壳聚糖包覆PLGA纳米粒持续递送表没食子儿茶素没食子酸酯及其在HepG2与HepaRG细胞中的差异性细胞毒性研究

《International Journal of Nanomedicine》：Chitosan-Coated PLGA Nanoparticles for Sustained Delivery of Epigallocatechin Gallate and Differential Cytotoxicity in HepG2 and HepaRG Cells

　　

摘要 表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是一种绿茶儿茶素，具有公认的抗增殖活性，但其半衰期短且在生理介质中稳定性差，限制了其应用。本研究旨在开发壳聚糖包覆的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA）核壳结构纳米粒作为EGCG递送载体，并评估壳聚糖壳层对其在肝癌细胞和非致瘤性肝细胞中的释放动力学及浓度-效应行为的影响。 方法：采用乳液溶剂蒸发法在0.5、1和1.5 wt%的名义载药量下制备EGCG负载PLGA纳米粒，随后进行壳聚糖包覆。采用场发射扫描电子显微镜（field-emission scanning electron microscopy，FE-SEM）表征形貌和粒径，傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy，FTIR）表征化学组成，紫外-可见光谱（UV-Vis spectroscopy）测定磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）中长达30天的EGCG释放行为。释放曲线分别拟合至零级、一级、Higuchi和Korsmeyer-Peppas模型。采用MTT法在人肝细胞癌HepG2细胞和非致瘤性肝HepaRG细胞中评估代谢活性至第5天，并将浓度-效应数据拟合至Hill模型。 结果：未包覆和壳聚糖包覆颗粒的平均直径分别为117 ± 8 nm和144 ± 6 nm，估算干壳层厚度为13.5 ± 5.0 nm。壳聚糖壳层的应用将前24小时突释从25.7%降低至10.3–15.6%，并将释放曲线延长至第25至27天达到平台期。包覆制剂的释放行为最佳符合Higuchi模型，Korsmeyer-Peppas指数为0.55–0.63，表明为非Fickian（反常）转运，而未包覆参比的n = 0.46表明为Fickian转运。包封效率为85.2–88.8%，在1 mg mL?1的纳米粒浓度下对应的递送EGCG剂量为4.26–12.98 μg mL?1。HepG2代谢活性呈浓度依赖性降低，第5天降至未处理对照的26.4 ± 1.8%，对应73.6%的生长抑制，拟合IC??为8.2 μg mL?1。在相同剂量范围内，HepaRG活性保持不低于92.4%，未达到IC??（>13 μg mL?1）。无药载体在两种细胞系中均无细胞毒性。 结论：EGCG负载PLGA纳米粒上的壳聚糖壳层抑制了突释并将转运机制从Fickian转变为反常型，产生持续释放至第27天。所得制剂以浓度依赖性方式降低HepG2代谢活性，同时使HepaRG活性保持在ISO 10993–5细胞毒性阈值之上。

论文解读

一、研究背景与问题

癌症是全球主要致死病因之一。传统癌症治疗手段包括手术、激素治疗、放疗和化疗，但这些方法存在成本高、治疗化合物半衰期短、化疗药物溶解度差、毒性严重及副作用众多等局限。天然化合物因其高生物活性、低成本和轻微副作用，已成为癌症治疗的有前景的替代方案。其中，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）作为绿茶中主要的健康相关成分，在体外和体内研究中均显示出抗癌活性，并得到临床研究的支持。然而，EGCG稳定性差、半衰期短，限制了其临床应用。因此，亟需开发能够提高EGCG稳定性并维持治疗有效局部浓度的递送策略。

聚合物纳米载体药物递送系统为改善抗癌药物的递送行为提供了有效途径。已有研究开发了EGCG负载PLGA纳米粒用于肺癌治疗，但缺乏主动肿瘤靶向配体；叶酸肽修饰的EGCG负载PLGA纳米粒虽改善了细胞靶向性，但包封效率相对较低且缺乏完全刺激响应性释放机制；PEG化EGCG负载PLGA纳米粒可改善胶体稳定性和延长释放，但PEG化主要贡献于空间稳定和免疫逃逸，不能确保强细胞黏附或受体介导的肿瘤定位。截至目前，尚无EGCG递送系统能同时实现高包封效率、防止过早降解、持续释放并显著抑制初始突释。研究人员假设构建壳聚糖包覆PLGA核壳纳米粒系统可显著减少传统PLGA-EGCG制剂的初始突释并延长释放期，同时在剂量范围内对肝癌细胞产生浓度依赖性代谢活性降低，同时使非致瘤性肝细胞保持在可接受细胞毒性阈值之上。

二、研究内容与结论

研究人员采用乳液溶剂蒸发法制备了EGCG负载PLGA纳米粒，随后用壳聚糖包覆，系统表征了颗粒形貌、尺寸、化学组成、释放动力学及在HepG2和HepaRG细胞中的代谢活性。研究得出以下主要结论：颗粒呈球形，包覆前平均直径117 ± 8 nm，包覆后144 ± 6 nm，估算干壳层厚度13.5 ± 5.0 nm，处于有利于肿瘤蓄积的尺寸范围；包封效率达85.2–88.8%，对应载药量0.43–1.30 wt%；壳聚糖壳层将24小时突释从25.7%降至10.3–15.6%，释放期延长至第25至27天达到平台期，包覆制剂释放符合Higuchi型曲线，Korsmeyer-Peppas指数0.55–0.63表明反常非Fickian转运，而未包覆参比n = 0.46为Fickian行为，持续阶段释放速率接近恒定（2.6–3.1%/天）；制剂以浓度依赖性方式将HepG2代谢活性降至第5天未处理对照的26.4 ± 1.8%（73.6%抑制），拟合IC??为8.2 μg mL?1，而HepaRG活性保持不低于92.4%，高于ISO 10993–5的70%阈值，未达到IC??；无药载体在两种细胞系中均无效应，表明观察到的响应归因于递送的EGCG剂量。该研究首次报道了同时实现高包封效率、防止过早降解、持续释放且显著抑制初始突释的EGCG递送系统，为肝癌治疗提供了有前景的纳米递送平台。

三、关键技术与方法

本研究主要采用以下关键技术方法：乳液溶剂蒸发法制备EGCG负载PLGA纳米粒，采用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）表征形貌和粒径，傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析化学组成，紫外-可见光谱（UV-Vis）测定PBS中长达30天的EGCG释放行为并将释放曲线拟合至零级、一级、Higuchi和Korsmeyer-Peppas四种动力学模型，MTT比色法评估人肝细胞癌HepG2细胞（来源于美国典型培养物保藏中心，ATCC）和非致瘤性肝HepaRG细胞（来源于法国Biopredic International）的代谢活性，采用Hill（对数-逻辑）模型拟合浓度-效应关系。MTT实验进行一次，每个样本和时间点设三个技术重复孔，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验。

四、研究结果

结构表征：FE-SEM显示未包覆PLGA-EGCG纳米粒平均直径117 ± 8 nm，呈球形、均匀形貌和光滑表面；壳聚糖包覆后平均直径144 ± 6 nm，表面相对光滑。壳聚糖层厚度由两种平均直径之差估算为13.5 ± 5.0 nm。FTIR光谱中检测到EGCG、PLGA和壳聚糖的所有特征峰，证实药物成功包封于PLGA纳米粒内且壳聚糖涂层有效沉积于纳米粒表面。随EGCG载药量增加，3381和1410 cm?1处特征峰强度增加，表明EGCG掺入量增加。多数特征带仅发生轻微峰位移，表明EGCG与载体材料之间无显著化学反应。

药物释放分析：释放曲线呈三相模式，初始有限突释后进入滞后阶段，随后持续缓慢释放。未包覆PLGA-EGCG前24小时突释为25.7%，壳聚糖包覆制剂为10.3–15.6%。包覆制剂在第27天达到平台期（99%），未包覆制剂在第25天达到平台期。包封效率为85.2–88.8%，在1 mg mL?1纳米粒浓度下对应EGCG剂量4.26–12.98 μg mL?1。包覆制剂的突释值随载药量增加而升高，归因于高载药量时药物更多分布于核心表面和基质最外层区域。动力学拟合显示包覆制剂整体释放最佳符合Higuchi模型，Korsmeyer-Peppas指数0.55–0.63表明反常非Fickian转运，即壳聚糖壳层不仅减缓释放过程，还改变了转运机制，从纯扩散控制转变为壳层扩散与壳层水化、松弛及核心渐进溶蚀的耦合机制。持续阶段包覆制剂接近恒定释放速率（2.6–3.1%/天），接近零级释放。

细胞代谢活性：HepaRG细胞中，所有制剂在1 mg mL?1纳米粒浓度（对应最高12.98 μg mL?1 EGCG剂量）下暴露5天均未显著降低代谢活性，与EGCG对非致瘤性肝细胞低细胞毒性的既往报道一致。HepG2细胞中，无EGCG的PLGA-Chi纳米粒不降低活性，PLGA-Chi-0.5EGCG产生轻微降低，PLGA-Chi-1.5EGCG在第1天将活性降至35.1 ± 0.2%，第5天降至26.4 ± 1.8%，对应73.6%生长抑制。加权Hill拟合得到IC??为7.8 μg mL?1（Hill斜率2.5），未加权拟合为8.2 μg mL?1（Hill斜率2.6）。HepaRG细胞在最高剂量12.98 μg mL?1时仅测得7.6%抑制，未达到IC??（>13 μg mL?1）。在匹配剂量12.98 μg mL?1下，HepG2抑制73.6%对比HepaRG抑制7.6%，响应差异达9.7倍。时间依赖性降低与释放行为一致，支持持续细胞暴露于EGCG是持续代谢响应的合理贡献因素。

五、讨论与结论

讨论部分指出，壳聚糖包覆制剂在24小时突释（10.3–15.6%）和释放持续时间（约27天）方面均处于文献报道的有利释放模式范围内。与既往研究相比，本研究的HepG2代谢活性降低幅度与叶酸功能化EGCG负载PLGA纳米粒（约48%第1天活性）、EGCG负载阿拉伯胶-麦芽糊精纳米粒（约60%第3天活性）及PLGA-酪蛋白核壳纳米粒负载紫杉醇和EGCG（约38%第3天活性）等报道处于同一量级，但各研究在细胞系、暴露时间、纳米粒浓度和递送剂量方面存在差异，比较应视为情境性而非定量性。

结论部分的核心发现包括：颗粒呈球形，包覆前平均直径117 ± 8 nm，包覆后144 ± 6 nm，壳层厚度13.5 ± 5.0 nm，处于有利于肿瘤蓄积的尺寸范围；包封效率85.2–88.8%，载药量0.43–1.30 wt%；壳聚糖壳层将24小时突释从25.7%降至10.3–15.6%，释放期延长至25至27天，包覆制剂符合Higuchi型曲线，Korsmeyer-Peppas指数0.55–0.63表明反常非Fickian转运，持续阶段释放速率2.6–3.1%/天；制剂以浓度依赖性方式将HepG2代谢活性降至第5天26.4 ± 1.8%（73.6%抑制），IC??为8.2 μg mL?1，HepaRG活性保持不低于92.4%，高于ISO 10993–5的70%阈值，未达到IC??；无药载体在两种细胞系中均无效应。研究同时指出局限性：作为概念验证研究，壳聚糖涂层的表面性质和结构特征等表征尚需进一步完善，且未包含无细胞纳米粒加MTT对照，无法完全排除纳米粒对显色测定的潜在干扰，因此活性结果应在此局限背景下解读。