《Cells》：Transcriptome Analysis Reveals the Role of Partial Lymphatic Vessel Ligation in Rats with Cirrhotic Portal Hypertension
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肝脏淋巴系统在肝硬化门静脉高压（portal hypertension, PHT）的进展中发挥关键作用，其特征为显著增强的淋巴管生成（lymphangiogenesis）。然而，在肝硬化中肝脏淋巴功能引流的作用尚未得到充分研究。因此，本研究旨在探讨肝脏部分淋巴
肝脏淋巴系统在肝硬化门静脉高压（portal hypertension, PHT）的进展中发挥关键作用，其特征为显著增强的淋巴管生成（lymphangiogenesis）。然而，在肝硬化中肝脏淋巴功能引流的作用尚未得到充分研究。因此，本研究旨在探讨肝脏部分淋巴管结扎（partial lymphatic vessel ligation, PLVL）对PHT的影响。研究人员通过胆总管结扎（common bile duct ligation, BDL）建立大鼠模型，并通过结扎门静脉和腹腔淋巴结实现PLVL。研究评估了肝硬化和PHT的严重程度，以及巨噬细胞浸润（macrophage infiltration）和淋巴管生成情况。研究人员利用肝脏bulk RNA-seq（bulk RNA sequencing）探究潜在机制。从GEO数据库获取单细胞RNA-seq（single-cell RNA sequencing）和bulk RNA-seq数据集。人真皮淋巴管内皮细胞（human dermal lymphatic endothelial cells, hLECs）用于体外验证。淋巴引流结扎导致BDL大鼠出现严重的肝硬化和PHT恶化。研究人员的bulk RNA-seq结果显示，BDL大鼠在PLVL后血管重塑（vascular remodeling）和血管生成（angiogenesis）相关通路以及脂质代谢（lipid metabolism）相关生物学功能显著富集。进一步结合公共数据集的分析鉴定出BDL和PLVL大鼠中多个内皮细胞（endothelial cells）特异性上调基因。研究人员还在从小鼠肝脏分离的淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cells, LECs）的bulk RNA-seq中鉴定出LEC来源的上调基因，并通过将hLECs与TNF-α、LPS、TGF-β1共同孵育进行验证。在本研究中，研究人员提供了首个证据，证明肝脏淋巴引流（hepatic lymphatic drainage）阻断可加重BDL诱导的肝硬化PHT。当考虑肝炎症（hepatic inflammation）和免疫反应（immune response）为重要调控机制时，LEC相关分泌蛋白（secretory proteins）可能在PHT进展中发挥潜在作用。
肝脏淋巴系统在维持机体液体稳态、免疫调节及脂质代谢中发挥重要作用。肝脏作为最大的产淋巴器官，可产生超过25%至50%的流经胸导管淋巴液。近年来，大量研究表明肝淋巴血管系统在肝硬化（cirrhosis）及门静脉高压（portal hypertension, PHT）的发生发展中具有关键意义，其特征表现为显著的淋巴管生成（lymphangiogenesis）增强。然而，相较于皮肤、肿瘤及心血管领域，肝脏淋巴系统，尤其是在慢性肝病（chronic liver disease, CLD）进展过程中的研究仍显不足。PHT是慢性肝病终末期阶段的综合征，以门静脉压力（portal pressure, PP）异常升高为主要特征。肝硬化时，肝内微循环功能障碍导致肝内血管阻力（intrahepatic vascular resistance, IHVR）增加，构成PHT发生的主要血流动力学基础。同时，肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells, LSECs）的去窗孔化及血管样表型转变可致肝窦僵硬度增加，进一步升高IHVR并引发高动力性内脏循环，形成恶性循环。既往研究多聚焦于促进淋巴管生成的VEGF-C/VEGFR-3信号通路，并已证实肝淋巴管生成增强具有引流代谢废物及炎症因子的代偿意义。但关于肝淋巴引流功能在肝硬化PHT中的具体作用，尤其是引流受阻后的病理后果，目前尚缺乏深入研究。已知肝内淋巴管主要分布于门管区，负责收集约80%的肝脏淋巴液并最终引流入门静脉及腹腔淋巴结。因此，在生理及病理状态下，肝淋巴引流的通畅性对维持肝脏稳态至关重要。
本研究旨在建立基于胆总管结扎（common bile duct ligation, BDL）诱导的肝硬化PHT大鼠模型上的部分肝淋巴管结扎（partial lymphatic vessel ligation, PLVL）模型，通过外科手段阻断肝淋巴引流，系统评估其对肝硬化严重程度、PHT、肝纤维化（hepatic fibrosis）、炎症及淋巴管生成的影响，并借助转录组学技术探讨其潜在分子机制，以期为肝硬化PHT的防治提供新的理论依据和靶点。
二、研究方法
研究人员将51只6至8周龄Sprague Dawley（SD）大鼠随机分为Sham、Sham+PLVL、BDL及BDL+PLVL四组。BDL手术用于建立肝硬化PHT模型，PLVL则通过结扎门静脉及腹腔淋巴结的输出淋巴管实现，术中经肝实质注射Evans blue以验证淋巴引流阻断效果。研究采用肝脏bulk RNA-seq（bulk RNA sequencing）进行全肝转录组测序，并整合GEO数据库中人肝硬化样本的单细胞RNA-seq（single-cell RNA sequencing，数据集GSE136103）以及小鼠LEC（lymphatic endothelial cells）富集的bulk RNA-seq数据集（GSE255346、GSE276093）进行联合分析，通过STRING（search tool for the retrieval of interacting genes/proteins）蛋白互作网络预测分泌蛋白的下游受体。体外实验采用人真皮淋巴管内皮细胞（human dermal lymphatic endothelial cells, hLECs），分别使用TNF-α、LPS及TGF-β1进行刺激，检测靶基因表达水平。所有动物实验方案经上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准。
三、研究结果
1. PLVL在BDL诱导的PHT模型中加重门静脉高压并损伤肝功能
通过术后28天血流动力学监测及血清学指标检测，研究人员发现PLVL可显著升高BDL大鼠的门静脉压力，并显著增加血清丙氨酸转氨酶（alanine transaminase, ALT）及天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase, AST）水平，而对总胆红素（total bilirubin, TBIL）水平无显著影响。PLVL单独应用并未使门静脉压力超过正常水平，但在BDL基础上显著加剧了肝硬化与PHT的关键表型。
2. PLVL在BDL诱导的PHT模型中加重肝纤维化与炎症反应
采用H&E、Masson三色及天狼星红染色并进行形态计量学分析，结果显示PLVL虽未单独诱导肝纤维化，但在BDL大鼠中显著扩大肝纤维化面积，并上调肝组织Acta2与Col1a1的mRNA表达。炎症因子检测表明，PLVL进一步显著上调促炎因子Il6与Tnf的表达，并下调抗炎因子Il10，而Vegfc虽呈上调趋势但未达统计学显著。
3. PLVL在BDL诱导的PHT模型中促进肝内巨噬细胞浸润、胆管反应及淋巴管生成
通过CD68免疫荧光染色观察，BDL+PLVL组肝内中央静脉周围巨噬细胞浸润最为显著；同时，远端门静脉淋巴结内巨噬细胞数量较BDL组减少，提示PLVL可能通过阻碍巨噬细胞流出而加重肝内浸润。CK19与LYVE-1免疫荧光显示，PLVL在BDL基础上显著增强胆管反应（ductular reaction）及肝内淋巴管生成。
4. 转录组分析揭示PLVL加重BDL诱导PHT的潜在机制
对四组大鼠全肝样本进行bulk RNA-seq分析，在BDL versus Sham及BDL+PLVL versus BDL比较中分别鉴定出1967个和1069个上调的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），其中490个为核心共享DEGs。经SignalP数据库筛选，获得99个推定性分泌蛋白编码基因。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析显示，核心DEGs显著富集于纤维化、炎症及血管生成相关通路，包括细胞外基质（extracellular matrix, ECM）-受体相互作用、局灶黏附、TGF-β信号、白细胞跨内皮迁移、中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap, NET）形成及NF-kappa B信号通路；同时发现肾素-血管紧张素系统激活及血管平滑肌收缩相关活动。GSEA（gene set enrichment analysis）进一步揭示，BDL+PLVL与BDL比较中存在多条脂质代谢通路协同下调，提示肝淋巴引流与肝脏代谢功能之间存在潜在联系。
5. 鉴定PLVL后肝硬化肝脏中与内皮相关的转录变化
研究人员整合临床单细胞RNA-seq数据（GSE136103），对非实质细胞（non-parenchymal cells, NPCs）进行t-SNE（t-distributed stochastic neighbor embedding）降维分析，鉴定出21个细胞群，并依据PECAM1、PDPN、OIT3、ACKR1及HEY1等标记物区分出内皮细胞（endothelial cells, ECs）各亚群，包括LEC、LSECs及动静脉内皮细胞。将185个内皮富集基因与490个核心DEGs取交集，获得17个重叠基因。全肝转录组验证显示，这些内皮相关候选基因在BDL及PLVL干预后均显著上调，且其表达在单细胞数据中相对富集于内皮细胞群体。
6. 探讨LEC在肝脏病理发生中的意义
通过整合两个小鼠LEC富集数据集（GSE255346与GSE276093），并与前期内皮特异性基因及490个核心DEGs进行交叉比对，研究人员鉴定出13个在肝病理状态下LEC特异性上调的基因。全肝转录组分析显示，MGP（matrix gla protein）与CD63在BDL versus Sham及BDL+PLVL versus BDL比较中均显著上调。利用STRING网络分析7个推定性分泌基因的潜在下游靶标及受体，发现CD63与Tnfrsf1a在多种NPC亚群中均有表达，其中CD63在BDL及PLVL干预后呈选择性上调，而Nrp1和Plxna2主要在内皮细胞群表达，Notch2和Ptprc则优先富集于免疫细胞群，提示LEC可能通过分泌因子与其他肝脏细胞尤其是免疫细胞发生串话。
7. 体外验证TNF-α可上调LEC中多个靶基因
在hLECs体外培养体系中，研究人员分别给予TNF-α、LPS及TGF-β1干预。结果显示，TNF-α可显著上调SEMA3A、PPIC、MDK、LGALS3、FABP4、HSPG2及AEBP1等多个靶基因的mRNA表达水平；LPS仅显著增加HSPG2表达；TGF-β1对上述基因表达无明显调控作用。该结果提示肝内LEC与免疫调节密切相关，且TNF-α在其中发挥核心调控作用。
四、讨论与结论
本研究的讨论部分指出，PLVL在Sham与BDL大鼠中的差异反应提示，肝淋巴阻塞在生理状态下可能获得较好代偿，但在肝硬化PHT中则产生显著不良后果，这与BDL诱导的胆汁酸代谢及清除紊乱所致代偿能力受损有关。肝淋巴淤积可阻碍Disse间隙淋巴液的清除，导致潜在静水压升高并向肝窦传递，直接增加IHVR并加重LSEC功能障碍，这一推论与本研究观察到的门管区淋巴管显著扩张及数量增多的组织学改变相符。
转录组分析表明，ECM、脂质代谢、免疫、炎症及血管生成与肝硬化PHT中的淋巴阻塞密切相关。研究鉴定出的内皮来源因子，尤其是LEC来源分泌蛋白，可能介导PLVL诱导的PHT恶化。例如，CD63作为血小板活化标志物在门静脉血栓（portal vein thrombosis, PVT）患者中显著升高；LGALS3编码的半乳糖凝集素-3（galectin-3）在多项肿瘤研究中促进血管生成，其抑制剂belapectin在MASH患者中可降低肝静脉压力梯度（hepatic venous pressure gradient, HVPG）；AEBP1则是肝脏及心脏器官纤维化的关键调节因子。此外，GSEA分析显示semaphoring-plexin信号通路在肝硬化肝脏中富集，且Sema3a在LEC中显著上调，该分子可诱导LSECs去窗孔化，直接参与IHVR升高的病理过程。LEC中FABP4的上调则可能通过LSECs与HSCs（hepatic stellate cells）的串话参与肝纤维化。体外实验进一步证实，内源性促炎因子TNF-α是诱导LEC分泌谱改变的关键驱动因素，可能通过重塑LEC与免疫细胞的交互影响肝脏炎症微环境。
在研究结论方面，研究人员发现受损的肝淋巴引流显著加重了BDL诱导的肝硬化大鼠的肝损伤、纤维化及门静脉高压。伴随淋巴引流受损，肝内出现炎症与促纤维化反应增强，并伴随肝淋巴管内皮细胞表型的改变。转录组分析进一步鉴定出LEC相关信号传导及分泌因子的变化，这些因素可能参与并促进门静脉高压的进展。上述发现为肝淋巴功能障碍与肝硬化门静脉高压之间的关联提供了证据，但其深层机制及潜在治疗意义仍有待后续深入研究。
