全球公共奶酪微生物组标准化再分析揭示广泛细菌类群与地理群落结构

《International Journal of Molecular Sciences》：Global Analysis of Public Cheese Microbiomes Reveals Widespread Bacterial Taxa and Geographic Community Structure

　　

奶酪微生物组（cheese microbiome）因公共测序数据集（public sequencing datasets）高度碎片化且方法学异质性而难以实现全球比较。本研究中，研究人员从233个BioProjects中系统整理了14,203条测序记录，并保留来自112个BioProjects的8,910条记录用于标准化再分析（standardized reanalysis），为奶酪微生物组研究建立了全球比较框架。三种分类学分析流程（taxonomic profiling pipelines）（QIIME2、Kraken2和mOTUs）在属（genus）水平上回收到广泛一致的模式，且以乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）为主导，尽管不同方法与研究集合之间的定量一致性（quantitative concordance）存在差异。全基因组鸟枪法测序（whole-genome shotgun, WGS）分析鉴定出12种广泛分布的细菌物种，这些物种在Kraken2和mOTUs两种流程中均被独立检测到存在于至少50%的BioProjects中，其中乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和乳脂乳球菌（Lactococcus cremoris）在两种分析中均出现于至少84%的BioProjects。在考虑优势群落组成后，地理结构（geographic structure）仍然明显：样品来源国（sample-origin country）在主要分析中解释了36.6%的群落变异（community variation），并在平衡子采样（balanced subsampling）以及去除或连续调整五个优势乳酸菌属（five dominant lactic acid bacterial genera）的分析中与群落组成保持关联。然而，公共数据集存在严重的地理不平衡，欧洲BioProjects在现有集合中占据主导地位。综合而言，这些结果确立了一个可重复的框架和比较基线，用于在全球分布的公共测序数据集中研究奶酪微生物组多样性、地理结构及跨研究模式（cross-study patterns）。

**研究背景与意义**

奶酪是人类最古老的发酵食品之一，代表一个生态上复杂且高度选择性的微生物生态系统。乳制品发酵将极易腐坏的牛乳转化为稳定、营养密集的产品，其生化转化由细菌、酵母和丝状真菌的复杂演替所驱动，决定着酸化、蛋白水解、脂解及关键挥发性化合物的合成。传统乳酸菌属（Lactococcus、Streptococcus、Lactobacillus、Lacticaseibacillus和Leuconostoc）作为初级发酵剂发挥作用，而来自生乳、生产环境和成熟设施的次级微生物群则驱动成熟奶酪感官特征的多样化。在制造与成熟过程中，这些定殖群落反复暴露于快速产酸导致的低pH、高盐带来的高渗透压、水分流失及强烈的微生物竞争等严酷的理化胁迫，因此奶酪微生物组体现了确定性环境过滤施加的生态收敛与本地生物、技术和地理因素驱动的多样化之间的微妙平衡。

过去十年，高通量测序（high-throughput sequencing）通过实现免培养（cultivation-independent）的群落表征，革新了乳制品微生物学。然而，尽管单个奶酪生态系统的描述迅速推进，奶酪微生物组数据仍高度碎片化：测序数据集经由针对特定奶酪品种或区域的独立局部研究积累，分散于不同公共存储库，注释标准高度异质；原材料、DNA提取方案（DNA extraction protocols）、PCR引物、测序平台（Illumina占90.3%）和分类学分析流程（taxonomic profiling pipelines）的差异引入了大量技术噪声，使区分真实可重复的生物学信号与技术伪影成为关键障碍，严重阻碍了食品宏基因组学（food metagenomics）的工业、监管与转化应用。

**研究人员开展的研究**

为突破上述局限并将食品宏基因组学从局部描述性研究推进至预测性科学，研究人员系统检索了美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）序列读取存档（Sequence Read Archive, SRA），于2026年2月7日获得来自233个BioProjects的14,203条奶酪相关原始测序记录。经过严格的质量控制与BioProject级筛选，研究人员保留了来自112个独立BioProjects的8,910条高质量记录（涵盖扩增子测序（amplicon sequencing）与全基因组鸟枪法测序（whole-genome shotgun sequencing, WGS）），进行标准化再分析。研究设定四个目标：鉴定可在异质性公共数据集中识别的重复性细菌类群并在物种水平分辨率上验证；评估微生物群落组成是否与BioSample报告的样品来源国（sample-origin country）相关联；评估分类模式在不同分析方法间的一致性；表征公共奶酪微生物组测序数据的地理代表性、元数据完整性与分析局限性。这些分析共同建立了首个全面的全球奶酪微生物组比较参考框架，其重要意义在于将生物模式与方法和研究层面的变异更清晰地加以区分。

**主要技术方法**

研究人员以2026年2月7日检索的NCBI SRA公共奶酪相关宏基因组数据集作为样本队列，通过运行级过滤与BioProject级筛选（含29个人工审核项目）整理数据。扩增子数据集采用QIIME2 2026.1流程，以DADA2（v1.30.0）对16S rRNA序列进行去噪，并采用SILVA 138 99%朴素贝叶斯分类器（Naive Bayes classifier）进行属级分类。WGS数据集分别采用Kraken2（v2.1.2，基于2024年9月构建的本地核苷酸参考数据库，k=35、l=31）和mOTUs（v4.0.4，基于标记基因（marker genes））进行独立分析。统计分析基于R（v4.5.2）与Python（v3.14）完成，以BioProject为独立分析单元，应用Hellinger转换（Hellinger transformation）、Bray-Curtis不相似性（Bray-Curtis dissimilarity）、置换多元方差分析（PERMANOVA，999次置换）及多元离散度检验（PERMDISP）评估群落结构与地理关联，并采用Spearman等级相关（Spearman rank correlation）和k-means聚类评估跨流程一致性与群落组成类型（composition types）。

**研究结果**

*公共奶酪微生物组存储库仍然地理不平衡*：研究人员通过NCBI SRA综合检索获得14,203条测序记录（233个BioProjects），保留8,910条记录（112个BioProjects，占原始记录的62.7%及已识别BioProjects的48.1%），其中扩增子记录8,100条（92个BioProjects）、WGS记录810条（21个BioProjects）。地理可解析数据集包含来自21个国家的7,592条记录（89个BioProjects）。地理覆盖严重不均，欧洲国家贡献了大部分数据集，且扩增子BioProjects（中位24条记录）大于WGS BioProjects（中位16条记录），两项最大的扩增子研究即贡献4,588条记录。

*异质性公共数据集出现了保守的奶酪微生物群*：尽管研究规模、沉积年份、测序技术与数据集组成存在显著异质性（超过一半记录来自仅两个BioProjects，25个最大项目贡献超过80%的数据集，2024年达峰值5,363条记录，Illumina占90.3%），三种分析流程均回收到以Lactococcus、Streptococcus、Lactobacillus、Lacticaseibacillus、Leuconostoc和Staphylococcus为主的优势菌属模式。表面成熟奶酪相关属（Brevibacterium、Corynebacterium、Brachybacterium、Psychrobacter）检出率较低。对相同19个WGS BioProjects的分析显示，Kraken2与mOTUs一致性最强（流行率ρ=0.513，平均相对丰度ρ=0.654），而QIIME2与两者的相关性较弱（ρ=0.361/0.482与ρ=0.258/0.417）。

*地理变异超越了发酵剂群落组成*：主要PERMANOVA显示国家与群落组成显著相关（R²=0.366，pseudo-F=1.608，p=0.001），但多元离散度检验亦显著（PERMDISP F=4.484，p=0.001）。限制为至少2个BioProjects的国家后关联仍显著（R²=0.284）；1000次平衡子采样（每国随机选取3个BioProjects）中99.4%的迭代PERMANOVA p≤0.05，而无一PERMDISP显著。对五个优势属的k-means分组（k=2至10，k=5非唯一最优）形成描述性组成类型，国家关联在去除（R²=0.358）或连续调整（R²=0.306）这五个属后依然存在。

*广泛分布的奶酪相关类群延伸到物种水平分辨率*：在两种WGS流程共同检出的448个物种中，12个满足广泛分布标准（两流程中BioProject流行率均≥50%且平均相对丰度≥0.01%）。L. lactis、S. thermophilus和L. cremoris在两种分析中均见于≥84%的BioProjects；12个中的11个在所有留一BioProject-out分析中保持分类。过滤后103个共享物种的平均相对丰度呈中度相关（ρ=0.534，p=6.36×10^?9）。

**讨论与结论**

讨论部分指出，公共奶酪微生物组呈现两个互补特征：跨异质性研究共享的重复性细菌成分，以及扩展至五个优势发酵相关属之外的国家关联群落变异。奶酪制造中的理化胁迫（快速产酸导致的低pH、干盐或盐水浸泡的高渗透压、水分流失、营养限制和强烈的微生物竞争）有利于适应乳制品发酵的微生物，为Lactococcus、Streptococcus、Lactobacillus、Lacticaseibacillus和Leuconostoc的反复回收提供了合理的生态选择机制；而世代以来的人类管理历史，如回接（back-slopping，用上一批成功发酵的部分接种新批次）和商业发酵剂（commercial starter cultures）的反复引入与选择，为观察到的优势发酵相关属差异提供了生物背景。12个广泛分布物种及其留一项目稳定性增强了其在集合内重复性的证据，而不完全一致的定量一致性符合参考覆盖度（reference coverage）和分析程序对丰度估计的影响，且即使高级分类水平高度一致，菌株水平及种内多样性仍可能相当大。

研究同时承认局限：地理可解析集合中欧洲研究占主导，平衡子采样无法弥补缺失的地区或奶酪系统；不完整元数据阻碍了对奶酪类型、奶处理、发酵剂使用、成熟和储存的一致调整，地理关联可能包含相关的生产与研究所层面效应；标准化再处理无法消除DNA提取、测序平台或扩增子区域的差异；细菌聚焦使真菌成分脱离主要分析；广泛分布物种成员身份取决于检测和流行率阈值。研究结论为："总体而言，本研究鉴定出一组稳定的广泛分布细菌物种，并证明国家关联的群落变异在五个优势发酵相关属的差异之外持续存在。重复性类群与分化的群落谱系共存，为所考察的公共研究中的奶酪相关微生物多样性提供了连贯的图景。通过标准化再分析回收这些模式并检验其对分析选择和研究代表性的敏感性，这项工作为研究共有发酵生态如何与奶酪生产系统的多样性相互作用奠定了比较基础。"