《Journal of Xenobiotics》：Effects of Sex Hormones and Physical Environment on Epithelial Cell Identity and Plasticity in an Engineered Urethral Model
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人泌尿生殖道上皮细胞的身份受激素信号传导的强烈影响，但越来越多的证据表明上皮分化也可能受微环境线索的塑造。本研究利用人组织工程尿道模型探讨激素与物理环境如何调控上皮身份与可塑性。研究将来源于阴道组织与跨性别女性尿道组织的原代上皮细胞和基质细胞以同源和异源配置组
人泌尿生殖道上皮细胞的身份受激素信号传导的强烈影响，但越来越多的证据表明上皮分化也可能受微环境线索的塑造。本研究利用人组织工程尿道模型探讨激素与物理环境如何调控上皮身份与可塑性。研究将来源于阴道组织与跨性别女性尿道组织的原代上皮细胞和基质细胞以同源和异源配置组合，在受控条件下培养。构建体暴露于雌二醇（E2）或双氢睾酮（DHT），通过组织学染色和针对谱系特异性标志物的免疫荧光评估上皮分化。结果显示，在阴道基质上培养的阴道上皮细胞（VaEs）维持稳定的阴道表型，以上皮复层化和糖原蓄积为特征，尽管激素刺激可调节这些特征的幅度。相反，尿道上皮细胞（UEs）表现出高度可塑性，根据物理培养环境呈现不同表型。值得注意的是，含尿道上皮的构建体形成双重表型：在气-液界面处呈现类阴道分化，而在浸没条件下呈现更接近尿道的组织方式。此外，来源于长期雌激素暴露组织的尿道细胞持续表达尿道和阴道标志物，提示不完全分化或混合分化状态。总体而言，这些发现表明人尿道中的上皮身份并非固定不变，而是由细胞内在特性、基质相互作用和物理微环境线索之间的相互作用动态调控，而单独的激素信号传导似乎不足以决定细胞命运。本研究为上皮可塑性提供了新见解，并对发育生物学和泌尿生殖道重建的组织工程方法具有重要意义。
**研究背景与问题的提出**
人类群体日益暴露于内分泌干扰物（endocrine disruptors, EDs），包括塑料中常见的邻苯二甲酸酯和双酚类化合物以及化妆品中的对羟基苯甲酸甲酯等。这些化合物能够模拟内源性激素（如雌激素）或拮抗雄激素受体（androgen receptor），从而干扰内分泌系统。由于性别分化和器官发生受激素信号（尤其是雄激素）的严密调控，此类干扰可能显著改变发育过程。阴茎器官发生高度依赖雄激素信号传导，其 perturbance 可导致先天性畸形，其中尿道下裂（hypospadias）是男性泌尿生殖道最常见的异常之一，约每150名活产男婴中发生1例，表现为尿道口沿阴茎腹侧异位定位，严重程度从远端移位到近阴囊的近端形式不等，并伴有排尿流受损、勃起时阴茎弯曲及生育力下降风险增加等功能并发症。尽管遗传易感性可能 contribute to 尿道下裂，但流行病学数据显示其发病率在全球范围内增加，与环境变化及内分泌干扰化合物暴露密切相关。产前暴露于EDs已被证明可 critical 干扰胎儿发育并增加此类畸形的风险。
传统上上皮组织一旦分化即被视为相对稳定，但越来越多的证据表明分化上皮细胞可能保留一定程度的可塑性及对环境线索的响应性。因此，细胞身份不仅由发育起源决定，还可能受激素、基质和物理微环境的影响。在人泌尿生殖道发育过程中，早期尿道上皮起源于与未来阴道上皮 initially 共享的发育背景。阴茎尿道的形成涉及尿道板的管道化及雄激素依赖的远端融合。虽然大部分尿道上皮被认为来源于内胚层，但远端段（即舟状窝，Fossa Navicularis）表现出特别独特的上皮表型，该区域含有富含糖原的非角化复层鳞状上皮，与阴道上皮高度相似，可能受雌激素信号影响。这些观察支持尿道和阴道上皮可能并非完全不同的生物实体，而是沿共享发育连续体处于不同分化状态的概念。该模型暗示上皮可塑性的存在，即环境信号可能影响组织特异性特征的获得或维持。
从临床和组织工程角度看，尿道组织重建因缺乏合适的自体材料而仍具挑战性。为解决此问题，研究人员利用自组装方法开发了体外重建的人尿道模型，该方法能够从原代人细胞生成基质和上皮区室，并提供生理相关的平台以研究组织分化。近期进展还发现性别肯定手术（gender-affirming surgeries）是研究和人类组织的 novel 宝贵来源。在阴道成形术过程中，相当一部分尿道被手术切除，可作为尿道上皮和基质细胞的来源。然而，临床和组织学观察报道这些组织中存在类阴道上皮特征，提出了更广泛的生物学问题：这些变化仅仅是激素信号的结果，还是揭示了尿道上皮细胞可被其微环境调控的内在可塑性？一种可能的解释是手术前长期暴露于外源性雌激素（通常至少两年）。此类激素治疗可能影响细胞命运并促进向类阴道表型的部分转变，如早期研究所述在雌激素条件下海绵体尿道内出现上皮增生和糖原蓄积增加。这些发现强调了上皮细胞的潜在可塑性及激素微环境对组织身份的影响。
在此背景下，本研究旨在探讨人泌尿生殖道内的上皮可塑性，并确定激素、基质和物理环境线索如何 contribute to 上皮身份。研究人员利用组织工程尿道模型，将阴道和尿道上皮细胞与同源和异源基质组合，以评估上皮起源和基质背景的相对贡献。构建体暴露于雌二醇或双氢睾酮，并使用尿道和阴道分化的组织学和分子标志物进行分析。研究人员假设上皮身份并非完全由细胞起源或激素信号决定，而可能源自上皮细胞、基质细胞和物理微环境之间的动态相互作用。
**关键技术方法**
本研究采用人组织工程尿道模型，主要关键技术方法包括：（1）样本来源：阴道黏膜活检来自1名32岁因女性生殖系统良性疾病手术的患者，尿道活检来自4名接受性别肯定阴道成形术的供者（年龄23、32、38和51岁）；（2）自组装组织工程技术：将尿道成纤维细胞（UFs）或阴道成纤维细胞（VaFs）与胶原凝胶混合生成基质，随后将尿道上皮细胞（UEs）或阴道上皮细胞（VaEs）接种于基质上，一周后升至气-液界面以允许上皮分化，三周后用于实验；（3）激素处理：在培养基中加入双氢睾酮（DHT, 2 μM）或β-雌二醇（E2, 10 ng/mL），从上皮细胞接种至实验结束；（4）组织学与PAS染色：Masson三色染色评估组织架构，高碘酸-雪夫染色（PAS）及淀粉酶消化后PAS染色（PASd）评估糖原蓄积；（5）免疫荧光染色：针对MUC1、ZO-1、K18和K10等谱系特异性标志物进行免疫荧光分析。
**研究结果**
**尿道黏膜组织学观察**：对顺性别男性和跨性别女性尿道黏膜的组织学观察表明，存在与阴道上皮相似的区域；这在尿道舟状窝中可观察到，但与顺性别男性邻近的海绵体尿道黏膜明显不同。
**上皮和基质起源对组织工程尿道重建的影响**：为研究基质起源对尿道上皮成熟的可能作用，研究人员将UEs接种于自身基质（UFs）或VaFs产生的基质上，或将VaEs接种于自身基质或UFs产生的基质上。UE+UF或UE+VaF条件呈现两种表型：尿道型（图2A1、B1）和阴道型（图2A2、B2），而VaEs无法在UF来源的基质上形成上皮（图2C1、C2），在VaE+VaF条件下显示分化良好的阴道上皮（图2D1、D2）。令人惊讶的是，UE+UF或UE+VaF条件的某些构建体切片呈现双面上皮，气/液面处为类阴道形态，浸没面为尿道形态（图2A3、B3）。
**糖原蓄积检测**：阴道上皮成熟的标志是糖原化细胞的存在。PAS染色检测多糖（包括糖原）， subsequent 淀粉酶处理（PASd）特异性评估糖原存在。当UE+UF和VaE+VaF进行PAS/PASd染色时，在显示尿道形态的UE+UF（图3A、B）、显示阴道形态的UE+UF（图3C、D）以及对照VaE+VaF（图3E、F）中均检测到糖原存在，表明即使使用跨性别女性细胞重建的尿道黏膜呈现尿道形态，仍保留部分类阴道表型。
**激素刺激对上皮分化的影响**：为研究激素的作用，在组织重建过程中将DHT和E2加入培养物。UE+UF未处理（对照）呈现尿道型（图4A1）或阴道型（图4A2）上皮形态。DHT处理（图4B1、B2）和E2处理（图4C1、C2）均未改变两种形态的表现。在UE+VaF情况下，与对照结果（图4D1、D2）相反，DHT处理消除了上皮细胞增殖和分化的能力（图4E1、E2），而E2处理似乎无影响（图4F1、F2）。最后，与VaE+VaF条件下未处理的阴道上皮（图4G1、G2）相比，DHT似乎诱导成熟延迟，中间细胞更多而表面（糖原化）细胞更少（图4H1、H2），表明激素有效。
**尿道上皮表型在独立供者中的可重复性**：如所示，在基质两侧均存在上皮的情况下，暴露于浸没条件诱导类尿道表型，而气/液界面诱导类阴道表型。这些观察在多名患者（23岁、32岁、38岁和51岁）中均得到验证，表明这不是患者特异性伪影，而是在不同年龄供者中获得的可重复结果。
**阴道分化标志物的免疫荧光分析**：使用阴道上皮分子标志物（Mucin-1和K10）进一步研究跨性别女性尿道上皮细胞的可塑性及采用尿道或阴道形态的能力。在UE+UF（图6A1、A2）和UE+VaF（图6B1、B2）构建体中检测到MUC1和K10表达，与纯阴道对照（图6C1、C2）相似。
**尿道分化标志物的免疫荧光分析**：在含UE的构建体中也监测尿道标志物（ZO-1和K18）的表达。UE+UF（图7A1、A2）和UE+VaF（图7B1、B2）两种构建体均表达尿道标志物，表明它们不仅能表达尿道标志物，还能表达阴道标志物（图6）。
**讨论与结论**
本研究强调了阴道上皮身份在不同激素条件下的显著稳定性。VaFs/VaEs构建体一致显示分化良好的复层上皮伴糖原蓄积，为阴道组织架构的典型特征。尽管DHT暴露导致成熟延迟和中间细胞层数量增加，E2暴露导致上皮厚度适度增加，但整体表型保持不变。这种稳健性表明阴道上皮身份受上皮和基质区室的强烈预设。Mucin-1 + K10表达的维持进一步证实阴道分化程序的持续存在。这些发现支持一旦建立，阴道上皮身份在体外可能相对抵抗短期激素扰动，可能由于稳定的基质-上皮信号环路。
本研究最显著的观察之一是尿道成纤维细胞与阴道上皮细胞（UFs/VaEs）异源构建体中上皮形成的完全缺失。该结果强调了基质支持在上皮存活和组织化中的关键作用。基质细胞已知提供调控上皮增殖、分化和极性的关键生化和机械线索。阴道上皮细胞在尿道成纤维细胞存在下无法建立或维持上皮层，表明对组织特异性基质信号的强烈依赖。这种不相容性可能反映细胞外基质组成、旁分泌信号或基质机械特性的差异。这些发现强化了上皮身份不能独立于其基质微环境考虑的概念，且这些区室之间的不匹配可能导致上皮不稳定或丢失。
相反，涉及尿道上皮细胞（UEs）的构建体，无论与尿道成纤维细胞（UFs/UEs）还是阴道成纤维细胞（VaFs/UEs）组合，均表现出高度可重复且出乎意料的表型。在两种条件下，构建体两个表面均一致观察到上皮覆盖，表明尿道上皮细胞在给定培养条件下具有强烈的内在重组能力。这种行为与阴道上皮细胞形成鲜明对比，表明尿道上皮细胞可能具有更高程度的可塑性或适应性。值得注意的是，基质起源似乎不是这些构建体中上皮结果的主导决定因素，进一步强调上皮内在特性在此背景下的重要性。尿道上皮细胞在阴道基质上在DHT存在下似乎无法增殖和分化的原因仍有待确定。
本研究的一个核心发现是依赖物理培养环境出现的双重上皮表型。在含尿道上皮细胞的构建体中，形成两种不同的上皮轮廓：在气-液界面，上皮主要呈现类阴道表型，以复层化、糖原蓄积和阴道标志物（K10、MUC1）表达为特征，同时保留部分尿道特征如ZO-1的腔面定位。在浸没面，上皮显示更符合尿道表型的形态和组织化，尽管仍检测到一些阴道标志物。
气-液界面与浸没条件之间上皮表型的显著差异表明物理线索可能在上皮分化中起重要作用。这种差异可能并非依赖单一决定因素，而是由相互关联的微环境因素组合所致，包括氧可用性、水合状态以及营养物质和生长因子的扩散，这些可能在整个组织中产生不同的生化梯度。此类梯度已知影响上皮代谢、极性和屏障功能，因此可能 contribute to 不同分化程序的建立。在这些条件下，气-液界面似乎有利于复层化和糖原蓄积，重现阴道黏膜的若干特征，而浸没与更简单、更接近尿道的组织化相关。此外，上皮细胞可能通过分泌可影响基质重塑和上皮分化的可溶性因子 actively 修饰其局部微环境。基质机械特性也可能 contribute to 这些效应，尽管这些机制的相对重要性仍有待确定。总之，这些观察支持显著上皮可塑性的存在，即单一细胞群体可能通过物理约束、生化梯度和相互基质-上皮相互作用之间的复杂 interplay 采用不同的分化轨迹。
尽管激素处理（DHT和E2）预期在引导组织分化中起主要作用，但其效应与物理微环境和细胞背景相比似乎是次要的。虽然E2影响阴道构建体中的上皮厚度，但未在尿道构建体中诱导表型转换。同样，雄激素暴露未完全稳定尿道构建体中的尿道表型，而对阴道构建体影响甚微。这些发现表明，在所测试的条件下，单独的激素信号可能不足以在体外决定上皮身份，必须在包括基质相互作用和物理约束的更广泛框架内解释。尿道样上皮中阴道标志物的部分持续存在进一步支持不完全或可逆分化状态的观点。
观察到的尿道和阴道表型之间的可塑性为泌尿生殖道发育提供了新见解。同一构建体内两种表型的共存支持共享发育起源的概念，并表明尿道上皮细胞可能保留重新激活与更类阴道状态相关的分化程序的能力。在此背景下，发育过程中不适当暴露于内分泌干扰物或外源性激素可能潜在影响上皮分化并 contribute to 尿道下裂等发育异常。跨性别女性来源的尿道细胞中阴道相关特征的持续存在与此类潜在分化程序可能在发育后仍可访问并可在生命后期受激素或微环境线索调节的可能性一致。然而，由于本研究未直接研究内分泌干扰物，这些解释应被视为需要进一步实验验证的假设。
从转化角度看，这些发现对尿道重建具有重要意义。物理微环境的强烈影响表明必须仔细控制培养条件以实现稳定和生理相关的上皮表型。此外，尿道构建体中类阴道分化的可能性引发了对细胞来源选择的担忧，特别是在涉及先前激素治疗（如性别肯定治疗）的情况下。混合表型的持续存在可能影响工程组织的功能特性，应在未来应用中加以考虑。
本研究存在若干局限性。首先，分析仅限于 defined 的组织学和免疫荧光标志物集，尽管具有信息量，但可能无法完全 capture 上皮身份的复杂性。其次，激素处理的持续时间和条件可能无法完全重现生理暴露场景。未来研究应旨在使用转录组学或蛋白质组学方法扩展分子表征，研究观察到的表型的可逆性，更详细地探索机械力和氧梯度的贡献，并评估重建上皮的功能特性。
**结论翻译**：总体而言，本研究表明人尿道内的上皮身份并非固定不变，而是高度可塑的，由基质相互作用、激素信号和物理微环境之间的相互作用所塑造。这些发现为泌尿生殖道生物学提供了新见解，并为发育生物学和组织工程应用突出了重要考虑。
