《Biomolecules》：Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for Betulinic Acid Biosynthesis Reveals Pitfalls of Mitochondrial Compartmentalization of the Mevalonate Pathway
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桦木酸是一种具有多种药理活性的高价值后鲨烯三萜类化合物，微生物生物合成为其生产提供了替代途径。甲羟戊酸途径的线粒体区室化已被广泛用于提升鲨烯供应，但其对后鲨烯三萜类化合物生物合成的影响仍缺乏系统表征。本研究通过组合策略系统改造了酿酒酵母以实现高效的桦木酸生产，
桦木酸是一种具有多种药理活性的高价值后鲨烯三萜类化合物，微生物生物合成为其生产提供了替代途径。甲羟戊酸途径的线粒体区室化已被广泛用于提升鲨烯供应，但其对后鲨烯三萜类化合物生物合成的影响仍缺乏系统表征。本研究通过组合策略系统改造了酿酒酵母以实现高效的桦木酸生产，这些策略包括酶筛选、蛋白质-肽相互作用介导的多酶组装、线粒体甲羟戊酸途径工程以及细胞色素P450/细胞色素P450还原酶模块的优化。研究人员首先鉴定出源自迷迭香的RoCYP01/RoCPR配对是进行连续C28氧化的更优催化剂，其性能优于BPLO/LjCPR配对。一种基于蛋白质-肽的组装策略涉及油橄榄羽扇醇合酶和RoCYP01，进一步将桦木酸产量提升了27%。引人注目的是，线粒体中重建甲羟戊酸途径显著增加了鲨烯积累，却导致后鲨烯三萜类化合物的产量急剧下降。转录组谱分析鉴定出与蛋白质折叠和辅助电子传递相关的基因表达发生变化，表明内质网相关过程可能受到干扰。缓解2,3-氧化鲨烯限制和工程化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸代谢未能有效恢复桦木酸的生物合成。在移除线粒体甲羟戊酸模块并优化桦木酸合成模块拷贝数后，工程菌株C7P在摇瓶中产生了102.26 ± 8.99 mg/L的桦木酸。其营养缺陷型标记互补衍生物C8P在5 L补料分批生物反应器中达到了323 mg/L的桦木酸和946 mg/L的白桦脂醇。总之，本研究建立了一株改进桦木酸产量的工程酵母菌株，并表明靶向线粒体的甲羟戊酸工程并未改善桦木酸产量，尽管它增加了鲨烯积累。这些发现强调了评估靶向线粒体的前体工程的重要性。
研究背景与问题
桦木酸是一种具有抗癌、抗HIV、抗炎和抗疟等多种药理活性的高价值五环三萜类化合物，天然存在于白桦树皮等植物中。传统获取方式依赖植物提取或半合成，面临成本高昂、资源季节性限制及生态问题。因此，利用微生物细胞工厂特别是酿酒酵母进行桦木酸的从头生物合成成为可持续的替代方案。在酵母中，桦木酸的生物合成始于甲羟戊酸途径，经2,3-氧化鲨烯环化生成羽扇醇，再由植物来源的细胞色素P450-还原酶对催化三步连续的C28氧化反应生成桦木酸。早期研究虽已实现异源生产，但仍存在酶氧化不完全、中间产物大量积累等问题。此外，尽管线粒体甲羟戊酸途径区室化被广泛用于提升鲨烯供应以增强单萜和异戊二烯产量，但其对需要跨细胞器转运的后鲨烯三萜类化合物如桦木酸生物合成的影响尚不明确。线粒体内生成的异戊烯基焦磷酸需高效外排至胞质，而中间产物的积累可能带来细胞毒性，且下游P450酶通常定位于内质网膜，其功能可能受线粒体工程引发的全局性代谢扰动影响。因此，系统评估并优化桦木酸合成途径中的关键催化模块，并探究线粒体区室化策略的适用性，对于推动三萜类化合物的微生物高效合成具有重要意义。
研究方法与技术路线
研究人员采用组合代谢工程策略对酿酒酵母进行系统性改造。关键技术方法包括：比较两种植物来源的C28氧化酶系统（BPLO/LjCPR与RoCYP01/RoCPR）的催化效率；利用AlphaFold 3预测蛋白质结构，并基于PDZ结构域与其配体（PDZlig）的高亲和力相互作用构建OeLUP-RoCYP01多酶复合物；通过融合线粒体定位序列（MLS）将完整的MVA途径靶向表达于酵母线粒体；应用转录组测序分析线粒体工程引起的全局基因表达变化；采用CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑，包括N端降解决定子介导的ERG7下调及异源羊毛甾醇合酶替换；最终通过5 L补料分批生物反应器进行放大发酵验证。
研究结果
3.1 高活性桦木酸生物合成酶的筛选
通过比较BPLO/LjCPR与RoCYP01/RoCPR两种酶组合在酿酒酵母中的表现，发现RoCYP01/RoCPR组合的桦木酸产量达到3.74 mg/L，是BPLO/LjCPR组合的6.8倍，且桦木酸占白桦脂醇与桦木酸总和的77.8%，证明其具有更高的连续氧化活性。
3.2 通过酶复合物提升桦木酸生物合成
利用PDZ-PDZlig相互作用构建OeLUP-RoCYP01多酶复合物，使羽扇醇、白桦脂醇和桦木酸产量分别提高34%、14%和27%，其中桦木酸产量达到14.00 mg/L，表明空间组装策略有效增强了底物流向。
3.3 线粒体靶向表达完整MVA途径的关键瓶颈识别
在线粒体中表达完整MVA途径后，菌株C3M4P的鲨烯积累显著增加，但羽扇醇、白桦脂醇和桦木酸产量急剧下降。转录组分析显示，线粒体工程引发了广泛的代谢重编程，包括戊糖磷酸途径、氧化磷酸化和过氧化物酶体相关基因上调，同时内质网辅助电子传递组分CYB5和分子伴侣相关基因JJJ2下调，暗示内质网稳态和P450催化功能受损。
3.4 NADPH代谢工程与ERG7修饰对三萜类化合物产量的影响
通过过表达ZWF1、GND1、TKL1、TAL1并删除GDH1/GDH2来改造NADPH代谢，未能恢复桦木酸产量。进一步采用N端降解决定子下调ERG7或用塔拉霉羊毛甾醇合酶替换内源ERG7，成功恢复了2,3-氧化鲨烯池并部分提高了羽扇醇和白桦脂醇产量，但桦木酸产量仍未有效恢复，表明存在更深层次的限制因素。
3.5 高产桦木酸酵母菌株C7P的构建
鉴于线粒体MVA途径的不良效应无法完全消除，研究人员删除了该模块，并逐步优化胞质途径。通过增加RoCYP01-PDZ/RoCPR的表达拷贝数至三个，获得菌株C7P，在摇瓶培养中桦木酸产量达到102.26 mg/L。其营养缺陷型标记互补菌株C8P在5 L补料分批生物反应器中进一步达到323 mg/L桦木酸和946 mg/L白桦脂醇。
讨论与结论
研究表明，RoCYP01/RoCPR是更优的C28氧化系统，PDZ-PDZlig介导的多酶组装可有效提升代谢流，但无法完全同步级联反应速率。线粒体MVA途径区室化虽能大幅提升鲨烯供应，却因引发全局性代谢重编程和内质网应激，严重抑制了后鲨烯三萜类化合物的合成，即使缓解ERG7介导的抑制也无法恢复桦木酸产量，最终只有彻底删除该模块才能恢复生产。这揭示了线粒体前体工程并非对所有萜类途径普遍有益，尤其当下游反应依赖于胞质-内质网区室时。补料分批发酵中白桦脂醇的大量积累表明，从白桦脂醇到桦木酸的氧化转化仍是持续存在的限速步骤。
研究结论
本研究报道了通过系统性代谢工程改造酿酒酵母以提升桦木酸从头生物合成的工作。研究人员首先比较了两种植物来源的C28氧化系统，确定RoCYP01/RoCPR为更优催化配对，初始桦木酸产量为3.74 mg/L。通过基因组整合桦木酸合成模块和关键酶过表达获得菌株C1，桦木酸产量达11.02 mg/L。基于PDZ/PDZlig的多酶复合物使产量在此基础上再提高27%。进一步优化胞质前体途径获得菌株C3P，产量达15.33 mg/L。虽然线粒体区室化完整MVA途径成功促进了鲨烯积累，但触发了全局性代谢重编程并严重损害后鲨烯代谢流。缓解ERG7介导的抑制效应部分恢复了2,3-氧化鲨烯供应，但未能恢复最终桦木酸产量。在删除线粒体MVA途径、增强2,3-氧化鲨烯供应、修饰戊糖磷酸途径和半乳糖代谢并进行进一步的胞质代谢优化后，菌株C5P的桦木酸产量达38.30 mg/L。增加RoCYP01-PDZ/RoCPR基因拷贝数后，工程菌株C7P在摇瓶培养中实现了102.26 mg/L的桦木酸产量。随后在5 L生物反应器中对标记互补菌株C8P进行的补料分批发酵进一步获得了323 mg/L桦木酸，同时伴有大量白桦脂醇积累，表明即使在高效价条件下，从白桦脂醇到桦木酸的氧化转化仍然是持续的瓶颈。这些发现表明，针对萜类生物合成的亚细胞区室工程应仔细评估潜在的跨细胞器生理扰动。未来的工作需结合RoCYP01的蛋白质工程、宿主内质网微环境优化以及精细的发酵控制，以进一步提高桦木酸比例并实现具成本竞争力的微生物生产。
