黏液素悖论：解码嗜黏蛋白阿克曼菌在健康与疾病中的分子策略

《Molecules》：The Mucin Paradox: Decoding the Molecular Strategies of Akkermansia muciniphila in Health and Disease

　　

： 嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）是一种与肠道屏障完整性和宿主代谢健康相关的下一代益生菌。然而，其黏液素利用机制仍未完全阐明。特别是，酶部署的时间层级、单个黏液素降解酶（mucin-degrading enzymes, MDEs）的亚细胞及胞外囊泡定位、糖苷水解酶（glycoside hydrolases, GHs）对不同O-聚糖连接键的精细底物特异性，以及菌株依赖性黏液素分解能力的差异，均有待进一步解析。本综述整合基因组学、生物化学和代谢数据，阐明A. muciniphila的黏液素降解酶如何降解黏液，释放支持A. muciniphila生长和发酵（产乙酸和丙酸）的营养物质，并促进其他细菌（包括产丁酸菌）的交叉喂养（cross-feeding）。本综述同时强调A. muciniphila具有双重特性：在正常情况下，它可安全地刺激受调控的黏液素降解，改善屏障完整性，并为有益微生物提供营养。相反，在特定实验情境下（如膳食纤维缺乏或高糖小鼠模型），膳食纤维不足或代谢应激与黏液素降解增加、黏液层变薄以及炎症和病原体易感性增高相关。A. muciniphila对代谢性和炎症性疾病的益生效应可能涉及受调控的黏液素降解，但其益处也可能源于主动黏液素降解以外的机制，包括细菌表面蛋白和灭活（pasteurized）制剂。要充分挖掘该细菌的安全治疗潜力，需明确这些酶的空间、时间和菌株特异性细节。未来研究应结合多组学（multi-omics）和宿主互作研究，以阐明酶层级、囊泡递送及情境依赖性影响。

主体内容总结：

1. 1.
   引言

黏液素降解酶（MDEs）通过水解黏蛋白糖蛋白中的特定肽键或糖苷键，破坏完整大分子结构，释放寡糖或单糖片段、二肽和氨基酸。这些酶与宿主产生的抗菌肽共同调控致病菌，防止其过度生长。近年来，研究者对具有进化酶系统的微生物表现出浓厚兴趣，以探究其将黏液素作为主要营养来源的机制。A. muciniphila因其与宿主代谢和胃肠道健康的显著关联而备受关注，是少数编码糖苷水解酶以降解黏蛋白聚糖（如MUC2）的肠道共生菌之一。研究表明，A. muciniphila的定殖不仅依赖黏液素，还影响黏液稳态。该菌可显著增加结肠黏蛋白MUC2的表达，提示MDEs介导的黏液素降解可促进黏蛋白的周转与更新，从而维持黏液素专性菌所依赖的底物供应。这种同时进行黏液降解与保护的悖论，正是MDEs介导的宿主-微生物平衡互作的集中体现。尽管Akkermansia属内的黏液素降解已有充分文献记载，但阐明A. muciniphila菌株的底物特异性仍是理解该过程的关键步骤。

1. 2.
   A. muciniphila作为益生菌

A. muciniphila是人类胃肠道菌群的重要成员，通过支持黏膜屏障的丰富性和完整性促进健康。该菌黏附于黏液层中的黏蛋白，并将这些糖蛋白降解为聚糖单糖单元作为营养来源。体外肠道反应器实验已证明其能以黏液素为唯一碳源生长。除作为细菌增殖的碳源和氮源外，黏液素降解还产生关键代谢副产物——短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs），对维持肠道稳态和宿主代谢至关重要。黏液素发酵主要产生乙酸和丙酸，丁酸则通常由交叉喂养伙伴（如共培养中的Anaerostipes caccae）利用黏液素衍生糖或A. muciniphila发酵产物产生。A. muciniphila基因组编码54种糖苷水解酶和11种硫酸酯酶（sulfatases），协同分解黏蛋白中的O-聚糖。在黏液素存在时，糖苷水解酶和硫酸酯酶编码基因显著上调，而其他推定分泌蛋白基因在黏液素缺失时表达增加。靶向突变研究证实了细胞表面唾液酸酶（sialidases）和岩藻糖苷酶（fucosidases）在黏液素生长能力中的关键作用。蛋白质组分析强调了多种β-半乳糖苷酶对黏蛋白聚糖中特定连接键的亲和力。基因表达分析表明，其消化策略涉及将黏液素逐步降解为低分子量寡糖，进而释放可被分解代谢的单糖。值得注意的是，黏液素降解并非彻底的底物消耗，而是在受控的周转循环中运作，酶切刺激杯状细胞补充，从而维持内层黏液屏障的完整性。

1. 3.
   A. muciniphila作为产生MDEs的重要益生菌

A. muciniphila是一种正在接受广泛临床前和临床研究的新型益生菌候选菌株。其独特之处在于栖息于肠道黏液层并利用黏液素聚糖作为营养来源，在自然生境中产生黏液素降解酶。遗传突变分析已鉴定出对黏液素降解和稳定定殖至关重要的特定基因位点，建立了黏液素降解与其在黏液生境中生态适应性之间的关联。异源表达和生化分析发现了一种新型α-半乳糖苷酶，对黏液素衍生聚糖具有出乎意料的活性。同时进行的代谢组学和脂质组学分析显示，在高黏液素条件下，碳水化合物代谢途径、细胞膜脂质含量和能量相关代谢发生显著变化，表明代谢对黏液素可用性的同步响应。体外合成黏膜群落研究表明，A. muciniphila在降解黏液素的同时，与其他黏液相关微生物保持功能兼容性。人类结肠类器官组织培养研究显示，黏液素介导了与摄取、黏附及菌毛生物合成相关的基因诱导。虽然从生长培养基中去除黏液素显著改变了转录组、蛋白质组和代谢组，但增强了碳水化合物降解能力和胆汁酸抗性。高黏液素条件下培养的A. muciniphila保留了显著的益生特性。

1. 4.
   MDEs的类型与分类

MDEs是将黏液素聚糖降解为寡糖或其他小分子的酶。在人类肠道中，A. muciniphila是首个被鉴定具有黏液素降解活性的细菌。其在婴儿和健康成人中的丰度可达总细菌群的约1–3%。黏液素降解产生单糖、寡糖和/或氨基酸，这些产物间接影响其他肠道细菌，释放糖蛋白降解产物并最终控制炎症。最近的生化、蛋白质组和结构生物学研究揭示了黏液素降解依赖一个协调的酶库，其成员同时作用于黏蛋白分子的聚糖和蛋白质骨架。

4.1 A. muciniphila MDEs的外分泌样和内分泌样功能：一个提出的概念框架

本综述引入"外分泌样"（exocrine-like）和"内分泌样"（endocrine-like）术语作为提出的概念框架的一部分，而非既定的生化或酶学分类。只有第一类在严格意义上构成黏液素降解酶，即直接水解黏蛋白肽键或糖苷键，或从黏蛋白聚糖中去除硫酸盐和O-乙酰取代基的酶。第二类不描述独立的酶类，而是指黏液素衍生产物微生物发酵后下游的代谢物介导的宿主信号传导。

4.1.1 外分泌样（直接黏液素降解）活性（Exo-MDEs）

外分泌样黏液素降解酶直接作用于黏液层中的黏蛋白糖蛋白。这些MDEs是与细胞表面相关或分泌的微生物蛋白，靶向黏蛋白O-和N-聚糖内的特定键，促进黏液素降解为较小的寡糖并最终成为单糖。部分Exo-MDEs属于唾液酸酶、岩藻糖苷酶、β-半乳糖苷酶、己糖胺酶和硫酸酯酶等碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes, CAZymes），靶向末端结构和内部黏蛋白键。A. muciniphila中的关键酶包括靶向细菌细胞表面的糖苷水解酶、唾液酸酶（GH33）和岩藻糖苷酶（GH29和GH95）。例如，已鉴定出十种糖苷水解酶可去除黏蛋白O-聚糖上的唾液酸和岩藻糖帽，触发黏液素分解。分泌型β-半乳糖苷酶（Amuc_0771、Amuc_0824和Amuc_1666）可识别黏蛋白结构中丰富的特定半乳糖苷键，并能降解猪黏蛋白的聚糖部分。未来研究需明确这些酶的调控和排序机制，即Exo-MDEs活性的层级。

4.1.2 内分泌样（下游代谢物介导）效应

与直接酶活性相反，概念框架的第二层涉及黏液素分解的下游生理后果。内分泌样类别不定义为直接黏液素切割，也不构成独立的酶类。它指黏液素降解后发生的宿主信号传导。Exo-MDEs释放黏液素衍生糖后，这些糖被A. muciniphila和交叉喂养伙伴发酵，产生的代谢物（SCFAs等）作用于宿主受体和通路。这种代谢物介导的信号传导应与直接黏液素降解以及非黏液素降解酶蛋白（如外膜蛋白Amuc_1100和分泌型GLP-1诱导蛋白P9）的信号传导区分开来。黏液素降解产物可被代谢为乙酸、丙酸和丁酸等SCFAs，这些SCFAs通过G蛋白偶联受体和组蛋白去乙酰化酶抑制影响宿主基因表达和免疫调节通路，影响上皮健康和系统代谢。

4.2 胞外囊泡中的MDEs

A. muciniphila衍生的胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）已在先前研究中得到表征。蛋白质谱分析已用于确定EV相关蛋白。然而，EV制剂中蛋白质的存在不能视为其在囊泡中定位、酶活性或递送至生理底物的证据。酶通过囊泡运输可能将黏液素分解活性扩展到细菌表面之外，但这一假设需要实验验证酶的定位、催化活性保留以及囊泡对底物的降解。基因组分析表明A. muciniphila拥有编码MDEs的巨大基因组，包括糖苷水解酶、蛋白酶、硫酸酯酶和唾液酸酶。革兰氏阴性菌（包括A. muciniphila）释放外膜囊泡（outer-membrane vesicles, OMVs）。A. muciniphila的MDEs是否被选择性包装进这些囊泡尚未确定。如果得到证实，这将为将酶递送到细菌细胞表面之外提供潜在机制，从而促进黏液层内的局部黏液素重塑。表征MDEs可能包装进EVs对于理解A. muciniphila在黏液素周转中的生态作用至关重要。

4.3 MDEs的特征

在分解黏液素的过程中，A. muciniphila释放其他代谢物（称为聚糖），这些聚糖通常被其他微生物利用。这一过程提高了不同微生物途径间代谢交叉喂养的效率，同时促进稳定微生物组的建立。基因组研究证实了功能特化过程，A. muciniphila拥有相对较大的基因组，包含多个与黏液相关基因相关的转运蛋白。A. muciniphila是严格厌氧菌和人类优势肠道共生菌，已采用特化的代谢途径利用黏液素组分作为能量来源。负责黏液素降解的酶参与细菌分解代谢过程，以协调且大体上依次的方式作用，先切割O-聚糖，然后是糖和肽键，以获得单糖、寡糖和氨基酸作为细菌的能量来源。黏液素结构具有高度O-连接碳水化合物链修饰的蛋白质骨架，这些链可为特定肠道细菌提供重要的碳和能量来源。

1. 5.
   MDEs的作用机制

A. muciniphila定殖黏膜层的能力基于一组黏液素降解酶，根据催化的反应或靶向的底物修饰可分为五个功能类别：糖苷水解酶、蛋白酶、唾液酸酶、硫酸酯酶和乙酰酯酶。这些类别并非互斥的酶类。唾液酸酶（GH33）本身是糖苷水解酶，但因去除门控底层聚糖访问的独特末端残基而单独分类。对这些酶的深入分析揭示了高度协调、依次进行的作用机制，对营养获取和肠道屏障调节至关重要。

5.1 糖苷水解酶

糖苷水解酶被指定为骨架降解酶，是切割复杂O-聚糖链的主要酶。A. muciniphila的GHs具有精细特异性。GH33家族包含唾液酸酶，GH20和GH84家族参与核心链切割。最近研究表明，部分GHs可切割肠道黏蛋白（如MUC2）中主要存在的核心3 GlcNAcβ1-3GalNAc和核心6 GlcNAcβ1-6GalNAc O-聚糖。其作用模式包括内切机制（endo-acting），切割聚糖链内的糖苷键，释放较小的寡糖。这不同于外切糖苷酶（exo-glycosidases）从非还原端"啃食"聚糖链的模式。这种双重GHs活性类似于一条拆卸线，内切切割产生多种末端供外切糖苷酶作用，从而最大化从聚糖源中提取能量。

5.2 唾液酸酶

唾液酸（尤其是O-乙酰化类型）大量存在于黏蛋白聚糖结构的末端。A. muciniphila使用主要属于GH33家族的外切唾液酸酶，可特异性降解末端唾液酸，暴露底层聚糖。并非所有唾液酸酶都相同——有些可降解α2-3连接的唾液酸，另一些可降解α2-6连接的唾液酸。通过去除唾液酸，这些酶发挥门控作用，使底层聚糖结构可被其他GHs作用。酶促去除末端唾液酸应与消耗释放的糖相区分。在Shuoker等人的研究中，释放的唾液酸在测试条件下不促进A. muciniphila的生长，而是支持与其他肠道细菌的代谢互作（交叉喂养）。然而，唾液酸酶活性本身对黏液素生长至关重要，因为它暴露底层聚糖结构。

5.3 硫酸酯酶

硫酸酯酶作用于黏蛋白聚糖底物中的硫酸酯取代基。硫酸基团存在于黏蛋白O-聚糖的GlcNAc和GalNAc等残基上，其负电荷被认为增加黏液素粘度和抗微生物降解能力。硫酸酯酶水解这些硫酸酯键，释放无机硫酸盐并去除负电荷。A. muciniphila含有水解这些硫酸取代基的硫酸酯酶，以"外切硫酸酯酶"模式从聚糖非还原端去除硫酸基团。去除带负电荷的基团不仅是作用，更是前提条件——许多GHs无法在其活性位点容纳硫酸化基团。因此，从聚糖底物中去除硫酸取代基可暴露聚糖供后续GHs作用，这是黏液素层级降解的重要方面。

5.4 蛋白酶

虽然GHs负责聚糖降解，但蛋白酶是分解MUC2蛋白质骨架的主要酶。A. muciniphila利用多种具有不同特异性谱的蛋白酶。第一种蛋白酶切割MUC2的N端结构域，该结构域是二硫键介导聚合所必需的。这一初始切割事件对MUC2降解至关重要，它使大的网状MUC2多聚体分解为较小的可溶性单体。其他蛋白酶（最可能是丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶）随后将MUC2单体降解为更小的肽，最终成为氨基酸。这些特异性蛋白酶在芳香族氨基酸（Phe和Tyr）或极性氨基酸之后切割，从而将MUC2蛋白骨架完全降解为小肽和游离氨基酸。该组成员通过优雅的两步过程将骨架从聚糖上拆卸下来。

5.5 乙酰酯酶

最后一类酶是乙酰酯酶。它们作用于唾液酸的O-乙酰基团（称为O-乙酰酯酶）以及其他碳水化合物（如GalNAc）。该类酶的作用机制是水解将乙酰基团连接到碳水化合物的键，从而微调底物。其生物学重要性有两方面：与硫酸化一样，聚糖的O-乙酰取代可阻碍GHs活性。因此，去除相关底物O-乙酰基团是GHs作用于受影响碳水化合物链的必要前提。五个功能类别的存在并非巧合，与协调的多步骤方法一致。在常见提出的模型中，硫酸酯酶和乙酰酯酶去除硫酸盐和O-乙酰取代基，唾液酸酶去除末端唾液酸帽，进而允许糖苷水解酶切割暴露的聚糖链。这些活性的顺序可能取决于底物结构，尚未证明存在普遍适用的降解序列。同时或随后，蛋白水解酶解聚并降解新暴露或已降解的蛋白质骨架。这种多步骤协同方法针对MUC2和MUC5AC等"混杂"底物。Bakshani等人证明该酶库可将实验检测的特定O-聚糖完全降解，但这不应理解为完整高分子量黏蛋白聚合物的完全降解——后者尚未得到证明。

1. 6.
   平衡A. muciniphila作为益生菌的利弊

A. muciniphila被视为有前景的益生菌。黏液素是其少数碳源之一，同时作为上皮细胞的保护屏障。生化研究表明该肠道共生菌分泌可影响宿主菌群和健康的黏液素降解酶。在超重和肥胖伴胰岛素抵抗志愿者的探索性随机安慰剂对照研究中，三个月A. muciniphila补充安全且耐受良好，灭活制剂改善了胰岛素敏感性并降低了胰岛素血症和血浆总胆固醇。在饮食诱导肥胖小鼠中，活菌或灭活A. muciniphila及外膜蛋白Amuc_1100改善了代谢参数并减少了脂肪量和炎症标志物。动物模型研究表明，适当剂量给药可增强紧密连接蛋白表达、增加黏液厚度并减少促炎细胞因子合成。在系统性红斑狼疮小鼠模型中，给药降低了IL-6和IL-17水平并增加了抗炎细胞因子IL-10。在癌症免疫治疗中，A. muciniphila肠道丰度较高与患者对PD-1阻断的临床反应相关，小鼠实验中口服补充恢复了PD-1阻断的疗效。然而，尽管A. muciniphila被广泛视为有益的黏液素降解共生菌，越来越多的证据表明其黏液素分解活性在特定生态和饮食条件下可能变得有害。低纤维饮食增加了A. muciniphila水平，减少了内层黏液层厚度，并使动物更易感染模仿人类大肠杆菌感染的Citrobacter rodentium病原体。在抗生素给药后口服补充A. muciniphila的小鼠模型中，出现了"过度定殖"状态，导致黏液水平显著降低和炎症反应增加。低纤维饮食喂养的动物中A. muciniphila水平升高与黏液层减少、食物过敏原敏感性增加和结肠炎症增加相关。葡萄糖浓度也影响Akkermansia水平——饮用含10%葡萄糖或果糖水的小鼠表现出更高的A. muciniphila水平，肠道细菌更接近上皮层，内层黏蛋白层更薄。在病毒感染背景下也观察到Akkermansia水平变化：新生小鼠轮状病毒感染导致Akkermansia丰度早期增加，与黏液填充杯状细胞减少相关。经A. muciniphila降解的黏液抑制轮状病毒感染的能力降低，表明黏液素可能作为诱饵受体干扰轮状病毒细胞入侵。COVID-19患者中Akkermansia水平同样升高，但升高最终对宿主有益还是有害仍有待确定。

1. 7.
   结论

本工作的主要新颖性在于对"黏液素悖论"的机制解析。通过整合碳水化合物活性酶的最新结构和生化数据，以及黏蛋白特异性蛋白酶和被低估的脱硫酸或脱乙酰预备步骤的作用，本综述提供了黏液素降解的完整拓扑结构。该综述独特地将这些分子事件置于情境依赖性代谢范式中，强有力地表明A. muciniphila的益生功效并非绝对属性，而是由其酶库的精确时空调控所决定的条件性结果。A. muciniphila被定位为定殖肠道生态位的功能专性菌，此类共生菌的治疗潜力严格依赖于宿主聚糖层（黏液素）受调控降解。治疗性操控A. muciniphila需要认识到其黏液素降解能力本质上是双刃剑。仅当酶活性与宿主黏液产生和营养可用性保持同步时，屏障完整性才能得以维持。然而，这种受严格调控的降解可能限制益生效益，甚至可能对宿主产生不良影响。在特定实验情境下——即纤维缺乏的无菌或合成群落小鼠模型以及抗生素处理并过度定殖A. muciniphila的小鼠——低纤维可用性或过度定殖与黏液素降解增加、黏液层变薄以及感染或炎症易感性增加相关。这些发现具有模型依赖性，并不确立纤维摄入不足必然导致人类A. muciniphila有害黏液素降解。从转化角度而言，通过基于Akkermansia的益生菌、益生元、后生元和MDEs治疗性操控这些微妙的宿主-微生物关系，可能为针对代谢性和炎症性疾病的主动干预提供相当大的前景。