Estragole、Methyleugenol、Myristicin和Elemicin在V79细胞中的毒性效应比较研究

《Molecules》：Further Insight into the Toxic Effects of Estragole, Methyleugenol, Myristicin, and Elemicin in V79 Cells

　　

丙烯基苯类化合物（alkenylbenzenes）天然存在于多种香草和香料中，如罗勒和肉豆蔻，因此也存在于由其制成的各种食品中，如含罗勒的青酱和植物性食品补充剂。其中，Estragole和Methyleugenol已被充分研究并已知可诱导严重的毒性效应。相比之下，结构上密切相关的Myristicin和Elemicin的毒性潜力研究较少。为填补现有数据空白，本研究以比较方式研究了Estragole、Methyleugenol、Myristicin和Elemicin对V79细胞细胞毒性（通过WST-1法测定）和脱氧核糖核酸（DNA）完整性（通过组蛋白H2AX磷酸化测定评估）的影响。研究发现，Estragole、Methyleugenol、Myristicin和Elemicin在无微粒体S9大鼠肝细胞提取物和有微粒体S9大鼠肝细胞提取物存在的条件下，均以浓度依赖性方式诱导细胞毒性并损害DNA完整性。这些效应的强度在受试化合物之间有所不同。在500 μM浓度下，Estragole和Myristicin对细胞毒性和H2AX磷酸化的影响最为显著。Elemicin也显著增加了H2AX磷酸化，而其细胞毒性影响较为温和。最后，Methyleugenol在V79细胞中仅诱导了中等程度的细胞毒性和H2AX磷酸化效应。基于研究结果，研究人员得出结论：本研究所检测的丙烯基苯类化合物在细胞毒性潜力方面存在差异，这可能归因于其结构特性。此外，评估H2AX磷酸化的机制分析表明，受试丙烯基苯类化合物可在V79细胞中诱导DNA失稳过程，这在此实验条件下提示潜在的遗传毒性或促凋亡效应。

**研究背景**：丙烯基苯类化合物（alkenylbenzenes）是天然存在于罗勒、肉豆蔻、茴香籽等香草和香料中的食品源性化合物，在精油及由其制成的食品（如含罗勒的青酱、茴香茶和植物性食品补充剂）中浓度尤高。其中Estragole和Methyleugenol已被充分研究，已知可诱导遗传毒性（genotoxicity）和致癌性（carcinogenicity）等严重毒性效应。然而，结构上密切相关的Myristicin和Elemicin的潜在毒性特性研究较少，存在明显的数据空白。鉴于其结构相似性，推测它们可能表现出与Estragole和Methyleugenol相当的毒理学潜力。已有部分研究表明Myristicin和Elemicin可诱导细胞毒性及潜在遗传毒性效应。研究人员此前发表了一项关于上述四种化合物在V79细胞中潜在毒理学相关效应的比较研究，结果不能排除上述物质的潜在遗传毒性，并显示其对细胞活力的浓度依赖性效应。本研究旨在进一步以比较方式研究Estragole、Methyleugenol、Myristicin和Elemicin的毒性效应，通过在无或有外源性代谢系统（S9）存在的条件下评估细胞毒性，并通过检测组蛋白H2AX Ser139位点磷酸化（γH2AX，作为DNA双链断裂（DSB）形成的替代标志物）来研究DNA完整性，以获取进一步的机制信息。

**技术方法**：研究使用V79细胞（中国仓鼠肺成纤维细胞，来源于德国人类营养研究所Dr. Hansruedi Glatt）。以10、100和500 μM的Estragole（CAS# 140-67-0）、Methyleugenol（CAS# 93-15-2）、Myristicin（CAS# 607-91-0）和Elemicin（CAS# 487-11-6）处理细胞4 h，之后更换新鲜培养基恢复20 h。细胞毒性通过WST-1（水溶性四唑盐-1）法测定。DNA完整性通过免疫荧光法检测组蛋白H2AX Ser139磷酸化（γH2AX）评估，以DAPI复染细胞核进行归一化。代谢活化采用10% S9混合液（来自经苯巴比妥和5,6-苯并黄酮诱导的5-6周龄雄性Sprague Dawley大鼠肝脏S9上清组分）。阳性对照分别为0.01% Triton X-100（细胞毒性）、30 μM丝裂霉素C（MC，?S9）和20 μM环磷酰胺（CP，+S9）（γH2AX），阴性对照为1% DMSO。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA），p < 0.05视为显著。

**研究结果**：

**丙烯基苯类化合物在V79细胞中的细胞毒性效应**：在无S9条件下，0.01% Triton X-100（阳性对照）在24 h后诱导显著细胞毒性。10和100 μM Estragole无影响，而500 μM Estragole导致显著细胞毒性。10–500 μM Methyleugenol在WST-1法中无显著影响。10和100 μM Myristicin无效应，而500 μM Myristicin在24 h后显著诱导细胞毒性。Elemicin在所有测试剂量组（10–500 μM）对细胞毒性均无显著影响。在有S9条件下，0.01% Triton X-100显著影响细胞毒性。10或100 μM Estragole无效应，而500 μM Estragole在24 h后显著诱导细胞毒性。Methyleugenol在所有测试剂量组（10–500 μM）对细胞毒性无显著影响。10和100 μM Myristicin无效应，而500 μM Myristicin导致轻微但非显著的细胞毒性影响。10–500 μM Elemicin在24 h后对V79细胞细胞毒性无显著影响。

**丙烯基苯类化合物影响V79细胞DNA完整性**：在无S9条件下，30 μM MC（不需代谢活化的DNA损伤剂阳性对照）在24 h后显著增加γH2AX形成。10–100 μM Estragole无影响，而500 μM Estragole显著诱导γH2AX频率。10–500 μM Methyleugenol对γH2AX形成无显著影响。Myristicin导致γH2AX频率轻微但浓度依赖性增加，在500 μM时显著。Elemicin在无S9条件下所有测试剂量组对γH2AX无显著影响。在有S9条件下，CP（经代谢活化的阳性对照）显著增加γH2AX形成，证明外源性代谢活化系统的有效性。10 μM Estragole无效应，而100 μM和500 μM Estragole在24 h后导致γH2AX频率轻微但非显著的诱导。Methyleugenol在所有测试剂量组（10–500 μM）对γH2AX形成无显著影响。Myristicin以剂量依赖性方式增加γH2AX频率，在500 μM时显著。10 μM和100 μM Elemicin无显著影响，而500 μM Elemicin在24 h后显著增加V79细胞中γH2AX形成。

**讨论部分总结**：研究人员将本研究结果与已发表的其他研究进行了比较讨论。关于细胞毒性，本研究发现低浓度（10–100 μM）所有受试丙烯基苯类化合物在无或有S9条件下对细胞活力均无显著影响，而500 μM Estragole或结构相似的Myristicin在两种实验条件下均明显诱导细胞毒性。500 μM Methyleugenol或Elemicin仅导致轻微且非显著的细胞毒性效应。这与Martins等（2012）和Groh等（2012）的发现一致。Howes等（1990）和Chan与Caldwell（1992）在大鼠原代肝细胞中也观察到类似模式。Hasheminejad和Caldwell（1991）关于Elemicin和Myristicin的数据也与本研究结果一致。研究人员此前发表的微核试验数据进一步证实了这一点。关于DNA完整性，研究人员此前的研究表明上述丙烯基苯类化合物处理V79细胞可导致细胞死亡增加并与促凋亡过程相关，其他研究组也显示Methyleugenol或Myristicin可诱导入癌细胞凋亡。此外，此前研究还通过微核形成检测显示了遗传毒性效应（至少在500 μM最高剂量组）。凋亡常与DNA损伤直接相关，DNA损伤导致线粒体功能障碍，进而触发进一步的促凋亡过程导致细胞死亡。丙烯基苯类化合物的不同代谢途径可产生反应性中间体，通过形成DNA加合物引起遗传毒性效应。未修复的DNA加合物可导致DNA复制受损并释放切口，当DNA双螺旋两条互补链在邻近位置同时受损时可发生DSB。单个未修复的DSB足以诱导细胞死亡过程。由于组蛋白H2AX Ser139位点磷酸化（γH2AX）是在哺乳动物细胞中对DSB形成的响应，γH2AX被认为是DNA完整性的合适生物标志物。本研究结果显示所有受试丙烯基苯类化合物在无和有S9条件下均以浓度依赖性方式增加H2AX磷酸化，但效应强度不同。500 μM Estragole、Myristicin和Elemicin效果最为显著，而Methyleugenol对γH2AX诱导效果较轻微。这与Martins等（2012）和Carlsson等（2022）的发现一致。Carlsson等（2022）显示Methyleugenol的羟基化代谢物在HepG2肝癌细胞和代谢 competent 的转基因V79（CS）细胞中诱导γH2AX，并与V79细胞死亡增加和HepG2细胞线粒体触发的凋亡以及两种细胞系中DNA加合物形成增加相关。此外，在火鸡蛋胎儿肝脏模型中也在体内证明了Estragole、Methyleugenol、Myristicin和Elemicin的DNA损伤效应导致DNA加合物形成。Ackermann等近期显示10–2000 μM Estragole在过表达细胞色素P450（Cyp）1A2的人肝癌细胞系（HepG2）中显著诱导DNA加合物形成，并与100–1000 μM浓度下γH2AX形成显著增加相关。此外，Estragole代谢物1′-羟基Estragole在1–35 μM浓度下诱导致DNA加合物形成，在1–50 μM浓度下诱导野生型HepG2细胞中γH2AX形成。Ackermann等还显示1′-羟基Estragole在HepG2中以剂量依赖性方式诱导微核形成。Ackermann等近期还显示Estragole在人肝组织中诱导致DNA加合物形成。

总体而言，本研究结果表明所检测的丙烯基苯类化合物在V79细胞中的细胞毒性潜力存在差异（Estragole > Myristicin > Elemicin > Methyleugenol），无论在无还是有外源性代谢系统条件下均如此。这些效应可能与受试化合物的结构特性有关。此外，细胞毒性与DNA失稳效应相关，这可能机制性地参与此前在相同实验条件下观察到的丙烯基苯类化合物诱导的促凋亡过程和潜在遗传毒性效应。H2AX磷酸化增加不仅与凋亡相关，还与其他细胞过程如复制应激和遗传毒性相关。因此不能排除本研究中观察到的H2AX磷酸化增加（尤其是高剂量Estragole、Myristicin和Elemicin）是由这些化合物的遗传毒性效应诱导的。丙烯基苯类化合物的内源性代谢活化已被证明在其诱导的遗传毒性中至关重要。V79细胞缺乏代谢能力、使用大鼠S9作为人工工具补偿此缺陷以及化学杂质（如Myristicin中）的潜在影响是方法学局限性，其对本研究结果的影响难以评估。因此未来研究应在更复杂的实验系统（如具有内源性代谢能力的人肝细胞）中进行。这些信息对于更可靠地评估含丙烯基苯类化合物食品消费对人体健康的风险尤为重要。未来研究需要阐明丙烯基苯类化合物的毒理学效应，特别是其遗传毒性特征，包括DNA加合物形成和DNA修复机制受损导致的致突变性。内源性代谢活化的潜在差异和动力学需要在未来研究中加以解决，以帮助填补相关数据空白，进一步减少目前阻碍评估这些丙烯基苯类化合物潜在不良健康效应的不确定性。

**研究结论翻译**：综上所述，本手稿中报告和讨论的发现表明，Estragole、Methyleugenol、Myristicin和Elemicin可能以不同方式影响V79细胞的细胞毒性和DNA完整性。然而，本实验及其他标准体外测试设置存在重要的方法学局限性——特别是缺乏内源性代谢能力。这强调需要进一步开发现有的不依赖外源性代谢系统（S9）的体外毒性测试系统，以提高对经代谢活化转化为高毒性物质的特异性和敏感性。