提取方法与乙醇浓度对西姜属植物Hornstedtia scyphifera var. fusiformis嫩茎抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响：基于LC-HRMS/MS的抗氧化优化提取物成分分析

《Molecules》：Effect of Extraction Method and Ethanol Concentration on the Antioxidant and α-Glucosidase Inhibitory Activities of Hornstedtia scyphifera var. fusiformis Shoots:LC-HRMS/MS Profiling of the Antioxidant-Optimized Extract

　　

中文摘要翻译 尽管苏门答腊地区传统上使用Hornstedtia scyphifera var. fusiformis（姜科Zingiberaceae），但其嫩茎的抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性尚未被评估。研究人员采用浸提（maceration）和回流（reflux）两种方法，分别以70%和96%乙醇制备营养嫩茎提取物，并评估其总酚含量（total phenolic content, TPC）、总黄酮含量（total flavonoid content, TFC）、抗氧化活性（DPPH、CUPRAC、FRAP、ABTS）及α-葡萄糖苷酶抑制活性。96%乙醇提取物表现出高于70%乙醇提取物的TPC、TFC及抗氧化活性；其中96%乙醇浸提（M96）获得最高的TPC（138.87 ± 9.29 mg GAE/g）和CUPRAC活性（106.62 ± 1.59 mg AEAC/g）。然而，70%乙醇回流提取物（R70）的α-葡萄糖苷酶抑制活性（6811.94 ± 528.27 mg AEAGIC/g）显著强于其他提取物，尽管其酚类和黄酮类含量较低。α-葡萄糖苷酶抑制活性与酚类、黄酮类及抗氧化参数之间不存在一致的相关关系。化学计量学分析（主成分分析PCA、层次聚类分析HCA）显示，提取物的分离主要取决于乙醇浓度而非提取技术。对抗氧化优化提取物M96进行LC-HRMS/MS分析，初步注释了20种次级代谢产物，其中以黄酮醇ermanin和倍半萜nootkatone含量最高。由于仅对M96进行了成分分析，R70的α-葡萄糖苷酶抑制活性所对应的化合物仍未被鉴定；提取条件对两种活性的影响不同，但R70活性的化学基础有待进一步研究。

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一、研究背景与目的

姜科（Zingiberaceae）植物在印度尼西亚拥有极高的多样性，是当地重要的药用植物资源。然而，相较于姜属（Zingiber）、姜黄属（Curcuma）和山奈属（Alpinia）等研究较为深入的类群，西姜属（Hornstedtia）的植物化学与药理学研究明显滞后。Hornstedtia scyphifera var. fusiformis（苏门答腊当地称为“Sijangkang”）被报道为苏门答腊特有植物，其传统药用价值已有记载，但既有研究几乎全部集中于其悬根和根茎，证实这些器官含有酚类、黄酮类、皂苷、三萜类、甾体及生物碱，并具有抗氧化（甲醇根提取物DPPH IC₅₀ = 51.89 mg/L）、抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性及大鼠模型中的抗炎作用。然而，此前研究均未涉及营养嫩茎部位，未采用除DPPH以外的其他抗氧化评价方法，也未考虑抗糖尿病活性。尽管同属其他物种（如Hornstedtia conoidea叶片提取物TPC达314.69 mg GAE/g，DPPH IC₅₀为14.21 μg/mL；多种马来西亚Hornstedtia物种中分离的甲基化山柰酚衍生物同时抑制DPPH自由基和α-葡萄糖苷酶，其中3-甲基山柰酚的IC₅₀分别为78.6 μM和21.0 μM）提示黄酮醇类化合物可能同时贡献于该属的抗氧化与抗糖尿病活性，但这些发现仅限于分离化合物而非粗提物，且未在其他物种中验证。溶剂极性和提取技术已知会显著影响植物中酚类及黄酮类物质的回收效率，进而影响提取物的抗氧化和抗糖尿病活性。浸提和回流结合不同浓度乙醇是常用且简便的提取方案，但尚未有研究系统评估这些参数对H. scyphifera生物活性的影响。本研究正是针对这一空白，系统评估提取方法（浸提vs.回流）和乙醇浓度（70% vs. 96%）对该植物嫩茎总酚含量、总黄酮含量、抗氧化活性（DPPH、CUPRAC、FRAP、ABTS）及α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响，并利用探索性相关分析、化学计量学以及对抗氧化优化提取物的LC-HRMS/MS分析来表征各提取物。

二、研究内容与主要结论

研究人员以300 g干燥粉末为原料，分别采用浸提（每循环24 h，室温）和回流（每循环2 h）两种方法，各使用70%和96%乙醇，每条件进行3个提取循环，料液比约1:3（w/v），合并三次滤液后减压浓缩干燥，获得四种提取物（M70、M96、R70、R96）。研究测定了各提取物的提取率、TPC、TFC、四种抗氧化活性（DPPH、ABTS、FRAP、CUPRAC）和α-葡萄糖苷酶抑制活性，并进行了Pearson相关分析、主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）。基于综合排名评分，M96以最高综合得分（26/32）被选为抗氧化优化提取物，进行LC-HRMS/MS成分分析。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：浸提（maceration）与回流（reflux）两种提取方法结合70%和96%两种乙醇浓度制备提取物；Folin-Ciocalteu比色法测定总酚含量（TPC）；氯化铝比色法测定总黄酮含量（TFC）；DPPH自由基清除法、ABTS自由基阳离子脱色法、FRAP铁离子还原法和CUPRAC铜离子还原法四种互补机制评价抗氧化活性；基于酵母（Saccharomyces cerevisiae）α-葡萄糖苷酶和底物pNPG的体外酶抑制实验评价α-葡萄糖苷酶抑制活性；Pearson相关分析、主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）进行数据多元分析；超高效液相色谱-高分辨质谱联用（LC-HRMS/MS，Thermo Scientific Vanquish UHPLC耦合Orbitrap Exploris 240）对M96提取物进行次级代谢产物鉴定，化合物通过精确质量数和MS/MS碎片匹配mzCloud、mzVault、NIST HRMS及ChemSpider数据库进行推定注释（MSI level 2）。植物材料于2026年4月采集自印度尼西亚西苏门答腊利马普洛科塔县古古克区Simpang Sugiran村，凭证标本（No. 2397/IT1.C11.2/TA.00/2026）存放于印度尼西亚万隆理工学院生命科学与技术学院万隆植物标本馆。

四、研究结果

4.1 提取率（Extraction Yield）

70%乙醇回流（R70）获得最高提取率（10.72%），依次为70%乙醇浸提（M70，7.50%）、96%乙醇回流（R96，5.59%）和96%乙醇浸提（M96，4.74%）。无论提取技术如何，70%乙醇提取的总质量均高于96%乙醇。

4.2 总酚和总黄酮含量（Total Phenolic and Total Flavonoid Content）

TPC范围为28.31 ± 0.79 mg GAE/g（R70）至138.87 ± 9.29 mg GAE/g（M96）；TFC范围为3.13 ± 0.29至12.15 ± 0.52 mg QE/g。单因素方差分析显示四种提取物在两项参数上均存在显著差异（p < 0.05）。M96的TPC和TFC最高，依次为R96、M70和R70。

4.3 抗氧化活性（Antioxidant Activity）

DPPH活性以R96最高（137.89 ± 2.04 mg AEAC/g），显著高于M96（98.23 ± 5.64 mg AEAC/g）；M70和R70无显著差异（88.03 ± 6.09和86.31 ± 1.58 mg AEAC/g）。CUPRAC活性以M96最高（106.62 ± 1.59 mg AEAC/g），四种提取物间均存在显著差异（p < 0.05）。FRAP活性以R96最高（76.88 ± 5.43 mg AEAC/g），M70和R70最低且无统计差异。ABTS活性方面，M96和R96相当（60.10 ± 4.32和56.18 ± 5.29 mg AEAC/g），均显著高于M70和R70（40.11 ± 0.79和37.52 ± 1.10 mg AEAC/g）。

4.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性（Alpha-Glucosidase Inhibitory Activity）

R70的α-葡萄糖苷酶抑制活性达到6811.94 ± 528.27 mg AEAGIC/g，为其他三种提取物（916.32 ± 88.68至1320.09 ± 436.70 mg AEAGIC/g）的5至7倍，Tukey检验确认R70与三者均存在显著差异（p < 0.05）。AEAGIC值超过1000 mg/g表明抑制能力强于等量阿卡波糖，但该结果需结合酶来源解读：阿卡波糖对哺乳动物肠道α-葡萄糖苷酶为强效抑制剂，但对酵母α-葡萄糖苷酶仅呈弱抑制，因此AEAGIC值仅适用于相同条件下的提取物间比较。

4.5 相关分析（Correlation Analysis）

由于化学计量学分析显示提取物主要按乙醇浓度分离，Pearson相关分析在70%和96%乙醇组内分别进行（每组n = 12，来自两种提取物的技术重复）。70%乙醇组内，TPC、CUPRAC和ABTS形成紧密正相关簇，而α-葡萄糖苷酶抑制活性与TPC呈强负相关，表明该浓度组内酚类含量最高的提取物并非酶抑制能力最强的。96%乙醇组内，α-葡萄糖苷酶抑制活性与TPC、TFC和CUPRAC呈正相关，而DPPH和FRAP形成方向相反的独立簇。两组间相关模式甚至出现方向反转，提示不同乙醇浓度下提取物组成可能发生改变，但缺乏70%乙醇提取物的LC-HRMS/MS数据，该解释仍属推测。

4.6 化学计量学分析（Chemometric Analysis）

PCA得分图显示PC1和PC2分别解释71.2%和16.8%的总方差。PC1将70%乙醇提取物（负侧）与96%乙醇提取物（正侧）分开，提取方法相关的差异较小。值得注意的是，M70和R70尽管α-葡萄糖苷酶抑制活性差异悬殊，却在得分图上紧密聚集，表明PCA的分离主要由抗氧化相关参数驱动，未能捕捉R70活性所对应的方差。HCA树状图呈现相同结论：两个主簇对应70%和96%乙醇，各簇内再按浸提和回流分为亚支。

4.7 LC-HRMS/MS化合物鉴定（LC-HRMS/MS Compound Identification）

对M96提取物的LC-HRMS/MS分析中，以mzCloud相似度>90%为阈值，52个特征达到标准，其中20个被归类为次级代谢产物（均为MSI level 2推定注释）。按峰面积排序的前10个化合物涵盖多种代谢类别：黄酮类（ermanin、儿茶素catechin、异山柰酚isokaempferide、槲皮苷quercitrin）、倍半萜类（nootkatone、石竹烯氧化物caryophyllene oxide）、单萜类（香芹酮carvone、α-蒎烯-2-氧化物α-pinene-2-oxide）、生物碱（葫芦巴碱trigonelline）和酚酸（4-香豆酸4-coumaric acid）。Ermanin峰面积最大，其次为nootkatone和石竹烯氧化物，三者主导了已鉴定的次级代谢物池。约9.4至10.2 min间的强峰主要对应脂类相关特征（N-酰基乙醇胺、单酰甘油和神经酰胺），未列入次级代谢物表。

五、讨论与结论

讨论部分指出，70%乙醇获得更高提取率与更含水溶剂共提取更广泛极性成分（包括糖类等亲水性物质）的普遍规律一致。TPC和TFC在96%乙醇提取物中最高，与低含水量乙醇-水体系更有效溶解中等极性酚酸和黄酮苷元的报道相符。本研究的核心发现是R70的α-葡萄糖苷酶抑制活性异常突出（6811.94 mg AEAGIC/g），尽管其TPC和TFC较低，这一模式与同属其他物种中甲基化山柰酚衍生物同时贡献抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性的报道相悖，提示R70的活性可能主要归因于非黄酮类成分。然而，由于LC-MS/MS仅对M96进行了分析，R70的活性无法与具体化学成分关联。M96中含量最高的ermanin和nootkatone虽在文献中分别具有结构类似物的抗糖尿病证据和AMPK激活、氧化应激改善等活性，但M96自身的α-葡萄糖苷酶抑制活性仅为R70的五分之一左右，这一模式反而倾向于否定简单的萜类解释，指向R70自身未测定的化学差异或M96单独分析未捕获的化合物参与。PCA中PC1（71.2%方差）按乙醇浓度而非提取方法分离提取物，与象姜（Zingiber officinale var. officinale）化学计量学研究（PC1占93.3%方差）及Graptophyllum pictum和安纳托利亚蜂胶研究中的溶剂主导分离模式一致。但本研究每条件仅一个提取物进行技术重复分析，无法确立提取过程的可重复性。十个推定注释化合物中，异山柰酚提供了最直接的先例——其化学等同于山柰酚-3-O-甲醚，是Zingiber zerumbet中分离的最强α-葡萄糖苷酶抑制剂（IC₅₀ = 7.88 μM）；香芹酮是少数以纯物质直接验证抗氧化和α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物；葫芦巴碱具有最深厚的文献基础，通过增强胰岛素分泌、降低氧化应激和改善葡萄糖耐受及胰岛素抵抗降低血糖。研究局限性包括每条件仅单一提取物（技术重复而非独立提取重复）、LC-HRMS/MS分析仅限于M96、缺乏体内验证、代谢物鉴定为推定而非确证、采样范围有限（单一部位和地点）以及缺乏作用机制和毒性评估。

研究结论部分翻译如下：在所测试条件下，H. scyphifera var. fusiformis营养嫩茎提取物间的差异主要与乙醇浓度相关而非提取技术；由于每条件仅以一个提取物进行技术重复分析，这些差异需通过独立提取重复加以确认。96%乙醇提取物表现出更高的总酚、总黄酮含量和抗氧化能力，其中M96的TPC和CUPRAC值最高；而R70尽管酚类和黄酮含量低，却表现出最强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。对抗氧化优化提取物M96的LC-HRMS/MS分析推定注释了20种次级代谢产物，最丰富的为ermanin和nootkatone。这些观察表明提取条件对抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响不同，并提示后者可能涉及酚类和黄酮类以外的成分；由于R70未进行化学分析，这些结果属于关联性发现而非已确立的化学因果关系。据研究人员所知，这是关于该植物营养嫩茎植物化学特征及抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性的首次报道。这些发现应视为初步体外结果；对R70进行成分分析和生物测定引导的分馏，配合独立提取重复，是确认其活性并鉴定活性成分所必需的。