《Molecules》：Urease Inhibitory Activity of Tilia rubra subsp. caucasica V.Engl.: Activity-Guided Fractionation of a Folk Medicine
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细菌脲酶在多种疾病的发病机制中发挥关键作用，包括胃炎、消化性溃疡、尿石症和胃癌。由于现有脲酶抑制剂存在毒性和稳定性方面的担忧，促使研究者从天然来源中寻找更安全的替代品。因此，本研究旨在通过活性导向分离（activity-guided fractionation
细菌脲酶在多种疾病的发病机制中发挥关键作用，包括胃炎、消化性溃疡、尿石症和胃癌。由于现有脲酶抑制剂存在毒性和稳定性方面的担忧，促使研究者从天然来源中寻找更安全的替代品。因此，本研究旨在通过活性导向分离（activity-guided fractionation, AGF）技术，鉴定高加索椴（Tilia rubra subsp. caucasica V.Engl.，为 Tilia dasystyla subsp. caucasica (V.Engl.) Pigott 的同义词）中具有脲酶抑制活性的生物活性化合物。研究人员对植物材料进行液-液分配，随后采用色谱技术进行分离，并在每一步评估对刀豆脲酶（jack bean urease）的体外抑制活性。通过液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）和核磁共振波谱（NMR）阐明分离化合物的结构。80%乙醇提取物表现出显著的体外脲酶抑制活性（47.14 ± 2.59%）。乙酸乙酯亚提取物为活性最强的部位（抑制率61.38 ± 0.64%；半数抑制浓度（IC50）= 71.35 ± 3.48 μg/mL），从中分离获得多种化合物，包括番石榴苷（guaijaverin）、反式椴树苷（trans-tiliroside）、异槲皮苷（isoquercitrin）、原儿茶酸（protocatechuic acid）以及一种新的二聚黄酮苷（亚甲基双紫云英苷，methylenebisastragalin）。在100 μg/mL浓度下，番石榴苷（抑制率71.86 ± 3.55%；IC50 = 119.63 ± 3.64 μM）和异槲皮苷（抑制率48.04 ± 2.28%）表现出最强的脲酶抑制活性。高效液相色谱（HPLC）定量分析表明，番石榴苷和异槲皮苷对乙酸乙酯亚提取物的活性有贡献，但未能完全鉴定出负责所观察活性的全部化合物。分子对接研究显示，这两种化合物的XP GScores分别为?8.64和?8.47 kcal/mol。上述研究结果表明，高加索椴是极具前景的天然脲酶抑制剂来源，值得进一步开展实验验证，尤其是针对细菌脲酶（包括幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）脲酶）的抑制活性，以评估其治疗潜力。
一、研究背景与科学问题
脲酶（urease，尿素酰胺水解酶，EC 3.5.1.5）通过将尿素水解为氨和氨基甲酸，从而提高环境pH值。细菌脲酶在多种疾病的发病机制中扮演关键角色，包括胃炎、消化性溃疡、尿路结石形成、导管阻塞、肾盂肾炎、氨性脑病、肝昏迷及胃癌等。其中，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）脲酶尤为关键：该细菌借助脲酶中和胃内低pH环境，得以在胃酸环境中存活并到达黏液层，同时脲酶还通过刺激单核细胞和中性粒细胞促进炎症因子释放和上皮细胞损伤。近年来，幽门螺杆菌对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐药性上升，导致标准疗法的根除率下降，促使研究者重新关注脲酶等非抗生素靶点。此外，脲酶在泌尿系统感染和尿路结石形成中也发挥重要作用，且土壤脲酶过度活性会导致尿素肥料中氨的挥发损失，造成营养流失和环境污染。然而，现有脲酶抑制剂如磷酰二胺类、异羟肟酸衍生物和咪唑类存在毒性和稳定性不足的局限，因此从天然来源尤其是植物中寻找高稳定性、低毒性的新型脲酶抑制剂成为研究热点。
高加索椴（Tilia rubra subsp. caucasica V.Engl.，TRC，现接受名为 Tilia dasystyla subsp. caucasica (V.Engl.) Pigott）是椴属中研究较少的分类群，分布于伊朗、克里米亚、北高加索、外高加索和土耳其。在民间医学中，其花序制备的浸剂或煎剂用于治疗感冒、胃部疾病和哮喘，并用作发汗剂、镇咳剂和镇静剂。尽管该植物在民间广泛使用，但对其植物化学和药理研究极为有限。已有研究表明其甲醇提取物富含黄酮类（槲皮素、鼠李嗪、芦丁）和酚类化合物，并具有胶原酶和脂肪酶抑制、抗菌和抗氧化活性。然而，据研究人员所知，尚未有任何椴属物种的脲酶抑制活性研究，也缺乏对TRC花序基于分离的植物化学研究。鉴于TRC在初步实验中表现出脲酶抑制活性，且其传统用途与胃部疾病相关，本研究旨在通过活性导向分离（AGF）技术鉴定其脲酶抑制活性成分，并进一步表征其植物化学特征。
二、研究设计与技术方法
研究人员采集了2020年7月第一周开花期来自土耳其里泽省Büyükk?y, ?ayeli的TRC花序（凭证标本存于加齐大学药学院植物标本馆，编号GUEF 3821）。干燥花序（540 g）经80%乙醇浸提获得粗提物（102.51 g，得率18.98%），随后依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进行液-液分配。对乙酸乙酯亚提取物（活性最强）采用活性导向分离策略，依次使用Sephadex LH-20凝胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、C18反相柱色谱和快速硅胶柱色谱等多种色谱技术进行系统分离纯化。化合物结构通过液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）和一维/二维核磁共振波谱（NMR）阐明。脲酶抑制活性采用靛酚法（indophenol method）以刀豆脲酶（Canavalia ensiformis）为模型酶进行体外评价，以硫脲为阳性对照。采用HPLC对乙酸乙酯亚提取物中主要活性化合物进行定量分析。分子对接研究采用Schr?dinger软件的诱导契合对接（IFD）方案，以刀豆脲酶X射线晶体结构（PDB: 4H9M）为受体。
三、主要研究结果
（一）提取物与亚提取物的脲酶抑制活性
80%乙醇提取物表现出47.14%的脲酶抑制活性。经液-液分配后，乙酸乙酯亚提取物活性最强，抑制率达61.38 ± 0.64%，IC50为71.35 ± 3.48 μg/mL，而阳性对照硫脲的IC50为7.46 ± 0.06 μg/mL。基于此结果，研究人员对乙酸乙酯部位开展活性导向分离。
（二）活性导向分离与化合物鉴定
通过系统的色谱分离，研究人员从乙酸乙酯亚提取物中分离鉴定了5种化合物：番石榴苷（guaijaverin）、反式椴树苷（trans-tiliroside）、异槲皮苷（isoquercitrin）、原儿茶酸（protocatechuic acid）以及一种新化合物——亚甲基双紫云英苷（methylenebisastragalin）。其中，亚甲基双紫云英苷为两个紫云英苷（astragalin）单元通过亚甲基桥连接形成的二聚黄酮苷，经SciFinder、Reaxys和PubChem数据库检索确认其为新天然产物，也是椴属中首次报道的二聚黄酮。研究人员通过额外LC-MS分析排除了该化合物在分离过程中形成的可能性：在未经热处理的新鲜制备乙酸乙酯提取物中检测到该化合物，表明其可能天然存在于植物中，但完全排除人为产物形成的可能性仍需进一步验证。
（三）分离化合物的脲酶抑制活性
番石榴苷表现出最强的脲酶抑制活性，从两个不同流分中分离获得，纯度分别为96.14%和97.31%，IC50值分别为119.63 μM和150.45 μM（对应抑制率71.86%和63.35%）。异槲皮苷在100 μg/mL浓度下表现出约48%的抑制率（对应不同流分中48.04%、45.67%和42.03%）。反式椴树苷和原儿茶酸活性较弱，抑制率分别为25.73%/23.64%（168 μM）和20.40%/25.58%（649 μM），均未超过50%故无法计算IC50。亚甲基双紫云英苷基本无活性（110 μM时抑制率仅9.96%）。
（四）HPLC定量分析
HPLC定量分析显示，乙酸乙酯亚提取物中番石榴苷含量为4.68 mg/100 mg提取物，异槲皮苷含量为12.85 mg/100 mg提取物。在100 μg/mL浓度下，亚提取物含10.8 μM番石榴苷和27.7 μM异槲皮苷。结合分离化合物的抑制活性，这两种化合物对亚提取物的活性有贡献，但不能完全解释所观察到的活性，提示亚提取物中其他成分也可能参与整体抑制效应。
（五）分子对接研究
分子对接结果显示，番石榴苷的羟基与ALA440、ALA549、ARG609和ASP633残基形成氢键，苯并吡喃环与HIS593形成π-π相互作用，羟基朝向两个催化镍离子（Ni901和Ni902），XP GScore为?8.64 kcal/mol。异槲皮苷通过氧原子与两个催化镍离子直接配位，并与ALA436、ARG439、ALA440、ASP494和CME592残基形成多个氢键，XP GScore为?8.47 kcal/mol。两种化合物均能与脲酶活性位点的催化镍离子及周围残基发生相互作用。
四、讨论与结论
文献对比显示，番石榴苷和异槲皮苷的脲酶抑制活性与Shabana等（2010）的报道一致（番石榴苷IC50 = 120 μM，异槲皮苷IC50 = 160 μM，均针对刀豆脲酶），但异槲皮苷的活性在不同研究中差异较大（IC50从9.10 μM到160 μM不等，甚至有无活性的报道），这种差异可能与实验方法不同有关。反式椴树苷和原儿茶酸的弱活性也与文献报道基本一致。值得注意的是，部分流分在进一步分离后活性下降，研究人员推测可能与多酚类成分（特别是缩合单宁）在聚酰胺柱上的滞留或分离过程中的降解有关，单宁和原花青素可能通过与蛋白质的非特异性相互作用对脲酶抑制活性有所贡献。由于分离化合物的量有限，未能评价其联合脲酶抑制活性。本研究首次评价了椴属物种的脲酶抑制活性，发现TRC花序的80%乙醇提取物及其乙酸乙酯亚提取物具有脲酶抑制活性，番石榴苷和异槲皮苷是贡献该活性的主要化合物。然而，研究基于刀豆脲酶的细胞-free实验，需进一步使用细菌脲酶和产脲酶微生物验证其生物学相关性。未来应开展针对幽门螺杆菌等产脲酶病原菌的体外和体内研究，评价其抗菌效果、对消化性溃疡的预防或治疗潜力及毒理学特征。总体而言，本研究拓展了TRC的植物化学和药理学知识，凸显了该物种作为脲酶抑制剂来源的进一步研究价值。
