化纤毛上皮细胞中表达。在这些细胞中，Hbβ与eNOS共定位于顶端表面并影响氮氧化物代谢，支持珠蛋白在纤毛组织中局部调控NO信号的作用。
该调控网络的另一新兴成员是雄激素珠蛋白（Adgb），一种大型嵌合珠蛋白，其表达与运动纤毛发生紧密相关。Adgb受FOXJ1转录调控，在多纤毛组织中高度富集，包括气道、输卵管、脑室管膜与睾丸，Adgb缺失导致男性不育。分离的Adgb血红素结构域生化研究已在体外证明NO结合与亚硝酸盐还原酶活性。在嗜热四膜虫中，Adgb富集于运动纤毛并与C1b/C1f中央器复合物组分相关联，尽管Adgb缺失仅引起纤毛运动性的轻微改变。近期研究进一步证明Adgb经历Ca2+依赖性蛋白水解加工，生成稳定切割产物，且分离的珠蛋白结构域表现出与钙调蛋白增强的相互作用以及优先定位于中心体结构。这些发现提示Ca2+依赖性加工可能调控Adgb珠蛋白结构域的可及性与亚细胞定位。其定位与生化发现提出一个有趣的可能性：Adgb可能调控运动纤毛信号，或许通过调节NO生物利用度或其他尚待定义机制。尽管这些功能仍待体内证明，来自细胞珠蛋白、血红蛋白与雄激素珠蛋白的综合证据支持一个新兴范式：珠蛋白作为NO信号的组织与区室特异性调节因子，参与运动纤毛中NO生物利用度的时空控制。
5. 纤毛中sGC-cGMP信号通路
可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）是NO的主要受体，介导经典NO–cGMP信号通路。sGC是α/β异二聚体，β亚基含有一个血红素辅基，结合NO并激活催化结构域，导致GTP转化为cGMP。cGMP随后可激活cGMP依赖性蛋白激酶（PKG），后者是NO–sGC信号的主要下游效应器（图1）。sGC与PKG均已在呼吸纤毛上皮中被检测到。机制上，NO依赖性纤毛摆动频率增加与cGMP及PKG活性升高相关，而抑制PKG可阻止该反应。Gertsberg等证明Ca2+依赖性轴丝蛋白磷酸化状态变化需要NOS、sGC与PKG活性，提供NO产生与轴丝机器修饰之间的机制联系。采用猪分离气道纤毛的磷酸丝氨酸免疫印迹，他们鉴定出若干以NOS/sGC/PKG依赖性方式发生磷酸化或去磷酸化的纤毛多肽。然而，这些蛋白未被分子鉴定，且均未被证明为直接PKG底物。更近期的磷酸化蛋白质组学研究大幅扩展了轴丝动力蛋白中磷酸化位点的鉴定，包括多种运动纤毛系统中外臂与内臂动力蛋白重链及相关调控组分的位点。在草履虫中，纯化PKG对纤毛蛋白底物的直接磷酸化已在体外得到证明。然而，运动纤毛中直接PKG底物的分子身份仍未解决。
cGMP还可通过PKG非依赖机制调控气道纤毛活动，表明运动纤毛中NO–cGMP信号的下游组织比简单线性通路更为复杂。尽管有大量证据支持NO–cGMP信号在调控纤毛运动中的作用，若干基本问题仍然存在。第一，NO–cGMP信号是直接作用于轴丝，还是主要靶向影响摆动的细胞质或膜相关蛋白而间接发挥作用？第二，各信号组分相对于轴丝位于何处？第三，由于上皮细胞含有数百根运动纤毛，每根均能产生并响应NO，cGMP信号是否在空间上区室化以实现对纤毛活动的局部与协调调控？sGC、PKG与磷酸二酯酶的分子特性已在别处广泛综述，此处仅就其解决上述问题而讨论。
其他细胞系统中的cGMP信号高度区室化，由鸟苷酸环化酶产生空间受限的cGMP池，并受局部磷酸二酯酶（PDE）活性塑造。这种组织延伸至感觉纤毛，其中环化酶、PDE与下游效应器可定位于不同亚纤毛域。cGMP水解PDE5（图1）等PDE也已在气道纤毛上皮中被鉴定，并在此被证明调节纤毛活动。然而，cGMP信号是否类似地在运动纤毛内区室化尚未被直接证明。这种组织可提供一种机制，将局部NO产生与特定轴丝靶点偶联，而无需全细胞cGMP大幅变化。鉴于新兴证据表明NO产生本身可能在运动纤毛内空间组织，这种可能性尤为引人注目。NOS亚型已被报道位于顶端、基体与纤毛位置；Cygb调控纤毛NO产生；Adgb已沿轴丝被鉴定。因此，局部组织的NO–sGC–cGMP信号枢纽可将轴丝处或附近产生的NO与PKG依赖性纤毛马达及相关蛋白调控偶联。然而，尽管NO生成与调控蛋白的定位日益明确，sGC相对于运动轴丝的定位、cGMP–PKG信号的空间组织及其直接轴丝靶点的身份仍知之甚少，哺乳动物运动纤毛中直接轴丝PKG底物仍未鉴定。运动纤毛的NO来源已被越来越精确地定位，而转导其输出的受体尚未被置于相对于轴丝的位置。
额外调控水平可能来自sGC本身的氧化还原状态。其亚铁血红素氧化或血红素丢失降低对NO的响应性，并可生成NO不敏感性apo-sGC。这是否发生在纤毛细胞中鲜有关注，但在与COPD等慢性气道疾病相关的氧化与炎症条件下可能尤为重要。在此背景下，即使NOS表达与NO产生得以保留，NO–cGMP信号也可能受损，为上述NOS表达与NO生物利用度之间的分离提供额外机制。为克服受损NO–sGC信号，尤其在心血管与肺血管疾病中，已开发出日益增多的药理学手段：sGC刺激剂已进入临床实践以增强通过还原型含血红素酶的信号，而sGC激活剂可独立于NO刺激氧化型或血红素缺陷型sGC。通过直接靶向sGC恢复纤毛功能的可能性已在斑马鱼左右组织者中得到证明，其中缺乏Cygb并因此NO信号缺陷的胚胎表现侧化缺陷，可通过药理学激活sGC挽救。该发现证明即使上游NO可利用性受损，纤毛sGC–cGMP通路仍可药理学访问，并提出在NO生物利用度缺陷条件下直接靶向sGC可恢复纤毛信号的可能性。连同该通路尚未解决的空间组织，这些观察提出重要问题：疾病是破坏NO产生、其通过sGC–cGMP的局部传递，还是两者兼有。
6. S-亚硝基化（SNO）：运动纤毛调控的新途径
一氧化氮是生物功能的广泛调节因子，最常通过激活sGC–cGMP信号通路来表征。然而，NO还可通过S-亚硝基化直接调控蛋白功能，这是一种可逆翻译后修饰，涉及将NO基团加到半胱氨酸硫醇上形成S-亚硝基硫醇（SNO）。S-亚硝基化提供一种机制，通过该机制局部NO可利用性与细胞氧化还原环境可快速可逆地修饰蛋白活性。可用于SNO形成的NO可源于NOS依赖性合成、通过转亚硝基化在蛋白硫醇之间转移NO基团，或替代NO来源，包括珠蛋白介导的亚硝酸盐还原。
S-亚硝基化介导运动纤毛轴丝调控的最佳证据来自精子鞭毛。对经S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO，一种生理NO供体与SNO储库）处理的人精子进行的蛋白质组学研究，在人精子中鉴定出240种S-亚硝基化蛋白，S-亚硝基化靶点定位于整个鞭毛，确立了该系统中大量候选SNO调控靶点。除靶点鉴定外，S-亚硝基化在该系统中还具有已证明的功能作用，尤其在Ca2+信号方面。Ca2+动员驱动鞭毛 excursion 与运动，而在人精子中，暴露于NO供体或GSNO触发Ca2+动员，该效应在SNO蛋白还原后可逆且不依赖sGC。NO还增强对孕酮的Ca2+反应并增强鞭毛 excursion。人女性生殖道外植体的额外发现显示精子中诱导S-亚硝基化，提示NO与S-亚硝基化共同在生理相关背景下调控轴丝行为。
气道运动纤毛中S-亚硝基化的直接证据也已有报道。对分离牛气管轴丝的蛋白质组分析在对照与酒精暴露条件下鉴定出622种蛋白中的1,001个推定S-亚硝基化位点，并鉴定蛋白磷酸酶1（PP1，一种纤毛运动调节因子）为S-亚硝基化纤毛蛋白。后续研究将这些发现扩展至小鼠与人气道模型，证明S-亚硝基化定位于纤毛，并鉴定PP1的Cys155为功能重要的S-亚硝基化位点。PP1 Cys155突变阻止酒精诱导的PP1 S-亚硝基化，并恢复分离人气道轴丝中cAMP依赖性纤毛摆动频率反应性。GSNO也存在于气道衬液中，并据报道增强纤毛运动。更近期，对分化人气道上皮培养物的GSNO处理被证明增加暴露于细菌生物膜的囊性纤维化与慢性鼻窦炎培养物中的纤毛摆动频率。然而，这些研究未确立GSNO对纤毛运动的影响由轴丝机器的S-亚硝基化所介导。这种关系与原发性纤毛运动障碍（PCD）病理尤为相关。尽管PCD气道中鼻NO显著降低，近期工作指出亚硝化与氧化信号存在实质性改变，且PCD气道细胞的转录谱分析已鉴定出一条纤毛相关谷胱甘肽通路，进一步将纤毛区室与硫醇/氧化还原调控相联系。
总之，这些发现将S-亚硝基化定位为运动纤毛中NO信号的潜在第二臂，与经典NO–sGC–cGMP–PKG通路并行运作。尽管蛋白质组学研究已在气道轴丝中鉴定出众多候选S-亚硝基化蛋白，大多数候选靶点的功能意义仍未知。特别是，轴丝马达机器的核心组分（包括动力蛋白及其调控复合物）是否直接受S-亚硝基化调控仍知之甚少。绘制生理与疾病条件下运动纤毛的S-亚硝基蛋白质组，可能揭示局部NO可利用性与氧化还原状态控制纤毛机器的额外层面。
7. 纤毛仅是效应器还是细胞信号的调控者？
在前述章节中，我们讨论了纤毛形成与运动如何是NO–sGC–PKG轴的主要调控结果。其逆过程是否同样成立仍是一个开放问题，在既产生又响应机械力的运动纤毛中尤为引人注目。与初级纤毛采样别处产生的流动不同，运动纤毛产生它们将要感知的流动。因此，运动纤毛中的任何机械感觉能力都嵌入一个潜在反馈回路：摆动产生剪切，剪切被转导，转导改变摆动。该反馈是否在运动纤毛中参与NOS与NO信号尚未确立。若NO参与该回路，则纤毛运动将不仅是NO信号的输出，也是其决定因素之一。
先例来自初级纤毛，其中机械感觉已确立。NOS亚型已在多种细胞类型的初级纤毛区室内被报道。内皮纤毛作为流体剪切传感器，通过多囊蛋白-1将流动转导为Ca2+内流与NO产生，针对PC2的阻断抗体可消除野生型细胞中的流动反应。在致密斑中，通过IFT88敲低破坏初级纤毛显著降低流动诱导的NOS1介导NO产生。在骨细胞中，NO产生随纤毛长度变化，进一步提示纤毛结构可决定机械感觉反应的幅度。因此，在这些系统中，纤毛功能位于NO产生上游，将机械刺激转化为NOS激活与NO信号。因此，机械感觉纤毛–Ca2+–NOS–NO通路在初级纤毛中得到支持，但尚未证明在运动纤毛中运作。
运动纤毛是否具有该能力较不明确，尽管它们拥有能够机械感觉的机器。TRPV4定位于气道运动纤毛，将物理与化学刺激转导为调控纤毛摆动频率的Ca2+信号。运动纤毛能响应机械线索的功能证据也来自非洲爪蟾纤毛上皮，其中纤毛生成流体流动反馈以精化纤毛极性。然而，这些机械感觉反应是否与NO产生偶联仍未知。上述观察均未证明运动纤毛的机械刺激激活NOS或增加NO产生。因此，所提出的运动纤毛中纤毛生成流动或机械刺激与Ca2+依赖性NOS激活及NO产生的偶联仍属假说。相反调控方向的最清晰证据来自Cygb，其与NOS共定位于运动纤毛，其缺失损害NOS活性、降低NO可利用性并破坏纤毛运动与流体流动，这些表型可被NO供体或sGC刺激挽救。因此，充足的NO可利用性是正常运动纤毛功能所必需，确立潜在双向关系的一臂（图2）；纤毛机械感觉或运动是否反向调控NO产生仍有待确定。
图2. NO信号与运动纤毛功能之间提出的双向关系。机械刺激，包括纤毛生成流体剪切应力，可激活纤毛细胞中Ca2+信号。Ca2+/钙调蛋白依赖性nNOS/eNOS激活可促进NO产生，尽管纤毛生成机械刺激与Ca2+信号同NOS激活的偶联尚未在运动纤毛中得到证明。珠蛋白可通过调节NOS活性、NO结合与亚硝酸盐依赖性NO产生进一步调控局部NO生物利用度。NO通过经典sGC–cGMP–PKG通路以及可能通过纤毛蛋白S-亚硝基化（SNO）调控纤毛功能。反过来，NO依赖性信号调控纤毛摆动与流体流动，提出纤毛生成剪切应力反向调控NO产生的反馈机制可能性。实线箭头表示已确立通路，灰色虚线箭头表示运动纤毛中推测或尚未完全表征的机制。应注意，纤毛生成机械刺激与Ca2+信号向NOS激活及NO产生的反馈仍属假说。NO，一氧化氮；NOS，一氧化氮合酶；sGC，可溶性鸟苷酸环化酶；cGMP，环鸟苷酸；PKG，蛋白激酶G；SNO，S-亚硝基化。实线箭头表示已确立通路，虚线箭头表示推测或尚未完全表征的机制。
这就是空白所在。纤毛运动受损的人类疾病，尤以PCD为首，与气道NO降低强烈相关，然而因果关系方向从未被解决：低NO可能损害纤毛功能，不动可能降低剪切依赖性NO产生，或者，如上述不一致表达数据所允许的，两者均源于气道环境的共同上游变化。区分这些可能性需要直接操纵纤毛摆动及由此产生的流动的实验，通过药理学或遗传学阻止运动或对纤毛培养物施加受控剪切，同时测量NO输出、NOS表达及通过NOS–sGC–cGMP轴的流量。据我们所知，此类研究尚属空白，它们代表该领域较易解决的开放问题之一。一个实际障碍最近已缓解：现已有描述在气–液界面分化的小鼠气管上皮细胞中直接定量NO产生的方案。
8. 结论
总之，这些研究确立NO信号是运动纤毛在发育、生殖与气道生理中的重要调节因子，而其失调日益与人类纤毛疾病相联系。PCD提供了最清晰的临床联系，鼻NO显著降低代表该病的定义性生化特征，而在COPD等慢性气道疾病中也观察到NO信号改变与纤毛功能受损。一个重要未来方向将是确定这些变化是纤毛功能障碍的结果还是主动促进疾病进展。Cygb作为纤毛NO信号调控因子的鉴定，连同Adgb新兴的潜在作用，进一步将该通路扩展至NOS之外，并提示局部NO稳态的其他调节因子仍有待发现。定义这些机制在不同纤毛组织与疾病状态中如何不同，最终将对于将NO信号生物学转化为恢复纤毛功能的策略至关重要。
