海藻酸钠-乳清复合微胶囊中枯草芽孢杆菌与干酪乳杆菌模拟胃肠环境存活率及酸奶贮藏稳定性比较

《Microorganisms》：Comparison of Viability of Encapsulated Probiotics Bacillus subtilis and Lacticaseibacillus casei in Simulated Gastrointestinal Conditions and Their Survival in Yogurt

　　

本研究分析了包埋益生菌干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus casei）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的释放能力、胃环境存活率及酸奶贮藏期间存活率。益生菌以四种材料进行微胶囊化：（1）溶于干酪乳清（cheese whey）的海藻酸钠（sodium alginate，SAW）；（2）SAW中添加果胶（pectin，SAW-P）；（3）SAW中添加明胶（gelatin，SAW-G）；（4）SAW中添加淀粉（starch，SAW-S）。对包埋体系的粒径、表面形态及包埋率（encapsulation efficiency）进行了评价。在胃环境条件下测定细胞释放与存活达4 h。随后将包埋益生菌存于商业酸奶饮料中30 d，评价细胞存活率及对酸奶特性的影响。益生菌包埋率范围为90–95%。消化4 h后，干酪乳杆菌从SAW中释放95%的细胞，而SAW-G与SAW-P释放25–30%的活细胞。相比之下，SAW释放80%的枯草芽孢杆菌细胞，SAW-S与SAW-G在胶囊中保留30–40%的益生菌。在酸奶中贮藏30 d期间，游离与包埋益生菌均显示高细胞存活率，而pH与酸奶成分变化最大者见于含干酪乳杆菌的样品。

研究背景：益生菌是含活微生物的制剂，经口摄入后可赋予胃部健康益处，包括平衡肠道菌群、增强黏膜防御、缓解急性腹泻、感染、肠易激综合征、克罗恩病及免疫相关疾病等，并可能有助于预防高血压、癌症、糖尿病等慢性疾病，以及影响心理健康与认知衰退，其机制涉及维持正常细胞因子干扰素-γ（interferon-gamma，IFNγ）水平。研究涉及的菌种包括放线菌门中的双歧杆菌（Bifidobacteria，BB）、乳杆菌属（如干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌）及枯草芽孢杆菌。干酪乳杆菌通过产乳酸抑制病原菌生长；枯草芽孢杆菌可形成芽孢，增强代谢活性并在消化过程中抑制病原菌，且产过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）以增强细胞抗氧化防御。益生菌须在口服及胃肠转运过程中保持存活方能发挥健康效益，包埋于各种基质中或加入食品中作为保护性载体与释放介质是保证其胃内存活的策略。已有研究报道干酪乳杆菌在阿拉伯胶-果胶基质中的包埋、大豆壳多糖（soy hull polysaccharides，SHPs）等材料包埋植物乳植杆菌、阿拉伯胶与大豆蛋白包埋五株乳杆菌等，但关于枯草芽孢杆菌包埋的研究有限，仅有海藻酸钠（sodium alginate，SA）包埋枯草芽孢杆菌E20、SA包埋枯草芽孢杆菌、SA包埋莫哈韦芽孢杆菌及SA包埋三株芽孢杆菌等报道。本研究比较包埋枯草芽孢杆菌与干酪乳杆菌两株益生菌在胃环境中的释放与存活及其在商业酸奶饮料贮藏期间的保存效果，其新颖性在于两株菌差异显著：干酪乳杆菌为产酸乳酸菌、具发酵代谢、广泛用于发酵食品；枯草芽孢杆菌为需氧/兼性代谢、主要用于动物饲料；但两者均为杆菌形态且对包埋敏感。本研究提供包埋枯草芽孢杆菌在酸奶（对该菌不利的介质）中的行为与存活数据，并可为枯草芽孢杆菌其他益生菌应用研究提供参考。

研究人员开展的研究与结论：研究人员将枯草芽孢杆菌（BS-05）与干酪乳杆菌Shirota株（CS-03）培养于MRS琼脂与大豆酪蛋白消化琼脂（SCDA），37 °C培养24 h，制备悬浮菌体并加入经90 °C、15 min巴氏杀菌的全脂牛乳清中，37 °C、200 rpm均质培养24 h。采用四种包埋体系：1%（w/v）海藻酸钠以乳清为溶剂（SAW）、SAW加1 g果胶（SAW-P）、SAW加1 g明胶（SAW-G）、SAW加1 g玉米淀粉（SAW-S）。将50 mL各体系与10 mL菌悬液混合10 min，经B-395 PRO包埋设备（200 μm喷嘴、流速6 mL/min、频率600 Hz）滴入氯化钙溶液，4 °C维持24 h，过滤洗涤后用FreeZone台式冻干机冻干（?40 °C冷冻12 h、?40 °C一次干燥24 h、?20 °C二次干燥12 h，真空0.025 mbar），测定湿/干胶囊直径，4 °C蒸馏水保存24 h。结论：四种微胶囊包埋率均高（90–94%），益生菌与包埋体系间无显著差异；消化过程中益生菌细胞释放因包埋体系与菌种而异，干酪乳杆菌从SAW与SAW-G的释放主要发生在1 h内（分别35%与25%），随时间释放减少，4 h后SAW-P与SAW-G中仍有25–30%细胞存活；枯草芽孢杆菌最早从SAW-G与SAW释放（1 h，25%），释放能力随时间下降，消化4 h后SAW-S与SAW-G中仍有30–40%细胞存活。包埋益生菌在商业酸奶4 °C贮藏30 d期间细胞保存优于游离细胞，SAW-S与SAW使90%的枯草芽孢杆菌细胞存活，SAW-G与SAW-P使80%的干酪乳杆菌细胞存活；游离细胞对酸奶环境亦有耐受性，仍有1 × 10⁹细胞存活，满足益生功能需要；益生菌的存在引起pH与成分的小幅变化，可能与微生物代谢活性有关。研究表明枯草芽孢杆菌是具高胃环境存活能力的可比微生物，提供另一种益生菌选择，且包埋枯草芽孢杆菌因高存活能力可加入商业酸奶；但仍需更多研究分析枯草芽孢杆菌的其他应用、其益生效应与抵抗力、包埋后的理化变化及加入酸奶或其他食品基质后的感官影响。重要意义在于为包埋益生菌在胃肠环境与食品基质中的行为提供了比较数据，并拓展了枯草芽孢杆菌作为益生菌的应用前景。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用海藻酸钠-乳清及添加果胶、明胶、淀粉的四种包埋体系制备微胶囊，以B-395 PRO设备经氯化钙交联成型并冻干；采用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）与能量色散X射线光谱（energy-dispersive X-ray spectroscopy，EDS）表征表面形态与元素组成；以BET（Brunauer-Emmett-Teller）氮吸附-脱附法测定比表面积、孔容与平均孔径；以模拟胃液（simulated gastric fluid，SGF）与模拟肠液（simulated intestinal fluid，SIF）进行体外消化评价释放与存活；以膜过滤法计数活菌；在商业酸奶中4 °C贮藏30 d评价存活率，并以DNS比色法测还原糖、双缩脲法测蛋白、pH计监测pH。菌株来源为墨西哥莫雷洛斯州自治大学生物技术研究实验室与墨西哥国立技术学院/托卢卡理工学院。

研究结果：（1）包埋体系特性——通过外观与SEM观察得出胶囊呈球形、白色、无剪切或缺口，湿胶囊直径350–400 μm、冻干后250–300 μm，属微胶囊尺寸；50×显微图显示冻干导致不规则球形，2000×显微图显示各体系表面形态与孔隙分布不同，SAW呈 organized纤维与不明确孔隙，SAW-P表面均匀且可见孔隙，SAW-G结构致密且有孔隙，SAW-S中淀粉颗粒与海藻酸钠交织形成稳定结构但孔隙不规则；通过BET分析得出包埋体系孔径均<10.75 nm，可保护0.5–5 μm的微生物细胞，SAW与SAW-P孔径最大，SAW-G与SAW-S孔径较小且相近，SAW、SAW-P与SAW-S比表面积与孔容最高，SAW-G最低，提示小孔径可减少胃酸传输而增强消化期细胞存活，较高孔隙度有利于营养与流体扩散。（2）包埋率——通过对比包埋前后细胞计数得出包埋率为90–95%，各体系间无统计学显著差异（p > 0.05），归因于芽孢杆菌属易包埋、材料相容及壁材提供胶囊坚硬度而避免细胞泄漏。（3）胃肠条件下递送能力——通过4 h消化中逐时取样计数得出胶囊稳定无降解迹象，SGF 2 h后转SIF 2 h，不同益生菌与包埋体系间释放差异显著（p < 0.05）；干酪乳杆菌以SAW释放最多，SAW-P与SAW-S相似，SAW-G限制释放；枯草芽孢杆菌以SAW释放最高、SAW-S最低；SGF阶段两菌均主要从SAW与SAW-G释放，SIF阶段干酪乳杆菌从SAW-P与SAW-G释放最高，枯草芽孢杆菌从SAW释放最高、SAW-G与SAW-S最低，提示SAW-G、SAW-S与SAW-P可延长消化后释放并保护细胞，但胶囊可能与菌群或肠黏膜相互作用不足或被降解排出，需进一步研究。（4）胃肠条件下存活率——通过SGF与SIF中细胞存活计数得出游离干酪乳杆菌较脆弱，SIF条件下3 h后计数为零；游离枯草芽孢杆菌在SGF中存活、SIF中部分存活，消化4 h后无存活；包埋益生菌存活率高于游离细胞，SAW-S对两菌存活率最高，SAW最低，其余体系亦显示高存活率，表明四种体系均提供延长释放与消化期保护。（5）酸奶贮藏期间存活率——通过30 d贮藏每5天计数得出对照商业酸奶初始0.5 × 10⁹ CFU，第5、10、15、20、25、30天分别为0.2 × 10⁹、1 × 10⁸、0.5 × 10⁸、1 × 10⁷、1 × 10⁶、0.5 × 10⁶ CFU；游离枯草芽孢杆菌存活优于游离干酪乳杆菌（p < 0.05），游离干酪乳杆菌4 d时增至3 × 10⁹ CFU，枯草芽孢杆菌5 d时增至2.5 × 10⁹ CFU，10 d后开始下降，30 d时分别為1.1 × 10⁹与1.3 × 10⁹ CFU，表明两菌游离形式均耐受酸奶酸性条件；包埋益生菌存活率更高，枯草芽孢杆菌优于干酪乳杆菌，且均超过游离细胞，SAW与SAW-S中枯草芽孢杆菌30 d存活最高（85–90%），SAW-P与SAW-G亦高（83–85%），干酪乳杆菌以SAW-G与SAW-P存活较优（80–85%），SAW最低（75%）；游离细胞存活亦超过部分国家规定的酸奶最低菌数（≥1 × 10⁷ CFU/g），但包埋具增加贮藏与消化期存活、保存细胞供后续释放、枯草芽孢杆菌主要在肠道释放及减少对酸奶感官特性影响等优势。（6）对酸奶理化特性的影响——通过30 d监测pH、还原糖与蛋白得出对照酸奶pH由4.62降至4.0，含游离益生菌者pH下降10%（4.2–4.3），含包埋益生菌者下降<5%，低pH降幅归因于包埋限制益生菌代谢作用；对照与包埋样品蛋白浓度下降约30%，归因于样品基质对比色反应的干扰及牛血清白蛋白标准与酸奶蛋白行为差异；糖测定的小幅变化可能反映微生物尤其干酪乳杆菌的代谢活性。

讨论与结论总结：讨论部分指出，SEM显示SAW-P结构较文献中SA-P更均匀，归因于乳清的存在；SAW-G与SAW-S孔小且结构致密，利于减少胃酸传输；SAW与SAW-P溶胀 highest，提示水传输优越但过量水分可致胶囊不稳定与快速释放；EDS显示各体系C、N等元素组成相似，可能不影响其益生菌保护能力，但元素组成对胶囊结构及细胞释放、存活与包埋率的影响仍需进一步研究；包埋率与文献中酪蛋白-海藻酸钠等体系（93.17%）及SA包埋芽孢（96%存活）相当；存活数据与明胶/植酸钠包埋枯草芽孢杆菌、羧甲基壳聚糖/聚醛多糖包埋枯草芽孢杆菌、SA/壳聚糖双层包埋双歧杆菌等报道一致；包埋枯草芽孢杆菌在食品中存活率研究有限，难以与其他研究比较，但包埋可增强细胞存活且食品引入亦支持其存活。结论部分翻译：选取两株特性不同的益生菌——一株为具食品应用的发酵型干酪乳杆菌，另一株为具动物饲料应用的枯草芽孢杆菌——研究其在相似微包埋体系（SAW、SAW-P、SAW-G、SAW-S）中的行为，比较其细胞释放能力、消化条件下存活及商业酸奶30 d贮藏中的保存，并评价酸奶样品组成特性以获取游离与包埋形式益生菌影响的信息；因此本研究揭示了枯草芽孢杆菌在其通常存活环境之外环境中的行为。主要结果为：所有微胶囊显示高细胞包埋率（90–94%），益生菌与包埋体系间无显著差异；消化过程中益生菌细胞释放因包埋体系与菌种而异，干酪乳杆菌从SAW与SAW-G的释放主要发生在1 h内（分别35%与25%），随时间释放减少，4 h后SAW-P与SAW-G中仍有25–30%细胞存活；枯草芽孢杆菌最早从SAW-G与SAW释放（1 h，25%），释放能力随时间下降，消化4 h后SAW-S与SAW-G中仍有30–40%细胞存活；包埋益生菌在商业酸奶4 °C贮藏30 d期间细胞保存优于游离细胞，SAW-S与SAW使90%的枯草芽孢杆菌细胞存活，SAW-G与SAW-P使80%的干酪乳杆菌细胞存活；游离细胞对酸奶环境亦有耐受性，仍有1 × 10⁹细胞存活，满足益生功能需要；益生菌的存在引起pH与成分的小幅变化，可能与微生物代谢活性有关。研究表明枯草芽孢杆菌是具高胃环境存活能力的可比微生物，提供另一种益生菌选择，且包埋枯草芽孢杆菌因高存活能力可加入商业酸奶；但仍需更多研究分析枯草芽孢杆菌的其他应用、其益生效应与抵抗力、包埋后的理化变化及加入酸奶或其他食品基质后的感官影响。