《Biomolecules》：Characterization of a Specialized Venomous Spine System and Identification of a Cytolytic Toxin, Cytolytic Toxin-Alpha-like (CTα-L/BGT-1), in the Bagrid Catfish Leiocassis longirostris
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毒棘是鱼类中广泛存在的防御结构，然而许多鲶鱼类毒棘系统的解剖结构、分子组成及细胞基础仍未得到充分表征。本研究整合形态学、蛋白质组学、荧光原位杂交（FISH）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、序列比较及体内穿刺实验，对长吻鮠（L. long
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毒棘是鱼类中广泛存在的防御结构，然而许多鲶鱼类毒棘系统的解剖结构、分子组成及细胞基础仍未得到充分表征。本研究整合形态学、蛋白质组学、荧光原位杂交（FISH）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、序列比较及体内穿刺实验，对长吻鮠（L. longirostris）的毒棘进行了系统研究。组织学分析揭示了由纵向沟槽、表皮腺体、基底层及内部管道构成的棘刺结构。数据非依赖采集质谱（DIA-MS）鉴定出一个棘刺富集的毒素库，其中CTα-L占毒素总丰度的95.34%，并位列棘刺组织高丰度蛋白前列。基于其序列特征及其与鲿科鱼类CTα-L同源物的密切亲缘关系，研究人员将该蛋白命名为鲿科毒素-1（BGT-1）。空间与单细胞分析将CTα-L家族转录本定位于腺体及基底层区域，并在多种特化细胞群体中富集，包括增殖中的内皮细胞、未成熟上皮祖细胞及连接处血管平滑肌细胞。序列与结构比较显示，BGT-1保留了鱼类溶细胞毒素的保守特征，同时展现出包含SNTX样、石狗公毒素相关、硫氧还蛋白样、纤连蛋白III型（FNIII）及串联半乳糖凝集素结构域的多结构域独特架构。结构建模进一步在保守的毒素相关核心内鉴定出预测的成孔兼容结构，为BGT-1介导的细胞溶解提供了推定工作模型的基础。最后，活性棘刺穿刺在体内引起快速出血、水肿、肌纤维损伤、炎症浸润及TUNEL阳性细胞增加，而热灭活棘刺产生的组织损伤则显著较轻。综上，这些发现将特化解剖结构、主要毒素相关蛋白、其细胞定位、分子架构及体内活性在该毒液系统中联系起来，为跨鲶鱼类毒液比较研究提供了框架。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
毒液系统是水生生物在持续捕食压力下演化出的重要防御适应结构，其将特化的解剖结构与生物活性分子整合，能够快速改变相互作用生物的生理状态。在鱼类中，毒液已在远缘谱系中多次独立演化，目前估计近3000种鱼类拥有毒液相关结构。与蛇类等陆生毒液动物已被充分表征的毒液系统不同，许多鱼类毒液系统在解剖、分子及细胞水平上仍未完全解析。鲶形目（Siluriformes）鱼类是理解鱼类毒液系统演化与组织的重要类群，许多鲶鱼拥有与毒腺解剖学关联的显著背鳍和胸鳍棘刺。已有研究确立了毒腺和毒素的存在及多样性，但棘刺相关结构与产毒区室之间的空间关系仍未完全阐明；同样，尽管转录组和蛋白质组方法扩展了候选鱼类毒素的目录，但单个毒素基因在特定细胞群体中的表达及其在棘刺相关组织微环境中的组织方式仍知之甚少。这一空白对于溶细胞毒素尤为突出——该类毒素是鱼类毒液的重要组分，但在不同演化谱系间其序列、结构域组织及生物活性可能存在显著差异。长吻鮠（Leiocassis longirostris）是鲿科（Bagridae）的代表性成员，也是分布于东亚的具有生态和经济重要性淡水鱼类，尽管该物种已有基因组资源，但其毒棘系统在分子和细胞水平上仍缺乏表征。因此，研究人员开展了这项多尺度整合研究，旨在定义长吻鮠毒棘系统的分子与细胞架构，鉴定其主要毒素组分，并为其防御机制提供功能框架。
二、主要关键技术方法
研究人员整合了多种技术手段开展研究。动物样本来源于四川省农业科学院水产研究所实验养殖设施中饲养的长吻鮠幼鱼（体长5–6 cm），样本采集经四川农业科学院和四川农业大学动物护理与使用委员会批准。主要方法包括：骨骼透明与染色用于观察棘刺骨骼架构；组织学染色（H&E、Safranin O–Fast Green、AB-PAS）用于解析棘刺组织学结构；数据非依赖采集质谱（DIA-MS）用于棘刺组织、皮肤黏液及肠道的蛋白质组学分析；全长克隆获得毒素基因编码序列；信号放大与多轮成像荧光原位杂交（SweAMI FISH）用于毒素转录本的空间定位；DNBelab C TaiM4 V3.0平台单细胞RNA测序（scRNA-seq）用于解析细胞群体组成及毒素表达模式；小鼠穿刺模型结合组织病理学评估和TUNEL染色用于体内活性验证；系统发育分析、结构域注释及AlphaFold 3结构预测用于比较与结构分析。
三、研究结果
3.1 特化的棘刺–腺体架构表征了长吻鮠的毒液器官
形态学与组织学分析显示，长吻鮠的背鳍和胸鳍棘刺呈尖锐锥形，后缘具锯齿，表面存在从近端腺体组织延伸至远端棘尖的显著纵向沟槽。棘尖曲率介于0.45 mm皮下注射针头与手绣针之间，具备高效组织穿透的形态基础。脱钙切片染色显示棘刺内含中央管道（CC）、中央管道近端开口（PO）、内侧孔（MF）及多个与关节和棘锁定相关的髁突结构。棘刺被含上皮细胞、黏液细胞和警报细胞的表皮层包裹，表皮内分布管状腺体结构，由外层柱状上皮细胞和内层内皮细胞构成。纵向切片显示这些管状结构延伸至表皮与下方棘刺之间的基底层（BM）。AB-PAS染色进一步揭示了棘刺周围异质性分泌区室。基底层主要由内皮细胞和黑色素细胞组成，部分区域向哈弗斯管（HC）延伸。中央管和哈弗斯管内观察到神经纤维、结缔组织及含红细胞和白细胞的血管成分。这些观察揭示了沟槽棘刺、表皮腺体结构、基底层和内部管道系统之间的紧密解剖关联，定义了长吻鮠特化的棘刺相关组织架构。
3.2 活性棘刺体内刺伤诱导快速局部组织损伤
研究人员建立了小鼠穿刺模型，使用活性棘刺和热灭活棘刺进行对比。活性棘刺穿刺后30分钟内，小鼠表现出显著的局部病理变化，包括出血和水肿。组织学检查显示活性棘刺组肌纤维广泛破坏，胞质强嗜酸性、横纹消失、肌浆溶解呈无结构絮状或颗粒状物质，肌纤维肿胀、边界模糊，部分区域肌原纤维完全崩解。坏死肌纤维周围分布浸润细胞，提示急性炎症反应。间质中散在均质嗜酸性小体（红细胞），提示血管损伤和出血。相比之下，热灭活棘刺组病理变化显著较轻，肌纤维架构相对保留。组织病理学评分显示，热灭活和活性棘刺均显著增加浸润、出血和水肿，但两组间无显著差异；然而活性棘刺组的细胞死亡评分显著高于热灭活组。TUNEL染色进一步证实活性棘刺组TUNEL阳性细胞显著增加。这些结果表明活性棘刺暴露产生伴随细胞死亡的快速局部组织损伤，热灭活棘刺引起的病理变化显著较轻，快速出现的出血、水肿、坏死、炎症浸润及TUNEL阳性细胞增加与棘刺组织相关的热不稳定细胞毒性活性一致。
3.3 蛋白质组学分析鉴定CTα-L为棘刺中主要毒素相关蛋白
DIA-MS共鉴定出10184个非冗余蛋白。功能注释鉴定出一组推定毒素相关蛋白，约占蛋白质总丰度的1.53%，包括溶细胞毒素α样蛋白（CTα-L）、Ly-6/神经毒素样蛋白、三指毒素、蝎样肽Ev37、皮肤坏死毒素等。其中CTα-L占检测到的毒素蛋白丰度的95.34%，并在胸鳍棘刺提取物中位列前15高丰度蛋白第三位。比较分析显示，CTα-L/BGT-1在棘刺/鳍组织中的相对丰度显著高于皮肤黏液（p = 0.0162），在肠道中未检出。皮肤黏液的毒素组成与棘刺组织显著不同，但CTα-L仍是皮肤黏液中丰度最高的毒素相关蛋白。基于其高丰度及与鲿科溶细胞毒素的同源性，研究人员将长吻鮠CTα-L蛋白命名为鲿科毒素-1（BGT-1）。
3.4 空间与单细胞分析将CTα-L家族转录本定位于特化棘刺相关细胞群体
荧光原位杂交（FISH）使用靶向CTα-L家族的探针，在棘刺相关腺体的分泌小叶和基底层内检测到强且离散的信号，信号空间分布局限于腺体区域和基底区室，周围表皮和结缔组织中信号极少。单细胞RNA测序获得5591个高质量细胞，解析为18个转录组学上不同的簇，主要细胞群体包括上皮细胞、血管平滑肌细胞、T细胞、B细胞、内皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞和巨噬细胞。亚聚类进一步解析出富含细胞骨架的血管平滑肌细胞和未成熟上皮祖细胞等特化状态。将CTα-L家族转录本映射至单细胞图谱显示非均匀表达模式，在增殖内皮细胞、未成熟上皮祖细胞和连接处血管平滑肌细胞中富集。检测到的8个CTα-L相关unigene中，大多数在主要CTα-L相关群体中表现出相似表达模式，而unigene Llo-GLEAN-10002593在T细胞簇中呈优势表达，表明CTα-L相关转录本间存在异质性。
3.5 比较分析揭示BGT-1独特的模块化架构
系统发育分析将长吻鮠BGT-1序列置于鲶形目鱼类同源溶细胞毒素分支内，与鲿科鲶鱼黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）和瓦氏黄颡鱼（Tachysurus vachellii）的CTα-L序列关系密切，同时与石狗公毒素（verrucotoxin）α和β亚基同源。全长克隆获得2930 bp转录本，开放阅读框2913 bp，编码971个氨基酸的蛋白。结构域分析鉴定出保守的SNTX样毒素核心、石狗公毒素相关螺旋区、硫氧还蛋白样模块、纤连蛋白III型（FNIII）结构域及两个C端半乳糖苷结合凝集素（半乳糖凝集素）结构域。与南方鲶（Silurus meridionalis）CTα-L相比，BGT-1含有显著更长的SNTX样毒素核心区域；与石首鱼科溶细胞毒素verrucotoxin亚基β样（Vrtβ-L）和verrucotoxin α（Vrtα）相比，BGT-1中存在的FNIII和两个半乳糖凝集素结构域在verrucotoxin蛋白中缺失。结构比对显示，与预测膜相互作用特性相关的区域在BGT-1及其同源毒素间相对保守，而多个辅助区域表现出更大的序列和结构分歧。
3.6 结构建模支持BGT-1介导细胞溶解的推定机制
AlphaFold 3预测的BGT-1单体三维模型揭示了紧凑的多结构域架构，保守的毒素相关区域与周围辅助模块结构整合。预测结构将SNTX样毒素相关核心置于蛋白中心区域，FNIII和串联半乳糖凝集素结构域位于多结构域架构的外围位置。保守核心呈现β桶样构型，与膜孔形成结构相容。基于这些结构关系，研究人员提出了“锚定–定位–毒化”（anchor–localize–intoxicate）工作模型：辅助结构域可能首先识别并结合靶细胞表面特定糖蛋白或糖脂，将毒素富集于适当膜表面，随后由MACPF/CDC核心进行膜插入和孔形成，导致快速细胞溶解。
四、讨论总结与研究结论
讨论部分指出，该研究的核心发现是棘刺相关组织的显著解剖和分子特化。沟槽棘刺、表皮分泌腺小叶和下方血管化管道系统之间的紧密关联展示了一个高度整合的毒液递送装置，体现了毒液系统如何从预先存在的表皮腺体结构演化而来。蛋白质组数据显示棘刺组织含有与皮肤黏液显著不同的毒素富集蛋白库，表明毒素产生是受严格调控的组织特异性过程。BGT-1占毒素相关蛋白丰度超过95%，这种以单一强效毒素为主的精简组成与蛇类和节肢动物毒液中发现的更复杂混合物形成对比，可能反映了偏好效力和快速作用而非功能多样化的演化策略。结构解析揭示BGT-1在系统发育上聚类于鲶形目溶细胞毒素分支，但其包含FNIII和串联半乳糖凝集素辅助结构域的架构使其区别于石首鱼科verrucotoxin同源物，提示功能上的精细化超越了简单孔形成。单细胞转录组学和空间定位显示CTα-L家族转录本并非普遍表达，而是局限于特化分泌上皮细胞和基底层的增殖内皮细胞亚群，表明毒液产生是高度特化的细胞功能。体内刺伤模型证实，除驱动出血、水肿和浸润的机械组织损伤外，热不稳定的毒液介导成分还贡献了局部细胞毒性和凋亡。该研究将长吻鮠毒液从简单细胞毒性混合物重新定义为复杂的、细胞特化的、机械整合的系统，为跨动物界毒液策略的演化趋同和分歧研究开辟了新途径。
研究结论部分翻译如下：在本研究中，研究人员整合形态学、蛋白质组学、空间、单细胞、结构和体内分析来表征长吻鮠的毒棘系统。研究人员鉴定CTα-L为棘刺中主要的毒素相关蛋白，将其命名为鲿科毒素-1（BGT-1），并将CTα-L家族转录本定位于腺体和基底区室及特化细胞群体。结构建模揭示了具有保守成孔兼容核心的多结构域架构，活性棘刺在体内诱导快速局部组织损伤。然而，由于使用的是完整棘刺而非纯化或重组BGT-1，将细胞毒性直接归因于BGT-1仍需进一步验证；这些发现仍为鲶鱼毒液系统的比较研究提供了多尺度框架。
