全球调控因子DasR对 Streptomyces ambofaciens 中螺旋霉素合成的调控作用研究

《Microorganisms》：Effect of Global Regulatory Factor DasR on Spiramycin Production in Streptomyces ambofaciens

　　

摘要专业翻译 螺旋霉素（Spiramycin）是一种来源于工业菌株 Streptomyces ambofaciens 的大环内酯类抗生素（macrolide antibiotic），其生物合成受转录调控因子（transcriptional regulators, TRs）的调控。DasR作为GntR家族的转录调控因子，参与多种细胞过程。本研究发现，DasR对 S. ambofaciens 的螺旋霉素产量、色素合成及形态发育发挥多效性调控作用。敲除 dasR 可促进螺旋霉素产量并延迟孢子形成，与野生型菌株相比，dasR 敲除株 ΔdasR 的螺旋霉素产量提高33.5%，达到7675.8 mg/L，而过表达 dasR 则增强色素产生。转录组学分析表明，dasR 敲除显著上调了螺旋霉素生物合成、N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine, GlcNAc）分解代谢、乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A, acetyl-CoA）合成及氮代谢相关关键基因的表达。相反，糖酵解途径、菌丝发育、细胞分裂及氧化应激反应相关基因则显著下调。此外，凝胶电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assays, EMSAs）证明，DasR可直接结合关键GlcNAc分解代谢基因（ptsH、nagK、nagA和nagB）及乙酰辅酶A合成酶编码基因（acs），抑制其转录。然而，在螺旋霉素生物合成基因簇中未观察到结合信号。这些结果表明，DasR在体外直接调控GlcNAc分解代谢和乙酰辅酶A生物合成。本研究为通过基因工程改造 S. ambofaciens 以提高螺旋霉素产量提供了新的见解。

论文解读文章

一、研究背景与意义

螺旋霉素是一种16元大环内酯类抗生素，由工业菌株 Streptomyces ambofaciens 产生。其结构由一个I型聚酮合酶（type I polyketide synthase, PKS I）合成的多环内酯环与两个氨基糖（福洛糖胺forosamine和霉糖胺mycaminose）及一个中性糖（碳霉糖mycarose）缀合而成。螺旋霉素自发现以来广泛用于弓形虫感染的治疗，并对某些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑菌活性，且副作用显著少于其他药物，临床应用前景广阔。

S. ambofaciens 的完整基因组已被测序，约8.3 Mb，其中螺旋霉素生物合成基因簇（srm簇）包含41个基因，跨越84 kb区域，其中36个基因参与螺旋霉素生物合成，2个基因调控其合成，3个基因赋予螺旋霉素抗性。尽管螺旋霉素的生物合成过程已被广泛研究，但其作为次级代谢产物，其合成受到转录调控因子（TRs）的多层次调控，这些调控因子之间往往存在复杂的交叉调控关系。TRs可分为特异性调控因子和全局调控因子。目前，对 S. ambofaciens 中螺旋霉素生物合成调控机制的研究相对较少，这成为通过基因工程理性设计高产菌株的障碍。

DasR属于GntR/HutC家族转录调控因子，在模式菌株 Streptomyces coelicolor 中已被广泛研究。作为全局转录调控因子，DasR通过识别16 bp的DasR响应元件（dre）调控基因表达，影响细胞内多种生理过程，包括磷酸转移酶系统（PTS）、几丁质酶、细胞形态分化及抗生素次级代谢等。DasR的DNA结合活性受磷酸化糖类（葡萄糖胺-6-磷酸GlcN-6P和N-乙酰葡糖胺-6-磷酸GlcNAc-6P）调控。DasR在不同物种中的调控作用具有多样性和复杂性：在 S. coelicolor 中，dasR 缺失导致 bald 表型，无法产生气生菌丝和孢子；而在 Streptomyces roseosporus 中，dasR 缺失反而促进孢子形成。在抗生素合成方面，S. coelicolor 中 dasR 缺失显著增加十一烷基灵菌红素（Red）和放线紫红素（Act）的生物合成；而在 Streptomyces cinnamonensis 中，DasR则通过增强单霉素生物合成基因的转录发挥正调控作用。迄今为止，DasR在 S. ambofaciens 中的功能尚未被研究报道。本研究旨在探究全局调控因子DasR对 S. ambofaciens 螺旋霉素产量的影响及其分子机制。

二、主要技术方法

研究人员以 S. ambofaciens CCTCC AA 2017001为亲本菌株，通过同源重组构建了 dasR 敲除株ΔdasR、回补株CdasR和过表达株OdasR。采用高效液相色谱（HPLC）定量分析螺旋霉素产量。利用链特异性RNA-seq技术对野生型（WT）和ΔdasR菌株在发酵24 h、48 h、96 h和144 h四个时间点进行转录组学分析，使用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），使用MaSigPro进行时间序列分析。通过RT-PCR分析螺旋霉素生物合成基因簇的转录单元结构。将DasR蛋白在大肠杆菌中进行异源表达并纯化，利用凝胶电泳迁移率实验（EMSAs）检测DasR与目标基因启动子区域的直接结合。

三、研究结果

3.1 DasR负调控 S. ambofaciens 中的螺旋霉素产量

S. ambofaciens dasR 基因包含765个核苷酸，编码254个氨基酸的DasR蛋白。多序列比对显示DasR在不同链霉菌中高度保守，与 S. coelicolor、Streptomyces lincolnensis、S. cinnamonensis 和 S. roseosporus 的同源物氨基酸一致性分别为99.61%、96.46%、90.51%和89.68%。发酵144 h后比较各菌株螺旋霉素产量，dasR 敲除明显增加螺旋霉素产量，回补 dasR 使产量恢复至WT水平，而过表达 dasR 则使产量略有下降但无统计学显著性。时间进程监测显示，ΔdasR菌株最终螺旋霉素产量达到7675.8 mg/L，比WT高33.5%，且在发酵后期维持高效稳定的螺旋霉素生物合成。在固体平板上，ΔdasR菌株孢子形成在第2天略有延迟，但最终孢子形成正常；OdasR菌株孢子形成提前，第1天即可见孢子。OdasR菌株色素产生提前且颜色随时间加深，而ΔdasR和WT菌株未检测到明显色素。这些结果表明DasR参与 S. ambofaciens 形态分化的调控，并可能作为色素生物合成的潜在激活因子。

3.2 WT和ΔdasR的时间分辨转录组学

对WT和ΔdasR菌株在24 h、48 h、96 h和144 h四个时间点进行RNA-seq分析。时间序列分析鉴定出1172个在时间点和菌株间具有显著差异转录谱的基因，分为9个簇。第4簇基因在ΔdasR菌株中四个时间点均表现出较高表达水平，包括GlcNAc转运和代谢基因（nagA、nagB、nagK、ngcE、ptsH）、氮代谢基因（glnII、gltB）、脂质代谢基因（acs）以及螺旋霉素生物合成途径特异性调控基因（srm22、srm40）。第9簇包含大多数螺旋霉素生物合成结构基因，在ΔdasR菌株中96 h后上调。144 h转录组数据显示，螺旋霉素生物合成涉及的大环内酯环形成、脱氧己糖生物合成以及后修饰和糖基化三个核心途径的基因在 dasR 敲除后几乎普遍上调。在ΔdasR菌株中表达较低的基因涉及中央碳代谢和能量代谢，包括磷酸戊糖途径（zwf、pgl、gnd、tal、tkt）、糖酵解（pgi、pgm）和三羧酸循环（pdhA、lpd、acnA、sdhA、sdhC、sdhD、sucB）相关基因，以及DNA复制、细胞分裂、细胞壁生物合成、氨基酸和核苷酸生物合成相关基因。此外，氧化应激反应相关基因（sigJ、sigR、sigE、sigM）和DNA重组修复基因（recF、recO、recD2、recN、radA、uvrB、uvrC、nth）也下调。时间分辨转录组学分析揭示DasR作为全局调控因子，调控螺旋霉素生物合成、GlcNAc转运和代谢、碳代谢、氮代谢、脂质代谢、转录调控、形态分化和氧化应激反应等多个细胞过程。

3.3 螺旋霉素生物合成基因簇的转录单元组织

通过RT-PCR分析确定了螺旋霉素生物合成基因簇中41个基因的转录组织。13个间隔区域均成功扩增出预期DNA条带，表明srm5、srm6、srm7、srm9、srm10、srm11、srm12、srm14、srm20、srm29、srm30、srm35和srm39与其上游基因共转录。srm3、srm15、srm16、srm17、srm18、srm31、srm32、srm34、srm36和srm37的开放阅读框（ORFs）与各自上游基因的ORFs重叠，也共转录。螺旋霉素生物合成基因簇被提出包含16个转录单元：srm1、srm2/3、srm4/5/6/7/8/9/10/11/12、srm13/14/15/16/17/18/19/20、srm21、srm22、srm23、srm24、srm25、srm26、srm27、srm28/29/30/31/32、srm33/34/35/36/37、srm38/39、srm40和srm41。

3.4 通过EMSAs分析 S. ambofaciens 中DasR的转录调控靶标

利用MEME/MAST预测 S. ambofaciens 中潜在的DasR结合位点，在螺旋霉素生物合成基因簇的srm37、GlcNAc代谢基因（ptsH、nagK和nagB）以及乙酰辅酶A合成酶编码基因acs中鉴定出预测的dre位点。纯化的DasR蛋白在SDS-PAGE上显示约30 kDa的正确条带。基于转录单元分析，制备了12个螺旋霉素生物合成基因簇启动子探针。EMSA结果显示所有探针均未出现明显的迁移位移条带，包括含有预测dre位点的srm37，表明DasR在体外不直接结合螺旋霉素生物合成基因簇。然而，DasR被发现直接结合并调控ptsH、nagKA和nagB（GlcNAc代谢相关基因），以及acs（乙酰辅酶A合成酶编码基因）的启动子区域，产生明显的迁移位移。

四、讨论与结论

DasR在 S. ambofaciens 中发挥双重调控作用，促进色素产生同时抑制螺旋霉素生物合成。dasR 敲除株孢子形成延迟但最终正常，过表达株孢子形成提前，这一表型不同于 S. coelicolor 中DasR对发育的必要性，也不同于 S. roseosporus 中DasR对发育的抑制作用，而与 Saccharopolyspora erythraea 中报道的发育延迟相似，进一步说明DasR介导的形态发育调控在不同链霉菌中的多样性和复杂性。dasR 过表达对螺旋霉素产量的抑制效应相对微弱，研究人员将其归因于ermE*p启动子在 S. ambofaciens 中的中等强度、DasR介导的负自调控限制，以及转录因子结合饱和模型——一旦高亲和力顺式元件被饱和，过量DasR蛋白无法进一步提高靶启动子占有率。

与 S. coelicolor 中DasR直接结合actII-ORF4和redZ不同，本研究中DasR未直接结合螺旋霉素生物合成基因簇。DasR的靶标可分为经典的I类和非常规的II类，I类靶标含有保守的16 bp dre序列，II类靶标缺乏典型dre基序但可能通过辅因子协同作用显示DasR结合。研究人员推测DasR可能通过其他调控机制调控螺旋霉素生物合成，例如结合全局调控基因adpA间接发挥作用，或通过感知胞内效应物（GlcN-6P、GlcNAc-6P和c-di-AMP）的状态变化来调节靶基因表达。EMSA实验的局限性在于DNA探针超过500 bp增加了非特异性结合的可能性，且未包含竞争实验，未来需使用仅含预测dre基序的较短探针进一步验证。

DasR直接抑制ptsH、nagKA和nagB（GlcNAc代谢）以及acs（乙酰辅酶A合成）的转录。解除DasR介导的acs抑制可促进乙酸转化为乙酰辅酶A，为抗生素生物合成提供更多酰基辅酶A前体。glnII（谷氨酰胺合成酶GS）和gltB（谷氨酸合酶GOGAT大亚基）的显著上调使细胞能够充分同化GlcNAc分解代谢产生的氨，确保抗生素生物合成的氮供应。转录组数据显示，尽管GlcNAc代谢增强可能产生更多果糖-6-磷酸（Fru-6P），但整体糖酵解途径减弱，研究人员推测糖酵解节省的碳骨架可能被分流至替代代谢途径。

综上所述，本研究阐明了DasR调控 S. ambofaciens 螺旋霉素生物合成的分子机制。DasR直接抑制GlcNAc代谢关键基因（ptsH、nagK、nagA和nagB）及乙酰辅酶A合成酶编码基因acs的转录，并调控螺旋霉素生物合成基因的表达，从而调控螺旋霉素产量。此外，DasR介导的调控还影响形态发育、细胞分裂和氧化应激反应。该工作不仅丰富了链霉菌次级代谢调控的理论框架，也为通过解除DasR介导的代谢抑制和优化碳氮代谢流来提高螺旋霉素产量提供了新的见解和理论基础。