基于富T核酸适体与金纳米棒比色法高特异性区分Hg2+与MeHg的研究

《Molecules》：Developing an Aptamer-Based Colorimetric Method for Highly Specific Discrimination of Hg2+ and MeHg

　　

高度毒性的无机汞（Hg2+）和甲基汞（MeHg）是广泛存在的重金属污染物，对人类健康和生态系统产生负面影响。因此，开发一种快速、简便且可视化的检测Hg2+和MeHg的方法以防止汞中毒既紧迫又具挑战性。在本研究中，研究人员开发了一种比色生物传感器，该传感器使用富含胸腺嘧啶（T-rich）的HT9脱氧核糖核酸（DNA）适体作为识别探针（RP），并在其5'端标记巯基（-SH），同时采用聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDAC）包被的金纳米棒（AuNRs）作为信号探针（SP），用于特异性检测Hg2+和MeHg。在Hg2+存在下，Ag0/Hg0汞齐纳米颗粒（ANPs）形成并与HT9 DNA适体结合，产生浅薰衣草色。由于更强的结合能力，MeHg优先与HT9 DNA适体结合，而还原后的Ag0纳米颗粒则沉积在PDDAC包被的AuNRs表面。有趣的是，这产生了从橄榄色到深绿色的颜色变化。该方法对Hg2+和MeHg分别在0.30–1.00 μM和0.50–5.00 μM范围内表现出良好的线性关系，相应的可视化检测限（LOD）分别为0.30 μM（Hg2+）和0.50 μM（MeHg）。理论LOD（3σ/S）计算为0.071 μM（Hg2+）和0.12 μM（MeHg）。本工作所建立的方法成功应用于实际海水样品中Hg2+和MeHg的比色检测，回收率（Rec.）为98–107%，相对标准偏差（RSD, n=6）≤8%。该方法为饮用水和水产品中Hg2+和MeHg的半定量测定，特别是在事故级污染情况下，提供了有用的技术参考。

一、研究背景与目的

汞是一种全球性的高毒性重金属污染物，严重威胁环境、食品和人类健康。每年有大量汞排放至大气，导致其在空气、土壤和水中广泛分布。微生物能将无机汞（Hg²⁺）转化为毒性更强的甲基汞（MeHg），并通过食物链产生显著的生物放大效应，最终对顶级捕食者如人类造成神经毒性和不可逆的发育损伤。因此，开发快速、可靠、低成本的汞检测技术对于保障食品安全和保护公众健康至关重要。传统的检测方法如原子吸收光谱法（AAS）和高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）虽然灵敏度高，但仪器昂贵、操作复杂、耗时且成本高昂，难以满足现场快速检测和汞形态特异性分析的需求。比色法因其易于观察、成本低廉和操作简单而备受青睐，但其选择性、灵敏度和抗干扰能力仍有待提升。基于此，本研究旨在利用胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶（T-Hg²⁺-T）配位作用以及不同汞形态与富T DNA适体结合亲和力的差异，开发一种新型比色生物传感器，以实现对Hg²⁺和MeHg的高特异性区分和灵敏检测。

二、主要关键技术方法

研究人员采用种子介导生长法合成了十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）包被的金纳米棒（AuNRs），随后通过层层自组装法先后用聚苯乙烯磺酸盐（PSS）和聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDAC）对其进行表面修饰，得到PDDAC包被的AuNRs作为信号探针（SP）。将5'端标记巯基（-SH）的富T H_T9 DNA适体作为识别探针（RP），通过金硫共价键（Au-S）将其锚定在AuNRs表面，构建了基于AuNRs的生物传感器。检测过程中，加入硝酸银（AgNO₃）和硼氢化钠（NaBH₄）还原剂，利用不同汞形态与H_T9适体结合能力的差异，导致Ag⁰或Ag⁰/Hg⁰汞齐纳米颗粒（ANPs）在适体或AuNRs表面的选择性沉积，从而引起溶液颜色和紫外可见吸收光谱的变化，实现对Hg²⁺和MeHg的区分与定量。实际海水样品采集自中国福建龙海沿海水域。

三、研究结果

3.1 实验原理验证与表征

通过紫外可见吸收光谱和视觉图像验证了方法的可行性。对照组（无汞）呈现深红色，特征吸收峰在796 nm。加入Hg²⁺后，吸收峰蓝移至720 nm，溶液变为浅薰衣草色，表明Ag⁰/Hg⁰ ANPs沉积在H_T9 DNA适体上而非AuNRs表面。加入MeHg后，吸收峰进一步蓝移至690 nm，溶液呈现橄榄色，表明Ag⁰纳米颗粒沉积在AuNRs表面改变了其长径比（AR）。透射电子显微镜（TEM）和能量色散X射线（EDX）分析证实了上述推断：对照组AuNRs的平均AR约为3.44；加入Hg²⁺后AR基本不变（3.52），仅检测到少量Hg元素；加入MeHg或乙基汞（EtHg）后，AR显著增大（>3.90），并检测到大量Hg元素。

3.2 关键实验条件优化

研究人员优化了还原剂种类及浓度、缓冲液pH值和AuNRs表面修饰等关键参数。结果表明，NaBH₄是最优还原剂，其最佳浓度为85 mM。最优的Tris-HNO₃缓冲液pH值为8.5。与其他表面修饰相比，PDDAC包被的AuNRs具有更高的正电荷和更好的细胞活力，表明其稳定性和低细胞毒性更佳。

3.3 H_T9 DNA适体浓度的影响

研究了10 μM至30 μM范围内H_T9 DNA适体浓度对检测体系的影响。结果表明，20 μM的适体浓度能够最清晰地区分Hg²⁺和MeHg，浓度过低结合不充分，过高则可能产生空间位阻和过度吸附。

3.4 选择性与特异性评估

在最优条件下，研究人员测试了九种常见共存金属离子（Mg²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Cr³⁺）在100倍浓度下的干扰情况。结果显示，这些离子均产生与对照组相似的深红色和UV-Vis吸收光谱，证明该方法对汞形态具有优异的选择性和特异性。

3.5 分析性能评价

在最优条件下，随着Hg²⁺或MeHg浓度的增加，溶液颜色逐渐加深，特征吸收峰处的吸光度值下降。Hg²⁺在0.30–1.00 μM范围内，回归方程为A₇₂₀ = 1.0423 ? 0.3030 × C（R²=0.9917）；MeHg在0.50–5.00 μM范围内，回归方程为A₆₉₀ = 0.8425 ? 0.0369 × C（R²=0.9932）。可视化LOD分别为0.30 μM（Hg²⁺）和0.50 μM（MeHg），理论LOD（3σ/S）分别为0.071 μM和0.12 μM。该方法的灵敏度可满足水产品中MeHg的限量检测需求，并可作为饮用水中Hg²⁺的半定量筛查工具。

3.6 实际海水样品测定

将该方法应用于实际海水样品的加标回收实验。Hg²⁺的回收率为104–107%，RSD≤8%；MeHg的回收率为98–106%，RSD≤7%。结果经毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱（CE-ICP-MS）验证，证明了方法的可靠性和实用性。

四、讨论与结论

研究人员成功建立了一种基于富T H_T9 DNA适体作为识别探针（RP）和PDDAC包被的金纳米棒（AuNRs）作为信号探针（SP）的半定量现场筛查方法，用于特异性区分Hg²⁺和MeHg。该方法利用Hg²⁺和MeHg与H_T9 DNA适体结合亲和力的差异，通过控制Ag⁰或Ag⁰/Hg⁰汞齐纳米颗粒（ANPs）的沉积位置，改变AuNRs的长径比（AR），从而产生不同的视觉颜色和紫外可见特征吸收峰。该方法在实际海水样品中成功应用，为饮用水、水产品及食品中Hg²⁺和MeHg的测定，尤其是在事故级污染情况下，提供了有用的技术参考。