母乳源粪肠球菌克隆菌株的拮抗活性、基因组特征及益生潜力：一项体外与计算机模拟研究

《Microorganisms》：Antagonistic Activity, Genomic Characterization, and Probiotic Potential of Clonal Enterococcus faecalis Strains Isolated from Human Breast Milk: An In Vitro and In Silico Study

　　

本研究旨在通过体外（in vitro）与计算机模拟（in silico）分析，对从人母乳中分离的四株克隆粪肠球菌（Enterococcus faecalis）进行表征，并评估其微生物学、拮抗、分子、基因组及潜在益生特性。四株分离菌均为革兰阳性球菌，触酶、氧化酶及溶血活性均为阴性，且对头孢噻吩、庆大霉素和四环素表现出表型耐药。菌株对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）表现出拮抗和裂解活性。通过16S rRNA基因测序和平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）分析进行分子鉴定，确认了菌株的种属归属及分离株间的基因组相似性，ANI值超过99%。全基因组分析鉴定出细菌素相关基因，包括Enterocin_96和Enterolysin_A，以及ireK、efrA和dfrE，未发现万古霉素耐药基因的证据。分析还揭示了两条毒力相关基因（asa1和gelE）和少量可移动遗传元件。菌株在模拟胃肠道条件下表现出耐受性，初始接种量约为9 log₁₀ CFU/mL，4 h后菌数维持在≥7 log₁₀ CFU/mL，此外还具有黏蛋白黏附能力和生物膜形成能力。本研究为人母乳微生物群中存在粪肠球菌提供了进一步证据。此外，研究结果提供了与评估人母乳源粪肠球菌菌株在益生菌研究背景下的表型、功能和基因组信息。

**研究背景与意义**
抗菌药物耐药已成为全球公共卫生的重大威胁，据估计2019年与多重耐药菌感染相关的死亡达495万例。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是全球主要致病菌之一，每年导致超过百万例死亡；大肠埃希菌（Escherichia coli）具有高度遗传可塑性，可通过质粒和噬菌体等可移动遗传元件获得耐药基因；单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是病死率高达20%–30%的食源性疾病病原。在此背景下，从不同生态位分离符合联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）标准的乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）并进行鉴定和表征具有重要意义。粪肠球菌（Enterococcus faecalis）因部分菌株具有拮抗病原微生物、胃肠道耐受和黏附等功能特性而受到作为潜在益生菌候选的关注，例如Symbioflor 1中使用的粪肠球菌菌株已作为益生菌商业化应用。然而，粪肠球菌同时也是机会性病原体，可能携带抗菌药物耐药和毒力相关基因，因此其益生潜力必须在菌株水平上通过功能和基因组安全性表征进行评估。人母乳是一个多样化的微生物生态位，对新生儿肠道菌群建立和免疫系统发育具有重要作用。肠-乳腺途径理论提出，肠道腔内细菌可在哺乳期因肠道通透性增加、黏膜免疫系统激活、树突状细胞或巨噬细胞内化以及经肠系膜淋巴结转运至乳腺等机制而移位至乳腺。尽管已有关于人母乳来源乳酸菌和粪肠球菌的研究，但菌株水平的功能和基因组表征仍然必要，因为拮抗活性、安全性和益生潜力等特征即使在同一生态位内具有相同分类学身份的分离株之间也可能存在差异。本研究旨在从人母乳中分离乳酸菌，整合体外与计算机模拟方法，鉴定并表征具有抗菌活性和潜在益生潜力的菌株，依据所选FAO/WHO标准，通过全基因组测序和分析评估其产细菌素潜力并表征抗菌药物耐药、毒力和可移动遗传元件。

**关键技术方法**
研究人员从一名健康成年哺乳期妇女哺乳第13天采集360 mL人母乳样本，经冻干处理后复苏分离菌株。采用斑点- lawns法（spot-on-the-lawn assay）评估拮抗活性，采用无细胞上清液裂解活性检测结合原位活性酶谱（in situ activity zymograms）分析裂解蛋白。通过16S rRNA基因测序进行分子鉴定并构建系统发育树。采用Illumina鸟枪法测序（Illumina shotgun sequencing）进行全基因组测序，使用SPAdes进行de novo组装，通过PGAP和Prokka进行注释，利用BAGEL4预测细菌素基因簇，CARD数据库鉴定耐药基因，VFDB数据库鉴定毒力相关基因，mobileOG-db鉴定可移动遗传元件，PubMLST进行多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）。此外，通过模拟胃肠道条件评估耐受性，采用黏蛋白黏附实验和结晶紫染色生物膜形成实验评估功能益生特性。

**研究结果**
3.1. 粪肠球菌菌株的分离与表征：从健康女性人母乳中初步分离获得C1-7、C2-7、C3-7、C4-7、C5-7和C6-7革兰阳性分离株。C2-7、C4-7、C5-7和C6-7触酶和氧化酶阴性，呈γ-溶血（无溶血活性），符合乳酸菌典型特征；C1-7和C3-7触酶和氧化酶阳性，被排除后续实验。

3.2. 抗菌药物敏感性：四株粪肠球菌对头孢菌素类（头孢噻吩和头孢噻肟）、庆大霉素和四环素耐药，对氨苄西林和红霉素呈中介或耐药，对环丙沙星、青霉素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶和万古霉素敏感。

3.3. 拮抗活性：四株处于对数期（4 h）的粪肠球菌对病原菌均表现出拮抗活性。C2-7、C4-7和C5-7对大肠埃希菌O103的拮抗活性最高，抑菌圈≥15.17 mm；C2-7对金黄色葡萄球菌ATCC 6538P抑菌圈为14.17 mm；C6-7对单核细胞增生李斯特菌ATCC 15313抑菌圈最小（10.43 mm）。

3.4. 无细胞上清液的裂解活性：4 h培养物无细胞上清液蛋白浓度为352–386 μg/mL。16.5% Tris-tricine凝胶电泳显示12条蛋白条带，相对分子质量9.54–103.02 kDa。与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O103和单核细胞增生李斯特菌共聚凝胶中检测到两条裂解活性条带，相对分子质量分别为19.71 ± 7.77和29.67 ± 9.33 kDa，与17.39 ± 0.15和25.60 ± 0.45 kDa的蛋白条带位置重叠。

3.5. 16S rRNA基因测序分子表征：设计的引物高效扩增目标区域，四株菌16S rRNA基因序列与GenBank中粪肠球菌参考菌株相似性达99%–100%。系统发育树显示四株菌聚为不同分支，与不同生态位来源的参考菌株均不在同一分支。成对进化距离分析显示菌株间替换值为0.0014–0.0035，提示可能的克隆起源，与屎肠球菌（E. faecium）ATCC 6569的差异值（0.0076–0.0091）支持种水平分类区分。

3.6. 全基因组序列分析：四株菌基因组平均大小2,870,020 ± 741 bp，分布于3个contig，GC含量37.5%，覆盖度88X–129.59X。PGAP注释平均鉴定2756.5 ± 1.29个基因，包括2664.25 ± 0.96个蛋白编码序列和67个RNA基因。ANI分析显示菌株间ANI值超过99%，形成紧密聚类，与粪肠球菌参考菌株基因组紧密聚为一组，确认种属归属，而与屎肠球菌和蒙氏肠球菌（E. mundtii）基因组明显分离。

3.7. 产细菌素潜力：BAGEL4分析鉴定出两个细菌素产生相关基因：249 bp基因编码8.9 kDa肠球菌素（Enterocin_96，Class II），1029 bp基因编码37.2 kDa肠球菌素溶素（Enterolysin_A，Class III），二者均位于细菌素生物合成基因簇相关基因组区域。

3.8. 微生物学安全性基因组评估：CARD分析鉴定出三个耐药相关基因：ireK（2157 bp，头孢菌素类）、efrA（1728 bp，ABC外排泵）和dfrE（495 bp，二氨基嘧啶类），表型和基因型均未检测到万古霉素耐药。MLST分析将四株菌 assigned为序列型（sequence type, ST）68。VFDB分析鉴定出asa1和gelE两条毒力相关基因，相似性>97%，分别编码聚集物质和细胞外金属蛋白酶明胶酶；对照菌株粪肠球菌MMH594携带cylA、cylL和esp等更广泛的毒力基因集。mobileOG-db分析鉴定出22条遗传转移相关序列（20条定位于染色体，2条prgZ序列519和837 bp定位于质粒，预测编码信息素结合蛋白）和42条噬菌体相关序列（均位于染色体，包括gp44、gp60、gp34和erf）。

3.9. 功能性益生特性：模拟胃液条件下，pH和暴露时间对存活率有显著影响（p < 0.0001）。pH 4.0时4 h后存活≥7 log₁₀ CFU/mL；pH 2.0时2 h后从8.30 ± 1.18降至1.78 ± 1.06 log₁₀ CFU/mL，4 h后无可检测活菌。模拟肠液条件（pH 8.0，0.1%胰酶，0.3%或0.6%胆盐）下，暴露时间显著影响存活率（p < 0.0001），胆汁浓度及其与时间交互作用不显著，4 h后存活≥7 log₁₀ CFU/mL。黏蛋白黏附实验显示C2-7、C5-7、C6-7和阳性对照乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）ATCC 8042黏附率分别为62.32%、59.92%、61.18%和62.05%，C4-7为58.82%，总体单因素方差分析显著（p = 0.04814），但Tukey多重比较未发现组间显著差异。生物膜形成实验显示四株菌在聚苯乙烯表面形成强生物膜（OD₅₉₅ 0.35–0.49），在玻璃表面形成中等生物膜（OD₅₉₅ 1.05–1.30），菌株间无显著差异；乳酸片球菌ATCC 8042在两种表面均形成强生物膜，在玻璃表面与其他菌株差异显著（p < 0.01）；屎肠球菌ATCC 6569在聚苯乙烯和玻璃表面分别形成中等和弱生物膜。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究从单一母乳样本中分离的四株粪肠球菌在表型和基因组分析中展现出拮抗、裂解、胃肠道耐受、黏蛋白黏附和生物膜形成等特性。与既往研究比较，Javed等报道母乳来源粪肠球菌HM-Q31对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）ATCC 27853抑菌圈为12.00 ± 0.58 mm；本研究中四株菌对数期培养物对三种病原菌均表现拮抗活性，抑菌圈最大达16.00 ± 0.13 mm。酶谱分析检测到的约17 kDa裂解活性蛋白此前未见粪肠球菌中报道，约25.60 kDa蛋白与噬菌体衍生内溶素LysEF-P10（约26 kDa）大小相当。全基因组组装指标与粪肠球菌SN21-3基因组（2.9 Mb，GC含量37.5%）相当，ANI值>99%支持菌株间克隆关系。细菌素基因Enterocin_96编码83个氨基酸的II类肽，通过改变细胞质膜促进孔道形成和跨膜电位崩溃发挥活性；Enterolysin_A编码343个氨基酸的III类蛋白，具有肽聚糖水解结构域，通过细胞壁降解发挥对革兰阳性菌的裂解活性。安全性方面，表型耐药与基因组发现之间存在差异（庆大霉素和四环素表型耐药但未检测到aph(2″)或tet基因），与Cisneros等报道的乳酸菌表型-基因型差异一致，提示可能涉及内在耐受机制而非可移动遗传元件获得的耐药基因。ST68未被列入高风险肠球菌克隆复合体。asa1和gelE虽为毒力相关基因，但有研究提示其可能间接促进细菌持续存在和宿主环境互作。可移动遗传元件分析中，检测到prgZ基因单独存在不足以证明水平基因转移， conjugación需要多个调控和结构基因协同参与。pH 2.0条件下菌株存活率显著下降与Han等报道一致，pH 4.0和模拟肠液条件下维持≥7 log₁₀ CFU/mL与Sonei等报道的奶酪来源粪肠球菌在模拟肠液条件下3 h维持6–7 log₁₀ CFU/mL一致。黏蛋白黏附率58.82%–62.32%，Hanifeh等采用离体模型报道粪肠球菌对十二指肠黏膜的黏附高于屎肠球菌。生物膜形成虽未纳入益生菌评价指南，但具有双重意义：既可能是侵袭感染的风险因素，也可能是某些益生菌菌株的理想特性，有助于黏膜黏附、胃肠道持续存在和产生具有潜在益生元效应的胞外多糖。总体而言，四株克隆粪肠球菌展现出拮抗、裂解、胃肠道耐受、黏蛋白黏附和基因组特征的有趣组合，但耐药和毒力相关基因及可移动遗传元件的存在强调需要谨慎评估其安全性和功能特性，需进一步基因组、功能和体内评估以确定其作为潜在益生菌菌株的安全性和适用性。研究结论指出，对四株人母乳来源克隆粪肠球菌的整合表型、功能和基因组表征揭示了拮抗和裂解活性、胃肠道耐受、黏蛋白黏附及与功能性和安全性评估相关的菌株特异性基因组特征的组合。这些发现属临床前研究，支持人母乳作为具有益生菌研究相关特性粪肠球菌菌株的来源，同时强调在菌株水平进行全面安全性评估的重要性。 deposited于GenBank-NCBI的全基因组序列为母乳来源粪肠球菌的比较和功能基因组研究提供了额外资源。进一步整合安全性、益生功能和宿主互作评估的深入研究对于确定所选菌株作为潜在新型益生菌候选的适用性至关重要。研究局限性包括：四株表征菌株均来自单一健康哺乳期妇女单次哺乳时间点的单份母乳样本，结果不应推广至其他供体或哺乳阶段的人母乳粪肠球菌群体；功能表征仅通过体外培养实验完成，未进行动物或临床验证；需要涉及多个独立供体和哺乳阶段以及体内和临床方法的研究来确认可重复性、安全性和潜在益生特性。