哌啶类α-羟基膦酸酯（OPP）与vPMO在咪喹莫特诱导银屑病样皮炎模型中的合成、结构表征及生物学效应比较研究

《Molecules》：Red Wine Lees Valorization for Phenolic Compounds Recovery and Characterization Using Resin Adsorption

　　

合成了一种哌啶类α-羟基膦酸酯（OPP），并对其结构进行了表征；在咪喹莫特（IMQ）诱导的银屑病临床前模型中，比较评价了OPP与vivo-磷酰二胺吗啉代寡聚体（vPMO）的效应。OPP由1-(3-异丙氧基丙基)哌啶-4-酮与亚磷酸二甲酯经氢膦酰化反应合成，其结构经IR、NMR波谱及元素分析确证。采用局部涂抹IMQ诱导大鼠银屑病，将动物随机分为六组：对照组（C）、实验性银屑病组（Ps）、溶媒处理组（Ps/V）、糖皮质激素处理组（Ps/GCS）、哌啶类α-羟基膦酸酯处理组（Ps/OPP）及vivo-磷酰二胺吗啉代寡聚体处理组（Ps/vPMO）。于第3、5、7天采用改良银屑病面积与严重程度指数（PASI）评估临床表现，并在7天观察期内测定体重与改良PASI评分。采用苏木精-伊红（H&E）染色评价组织病理学改变。第7天以流式细胞术测定CD3⁺CD45R^?、CD4⁺CD8^?及CD4⁺CD25⁺ T细胞亚群，以酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1、IL-17A及IL-22浓度。IMQ给药引起进行性发展的银屑病样皮肤病变，表现为角化过度、棘层肥厚、真皮炎症细胞浸润、体重下降、CD3⁺CD45R^?与CD4⁺CD8^?细胞数量减少、IL-6、IL-17A与IL-22水平升高及IL-10水平降低。OPP处理与PASI总评分降低及鳞屑严重程度减轻相关，并伴有血清IL-6、IL-17A与IL-22浓度下降及IL-10浓度升高。此外，与银屑病组相比，OPP使CD4⁺CD8^?细胞数量增加，而CD4⁺CD25⁺细胞数量仍低于对照水平。相比之下，vPMO处理呈现不同的反应特征，表现为CD3⁺CD45R^?与CD4⁺CD8^?细胞数量增加、IL-17A与IL-22水平降低、IL-10水平升高，以及TGF-β1的显著升高，而对某些皮肤表现的变化作用较弱。总体而言，OPP以临床、组织病理学及免疫学变化较为一致的模式为特征，而vPMO处理主要引起全身免疫学参数更为明显的改变。这些发现表明OPP与vPMO在IMQ诱导的银屑病样皮肤病变模型中具有不同的生物学效应模式，并支持对上述化合物开展进一步的临床前研究。然而，所观察到的变化尚不能就潜在分子机制或特定细胞通路的参与作出确定性结论，应结合有限的观察期、所检测细胞标志物谱有限、缺乏某些实验对照及缺乏药代动力学数据等因素加以解读。

研究背景：银屑病是一种慢性免疫介导的炎症性疾病，涉及免疫细胞、细胞因子与角质形成细胞之间复杂的相互作用，T细胞反应失调伴随IL-6、TNF-α、IL-17A、IL-22、IL-10与TGF-β1等促炎及调节性介质产生改变，导致持续炎症及特征性皮肤改变。当前对银屑病的认识强调固有免疫与适应性免疫的共同参与以及免疫与表皮机制间的密切相互作用。分子方法的发展拓展了靶向病理过程各组分的途径，除生物制剂与小分子外，反义寡核苷酸等基因导向策略日益受到关注，其中靶向IRF4的反义寡核苷酸可减轻IMQ诱导银屑病表现及产生IL-17A的CD4⁺细胞数量。同时，治疗应答不足或丧失、需长期治疗及临床特征差异持续推动新方法的探索，联合不同作用机制药物的可能性亦在研究中。在哈萨克斯坦，哌啶及相关化合物的合成与实验研究已系统开展，研究人员此前在无菌性炎症与急性肺损伤模型中研究过此类化合物，评估了细胞组成、T淋巴细胞亚群、细胞因子谱及修复过程，这些研究为将研究扩展至新的哌啶化合物结构类别及新的免疫介导炎症病理模型提供了实验基础。本研究所研究的OPP为二甲基[4-羟基-1-(3-异丙氧基丙基)哌啶-4-基]膦酸酯，是一种α-羟基膦酸酯，结合了叔哌啶氮原子、磷酰基与羟基、两个甲氧基及含柔性醚的N-取代基。α-羟基膦酸酯被视为化学与生物学上重要的一类化合物，多个含杂原子中心的存在提供了多种分子间相互作用的可能，但其本身并不决定特定药理靶点。既往对相关哌啶氧膦酸酯的研究表明该结构类别可与Pd(II)、Pt(II)及Cu(II)形成配合物，且其功能性质依赖所存在杂原子的性质，这些发现证实了氧膦酸酯骨架的化学功能性，但并未为OPP在银屑病中的作用机制提供直接证据。本研究所研究的第二种化合物为靶向IL1RL2的vPMO，对vPMO而言，本研究是更广泛计划的一部分，涉及免疫学、形态学及转录组学效应的序贯研究。比较化学上不同的实体——小分子OPP与基因导向的vPMO——有助于识别早期细胞与体液变化的共有及差异特征，而不预先假定二者具有相同作用机制。本研究旨在合成并结构表征OPP，并比较评价IMQ诱导银屑病模型中局部给予OPP与vPMO相关的临床及早期免疫学变化，评估了皮肤表现与体重变化、T淋巴细胞亚群及血清IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1、IL-17A与IL-22浓度。

主要技术方法：研究人员通过Pudovik–Abramov反应（膦酸二烷基酯在碱催化下加成至醛酮）合成OPP，经低温结晶与己烷重结晶分离，采用IR、¹H/¹³C/³¹P NMR（含COSY、HMQC、HMBC二维谱）及元素分析确证结构；采用8–12周龄、体重180–220 g的雄性Rattus norvegicus大鼠（来源于哈萨克国立医科大学B.A. Atchabarov基础与应用医学研究所），随机分为六组（每组n=6），以5%咪喹莫特（Aldara）每日涂抹背部脱毛区62.25 mg/天连续7天诱导银屑病样皮炎，分别局部给予溶媒（丙二醇/亚油酸，PG/LA，95:5）、0.05%丙酸氯倍他索乳膏、OPP（50 mg/kg）及vPMO（0.03 mg/kg）；以改良PASI评分与体重评估临床变化，H&E染色评估组织病理学，流式细胞术（Attune? NxT，FMO对照设门）测定外周血T细胞亚群，夹心ELISA测定血清细胞因子，采用单因素及双因素重复测量方差分析结合Tukey事后检验进行统计学分析（GraphPad Prism 10.6.1）。

研究结果：
2.1 二甲基[4-羟基-1-(3-异丙氧基丙基)哌啶-4-基]膦酸酯（OPP）的合成与结构表征：通过1-(3-异丙氧基丙基)哌啶-4-酮与亚磷酸二甲酯在甲醇钠存在下的氢膦酰化反应合成OPP，经低温结晶与己烷重结晶以70%收率获得熔点为72–73 °C的结晶产物；IR谱中3319 cm^?1宽峰归属O–H伸缩振动、1222 cm^?1强峰归属P=O伸缩振动，且特征ν(C=O)区无强酮吸收带，支持起始哌啶-4-酮被消耗；¹H NMR谱信号积分涵盖分子全部28个质子；¹³C NMR谱显示九组共振，最特征者为C-4共振呈中心位于δ(C) 69.17 ppm的双峰（¹J(C,P) = 168.9 Hz），支持C-4–P直接成键及α-羟基膦酸酯中心的形成；二维NMR（COSY、HMQC、HMBC）进一步确证分子片段连接性，其中H-7 → C-2,6与H-9 → C-11远程相关证实侧链连接于氮原子及末端异丙氧基的存在，H-2eq,6eq → C-4相关与羟基膦酸酯中心位于C-4一致，1D与2D NMR数据共同排除了3-甲氧基丙基的替代结构归属；元素分析结果与C13H28NO5P计算值一致。上述收率、物理特征、IR谱数据、元素组成及¹H、¹³C、COSY、HMQC、HMBC NMR数据一致支持OPP的 proposed 结构。

2.2 IMQ及后续处理对大鼠体重与PASI评分的影响：第3天，实验性银屑病组、溶媒处理组及GCS处理组体重较基线下降，而对照组与vPMO处理组体重增加，溶媒处理组体重下降与对照组及vPMO组相比具统计学显著性（?3.6% ± 2.2% vs. 4.0% ± 2.2%和3.9% ± 3.3% vs. 4.0% ± 2.2%，分别为p ≤ 0.01和p ≤ 0.05）；第5天，实验性银屑病组与溶媒处理组体重较对照组显著下降（?2.8% ± 1.8%和?3.8% ± 1.9% vs. 4.6% ± 1.2%，均p ≤ 0.001），而vPMO处理组体重较实验性银屑病组与溶媒处理组显著增加（3.9% ± 2.5% vs. ?2.8% ± 1.8%和?3.8% ± 1.9%，均p ≤ 0.01）；第7天，实验性银屑病组体重较基线显著下降，与对照组、GCS处理组及vPMO处理组相比差异显著（?4.4% ± 3.1% vs. 4.5% ± 1.6%、4.6% ± 1.4%和4.5% ± 3.1%，均p ≤ 0.01）。总体而言，IMQ给药后未治疗的实验性银屑病组体重进行性下降，而对照组体重增加，该模式可能反映IMQ诱导炎症超出局部皮肤表现之外的全身效应。以改良PASI评分评估银屑病样皮肤病变严重程度，由对治疗分配不知情的独立观察者对红斑、鳞屑及皮肤增厚按0–4分评分并求和得0–12分总PASI评分。对照组整个观察期未出现红斑、鳞屑或皮肤增厚，各临床表现评分及总PASI评分在所有评估时间点均为0；Ps组三种临床表现严重程度在观察期内进行性增加，第5天与第7天变化最明显，红斑于第5天达最高评分2.5 ± 0.5，鳞屑与皮肤增厚于第7天分别达最高评分3.3 ± 0.5与2.3 ± 0.5，总PASI评分进行性升高并于第7天达最大值（7.8 ± 0.4）；Ps/V组与Ps组在任何评估时间点的红斑、鳞屑及皮肤增厚等临床参数均无显著差异，总PASI评分亦无显著差异。OPP与GCS在任何评估时间点均未显著降低红斑与皮肤增厚评分，但第7天二者均较Ps组显著降低鳞屑评分（2.1 ± 0.4 vs. 3.3 ± 0.5，均p ≤ 0.5）；尽管对单个PASI组分作用有限，治疗组与Ps组在多个评估时间点总PASI评分存在显著差异：第3天Ps/OPP与Ps/GCS组总PASI评分显著低于Ps组（2.8 ± 0.4和2.6 ± 0.5 vs. 4.1 ± 0.4，均p ≤ 0.01）；第5天Ps/OPP与Ps/GCS组相应总PASI评分为4.6 ± 0.5和4.5 ± 0.5，而Ps组为6.0 ± 0.0（均p ≤ 0.01）；第7天Ps/OPP与Ps/GCS组总PASI评分仍显著低于Ps组，分别为5.8 ± 0.4和5.5 ± 0.5，而Ps组为7.8 ± 0.4（均p ≤ 0.0001）。vPMO处理未降低任何单个临床表现，但较Ps组显著降低第5天（4.8 ± 0.4 vs. 6.0 ± 0，p ≤ 0.05）与第7天（5.8 ± 0.4 vs. 7.8 ± 0.4，p ≤ 0.001）总PASI评分。总体而言，IMQ诱导银屑病样皮肤病变严重程度进行性增加，表现为观察期内总PASI评分升高；与实验性银屑病组相比，OPP、GCS及vPMO处理组在特定时间点总PASI评分较低，而单个PASI组分差异有限，表明观察期内治疗组间皮肤病变临床严重程度存在差异。

2.3 组织学分析：对福尔马林固定、石蜡包埋样本切片行H&E染色并显微镜观察，组织学检查显示未治疗的实验性银屑病组与各治疗组均存在银屑病样皮肤病变的形态学特征，包括角化过度、棘层肥厚及真皮炎症细胞浸润，补充了实验模型的临床表征。

2.4 T淋巴细胞亚群变化：T淋巴细胞亚群分析显示组间CD3⁺CD45R^?细胞、CD4⁺CD8^?细胞（辅助性T细胞）及CD4⁺CD25⁺细胞数量存在差异。IMQ诱导银屑病组CD3⁺CD45R^?细胞数量较对照组显著减少2.4倍（0.90 ± 0.029 vs. 2.15 ± 0.06；p = 0.0003）；GCS与vPMO处理组CD3⁺CD45R^?细胞计数分别较Ps组高2.8倍（p < 0.0001）与2.2倍（p = 0.0001）；OPP处理组CD3⁺CD45R^?细胞计数较GCS处理组低约2倍（0.90 ± 0.029 vs. 2.25 ± 0.41；p = 0.0004）。Ps组CD4⁺CD8^?细胞数量较对照组显著减少2.7倍（0.21 ± 0.01 vs. 0.56 ± 0.08；p = 0.0019）；相比之下，GCS、OPP与vPMO处理组CD4⁺CD8^?细胞计数较Ps组显著升高，分别增加4.6倍（0.96 ± 0.14；p < 0.0001）、2.5倍（0.52 ± 0.08；p = 0.0052）与2.7倍（0.57 ± 0.10；p = 0.0014）。CD4⁺CD25⁺细胞数量不仅在Ps组、而且在V、GCS、OPP与vPMO处理组均显著低于对照组，因而所研究的任何治疗均未使CD4⁺CD25⁺细胞计数恢复至对照水平。总体而言，T淋巴细胞亚群变化呈异质性模式，组间差异最明显者为CD3⁺CD45R^?与CD4⁺CD8^?细胞，而CD4⁺CD25⁺细胞仅与对照组比较存在显著差异。

2.5 细胞因子浓度变化：为表征全身炎症反应，测定了血清促炎与调节性细胞因子浓度。Ps组IL-6浓度较对照组升高；与Ps组相比，V（溶媒）、GCS与OPP处理分别使IL-6浓度降低23.03%（58.52 ± 14.06 vs. 76.03 ± 8.16；p = 0.0468）、34.6%（50.13 ± 8.22；p = 0.0011）与35.0%（50.13 ± 8.22；p = 0.0008）；相比之下，TNF-α浓度差异未达统计学显著性。Ps组IL-10浓度较对照组低约10倍（60.25 ± 7.79 vs. 592.22 ± 151.94；p < 0.0001）；GCS处理使IL-10浓度恢复至对照水平，较Ps组增加10.4倍（624.07 ± 112.09；p < 0.0001），且GCS组IL-10浓度较OPP与vPMO组高约1.5倍（427.82 ± 130.67；p = 0.0318和409.24 ± 73.52；p = 0.0227）；尽管V、OPP与vPMO未使IL-10浓度恢复至对照水平，但分别较Ps组高4.5倍（273.95 ± 80.75；p = 0.0159）、7.1倍（427.82 ± 130.67；p < 0.0001）与6.8倍（409.24 ± 73.52；p < 0.0001）。Ps组与对照组间TGF-β1浓度无显著差异；同样，OPP处理较Ps组未显著改变TGF-β1浓度；vPMO处理后TGF-β1升高最明显，浓度较Ps组高6.9倍（1308.62 ± 274.46 vs. 190.28 ± 36.16；p = 0.0019）；与OPP不同，GCS与V均显著升高TGF-β1浓度，分别较Ps组高4.8倍（914.94 ± 142.11；p < 0.0001）与3.2倍（611.86 ± 156.59；p = 0.0009）。作为Th17相关反应的组分，进一步评估了IL-17A与IL-22：Ps组IL-17A与IL-22浓度分别较对照组高1.5倍与2.0倍（12.40 ± 1.45 vs. 8.17 ± 0.75；p = 0.0004和0.70 ± 0.21 vs. 0.35 ± 0.27；p = 0.0486）；OPP处理较Ps组使IL-17A浓度降低36.8%（7.83 ± 0.72；p = 0.0001）、IL-22浓度降低54.7%（0.32 ± 0.13；p = 0.0247）；同样，PMO处理较Ps组使IL-17A浓度降低23.4%（9.50 ± 2.70；p = 0.0232）、IL-22浓度降低47.6%（0.37 ± 0.12；p = 0.0247）。总体而言，OPP与PMO处理均与多种促炎介质降低及IL-10浓度升高相关，两种化合物最显著的差异见于TGF-β1，其在PMO处理后升高尤为明显。

讨论部分总结：本研究将OPP的化学表征与其生物学效应的初步评价相结合。OPP分子含碱性叔氮原子、极性α-羟基膦酸酯中心及含醚侧链，此种组合可能影响溶解度、在递送溶媒中的分布、透皮渗透及与生物分子极性区的相互作用；然而本研究未测定OPP的pKa、logP/logD、溶解度、渗透性及分子靶点，因此其结构与所观察免疫学特征之间的关系应视为工作假设而非已确立机制，相关氧膦酸酯的化学功能性此前已有证明。IMQ诱导银屑病伴随临床表现严重程度进行性增加，组织学检查显示角化过度、棘层肥厚及真皮炎症细胞浸润，这些变化与IMQ诱导大鼠银屑病样皮肤病变的主要特征一致；同时CD3⁺CD45R^?与CD4⁺CD8^? T细胞绝对数减少、IL-6、IL-17A与IL-22浓度升高、IL-10浓度显著降低，T细胞群体与细胞因子调节的改变是银屑病免疫反应的特征性组分，循环炎症细胞因子（包括IL-17）的变化亦得到临床研究荟萃分析的支持，因此本模型中皮肤病变的发展伴随免疫反应细胞与体液组分的改变。OPP处理与临床改善及所检测细胞因子谱的改变相关，总PASI评分降低同时伴IL-6、IL-17A与IL-22浓度下降及IL-10浓度升高；临床与免疫学变化的一致性提示Ps/OPP组炎症反应减轻，但IL-6与IL-10的变化应结合Ps/V组所观察到的同向变化加以考虑；GCS亦观察到类似方向的变化，其在降低皮肤表现严重程度的同时也影响细胞与细胞因子参数，但GCS更早且更持续的总PASI评分降低将其与OPP的作用区分开来。vPMO处理后的变化模式不同，总PASI评分降低伴随CD3⁺CD45R^?与CD4⁺CD8^?细胞计数恢复、IL-10浓度升高及TGF-β1显著升高，同时IL-17A与IL-22降低，此外vPMO prevented 未治疗动物所观察到的体重下降；然而这些变化未伴随单个临床表现的显著降低，因此在所检测时间点vPMO对免疫学参数的作用较直接在皮肤中观察到的变化更为明显。比较细胞与细胞因子参数时OPP与vPMO的差异尤为明显：两种化合物均使CD4⁺CD8^?细胞数量较Ps组增加，而CD3⁺CD45R^?细胞计数的恢复为vPMO处理的特征；然而两种处理后CD4⁺CD25⁺细胞数量仍低于对照组，因此IL-10升高及其他细胞因子变化未伴随CD4⁺CD25⁺细胞群体的数量恢复，这对解释本研究结果很重要，因为CD25表达随T细胞活化而改变，活化常规T细胞与调节性T细胞的表型可能重叠，因此不加FoxP3与CD127等额外标志物评估CD4⁺CD25⁺细胞无法将该群体明确表征为调节性T细胞。vPMO处理后血清TGF-β1的显著升高是所研究化合物间最明显的差异之一，TGF-β1有助于维持免疫稳态并调节多种免疫细胞群体的功能状态，其生物学效应取决于周围细胞因子与细胞环境；本研究中TGF-β1升高与IL-10浓度升高、促炎介质水平降低及部分T细胞参数恢复同时出现，综合这些变化可表征Ps/vPMO组的免疫学特征；Ps/V组亦观察到TGF-β1升高，因此该反应并非vPMO制剂所特有，但TGF-β1升高的细胞来源及其在所观察变化中的功能意义仍有待阐明。在Ps/V组，IL-6浓度降低伴随IL-10与TGF-β1较Ps组升高，表明PG/LA在该模型中的生物学活性；这些细胞因子在Ps/V、Ps/OPP与Ps/vPMO组间同向变化表明溶媒对所观察反应有贡献，因此Ps/OPP与Ps/vPMO组这些参数的变化不能完全归因于所研究化合物的作用。比较临床、组织病理学与免疫学发现表明两种所研究化合物对IMQ诱导改变的校正模式不同：OPP处理时IL-6、IL-17A与IL-22降低及IL-10升高伴随累积PASI评分降低；vPMO处理时IL-17A与IL-22降低及IL-10升高伴随TGF-β1显著升高与CD3⁺CD45R^?及CD4⁺CD8^?细胞计数恢复，而皮肤改变改善较不明显；因此在Ps/OPP组临床改善伴随所检测细胞因子的变化，而在Ps/vPMO组CD3⁺CD45R^?与CD4⁺CD8^?细胞数量增加与细胞因子谱变化同时出现。所得结果对该实验模型中OPP与vPMO的生物学效应进行了初步表征，其解释应考虑PG/LA溶媒的生物学活性、缺乏OPP纯度的定量数据及缺乏对vPMO proposed 靶点的直接实验验证；所观察变化支持进一步研究OPP与vPMO的生物学效应，而阐明其作用机制将需要额外的实验研究。研究局限性：本研究结果应结合7天观察期及所评估免疫学参数的范围加以解释；此外本研究未提供OPP纯度的定量数据，vPMO的 proposed 分子靶点亦未直接实验验证，这些方面限制了对所观察效应机制的解释；所观察T细胞亚群与细胞因子谱变化反映免疫反应的全身性改变，为未来研究更全面表征其免疫反应提供了基础，包括评估额外表型与功能标志物以及皮肤局部免疫与炎症变化；正在进行的实验研究包括转录组分析，旨在进一步表征所研究化合物给药相关的分子变化；OPP与vPMO间所观察差异亦值得进一步研究OPP的理化与药代动力学性质以及阐明vPMO的推定分子靶点；总体而言，这些发现为进一步研究阐明作用机制及推进所研究化合物的临床前表征提供了基础。

研究结论翻译：二甲基[4-羟基-1-(3-异丙氧基丙基)哌啶-4-基]膦酸酯（OPP）由相应哌啶-4-酮经氢膦酰化反应合成，以70%收率分离；IR、¹H、¹³C、COSY、HMQC与HMBC波谱数据及元素分析结果与 proposed 氧膦酸酯结构相互一致。在IMQ诱导银屑病样皮肤病变模型中，给予OPP与vPMO与临床表现总体严重程度降低及免疫反应细胞与细胞因子组分改变相关；所观察临床与免疫学变化提示OPP与vPMO的潜在治疗价值并支持其进一步临床前研究。解释所得结果时应考虑溶媒的生物学活性；进一步阐明OPP与vPMO的作用机制需要额外研究，包括对vPMO proposed 分子靶点的直接实验验证及OPP纯度的定量评估。