Bosphore? HBV定量试剂盒与Aptima? HBV定量检测法在HBV DNA检测与定量中的分类一致性与定量一致性评价

《Microorganisms》：Evaluation of the Bosphore HBV Quantification Kit: Categorical and Quantitative Agreement with the Aptima HBV Quant Assay for HBV DNA Detection and Quantification

　　

准确的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA定量对于评估病毒复制和监测抗病毒治疗至关重要。这项回顾性方法学比较研究利用130份残留匿名乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）血浆标本（包括110份对照阳性标本和20份对照阴性标本），评估了Bosphore? HBV定量试剂盒与Aptima? HBV定量检测法的性能。分类一致性采用阳性一致性百分比（positive percent agreement，PPA）、阴性一致性百分比（negative percent agreement，NPA）和总一致性百分比（overall percent agreement，OPA）进行评估，而定量一致性则采用预设的±0.5 log10 IU/mL标准、Bland-Altman分析、Passing-Bablok回归和Lin's一致性相关系数（concordance correlation coefficient，CCC）进行评价。PPA为100%（110/110；95%置信区间[confidence interval，CI]，96.70–100.00%），NPA为95.0%（19/20；95% CI，75.13–99.87%），OPA为99.23%（129/130；95% CI，95.79–99.98%）。观察到一例经确认的分类不一致结果。总体而言，109/110对配对数值结果（99.1%；95% CI，95.04–99.98%）落在±0.5 log10 IU/mL范围内。Bland-Altman分析显示平均偏倚为+0.124 log10 IU/mL，Passing-Bablok回归得到Y = 0.107 + 1.019X，Lin's CCC为0.991。在所评估的HBV DNA浓度范围内，Bosphore检测法与对照方法显示出高度的分类一致性和定量一致性，支持其在本次研究所评估的分析工作流程中用于定量HBV DNA检测的潜在适用性。

论文解读：Bosphore^? HBV定量试剂盒与Aptima^? HBV定量检测法的一致性评价

研究背景与研究目的

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍是全球慢性肝病的主要原因之一，与肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的进展密切相关。尽管已有高效疫苗，但由于筛查、诊断、治疗可及性等方面的持续不足，HBV仍构成沉重的全球健康负担。HBV是一种小型嗜肝包膜病毒，属于嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae），其基因组为约3.2 kb的部分双链松弛环状DNA。HBV持续感染的一个主要特征是形成共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），作为稳定的核内储存库，是实现病毒清除的关键障碍。HBV还具有显著的遗传异质性，至少可分为A至J十个基因型，不同基因型的地理分布各异，可能影响传播模式、慢性化程度、疾病进展及对抗病毒治疗的反应。

实验室诊断在HBV感染管理中至关重要。血清学标志物虽对确定感染状态和免疫谱不可或缺，但不能完全反映病毒复制活性。因此，HBV DNA定量在评估病毒复制、支持治疗决策和监测治疗反应方面发挥着关键作用。准确、灵敏且标准化的定量检测方法对于确保跨实验室和平台的结果可靠性和可比性至关重要，尤其是在纵向随访和治疗监测中。在常规临床实践中，HBV DNA测量用于基线病毒学评估、治疗资格判断、抗病毒反应监测以及病毒学突破或不完全抑制的识别。

定量HBV DNA检测应具备足够的分析灵敏度、宽广的动态范围、全面的基因型包容性以及对国际参考物质的稳健标准化。因此，评估新型分子检测方法对于确定其在常规诊断工作流程中的适用性具有重要意义。在此背景下，本研究旨在评估Bosphore^? HBV定量试剂盒（Anatolia Geneworks，伊斯坦布尔，土耳其）与Aptima^? HBV定量检测法的分类一致性和定量一致性，以验证前者作为替代检测方法的可行性。

研究方法与技术路线

这是一项回顾性配对方法学比较研究，于2024年11月14日至2025年3月14日期间进行。研究对象为来自意大利东北部罗马涅地区（涵盖弗利-切塞纳省、里米尼省和拉文纳省）诊断实验室网络的残留匿名临床标本，这些标本被送至位于皮耶韦塞斯蒂纳（意大利切塞纳）的大罗马涅地区中心实验室微生物科，使用全自动Panther^?系统上的Aptima^? HBV定量检测法进行常规HBV DNA定量。研究人员最终分析了130份EDTA血浆标本，其中包括110份对照阳性标本和20份对照阴性标本。

关键技术方法如下：1）Aptima^? HBV定量检测法（对照方法）：基于实时转录介导扩增（transcription-mediated amplification，TMA）技术，靶向HBV聚合酶基因和表面基因的两个高度保守区域，在全自动Panther^?系统上完成。结果标准化至第三版WHO HBV DNA国际标准（NIBSC代码10/264）。2）Bosphore^? HBV定量试剂盒（待评方法）：基于定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR），靶向HBV S基因保守区域。核酸提取使用UNIO B24提取系统和UNIO病毒DNA/RNA提取试剂盒600 μL，从600 μL血浆中提取，最终洗脱体积为60 μL。扩增检测在Montania^? 4896实时PCR仪上进行。定量标准品校准至第五版WHO HBV DNA国际标准（NIBSC 22/120）。3）统计分析：分类一致性采用阳性一致性百分比（PPA）、阴性一致性百分比（NPA）和总一致性百分比（OPA）评估，95%置信区间采用Clopper-Pearson方法计算。定量一致性采用预设的±0.5 log₁₀ IU/mL标准、Bland-Altman分析、Passing-Bablok回归和Lin's一致性相关系数（CCC）进行评估。

研究结果

3.1 研究标本特征与HBV DNA分布

共纳入130份残留匿名EDTA血浆标本，其中110份为对照阳性，20份为对照阴性。所有130份标本在初次分析中均产生有效且可解释的Bosphore^?结果。对照阳性标本中，Aptima^?检测的HBV DNA浓度范围为12至1×10⁹ IU/mL（1.08–9.00 log₁₀ IU/mL），中位数为2.96 log₁₀ IU/mL（四分位距[interquartile range，IQR]：2.33–3.66）。Bosphore^?试剂盒产生的有限数值HBV DNA输出范围为11.18至1.629×10⁹ IU/mL（1.05–9.21 log₁₀ IU/mL），中位数为3.16 log₁₀ IU/mL（IQR：2.38–3.88）。110份对照阳性标本中，108份Bosphore^?数值结果落在制造商验证的定量测量范围（30 IU/mL至5×10⁹ IU/mL）内，另有2份低于定量下限（lower limit of quantification，LoQ）的软件生成估计值被保留用于配对分析。

3.2 分类一致性与不一致结果

初次分析中，130份标本中有129份在两个检测方法间呈现一致的分类结果。PPA为100%（110/110；95% CI：96.70–100.00%），NPA为95.0%（19/20；95% CI：75.13–99.87%），OPA为99.23%（129/130；95% CI：95.79–99.98%）。两项指标均超过预设的90%接受阈值。观察到一例不一致结果：一份Aptima^?阴性标本在Bosphore^?检测中产生晚期阳性扩增信号（Ct值35.69，估计HBV DNA浓度为39 IU/mL）。经重复检测后，不一致性持续存在，确认为经确认的不一致结果。在该队列中，阳性预测值为99.10%（110/111；95% CI：95.08–99.98%），阴性预测值为100%（19/19；95% CI：82.35–100.00%）。

3.3 主要定量一致性

所有110份对照阳性标本均产生有限数值HBV DNA输出，纳入配对方法学比较分析。总体而言，109/110对配对数值结果落在预设的±0.5 log₁₀ IU/mL一致性区间内，定量一致率为99.1%（精确95% CI：95.04–99.98%），满足至少90%配对标本落在该区间的预设接受标准。唯一超出阈值的标本（标本76）的Bosphore^?结果为84,480 IU/mL（4.927 log₁₀ IU/mL），Aptima^?结果为23,145 IU/mL（4.364 log₁₀ IU/mL），符号差为+0.562 log₁₀ IU/mL。

3.4 定量一致性的探索性表征

Passing-Bablok回归得到拟合方程Y = 0.107 + 1.019X（X为Aptima^? log₁₀ HBV DNA浓度，Y为Bosphore^? log₁₀ HBV DNA浓度），斜率估计值为1.019（95% CI：0.994–1.052），包含1；截距为0.107 log₁₀ IU/mL（95% CI：0.007–0.196），不包含0。Bland-Altman分析显示平均Bosphore-Aptima差异为+0.124 log₁₀ IU/mL（95% CI：+0.079至+0.170），95%一致性限范围为?0.345至+0.594 log₁₀ IU/mL。Lin's CCC为0.991（95% CI：0.987–0.994）。按病毒载量分层分析显示，所有配对结果在<2 log₁₀ IU/mL（13/13）、2–<3 log₁₀ IU/mL（47/47）和≥5 log₁₀ IU/mL（16/16）类别中均落在±0.5 log₁₀ IU/mL范围内，而在3–<5 log₁₀ IU/mL类别中，34对中有33对（97.1%）符合定量一致性标准。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究表明Bosphore^? HBV定量试剂盒在定性结果和定量测量方面与Aptima^? HBV定量检测法高度一致。观察到的平均偏倚幅度（+0.124 log₁₀ IU/mL）与既往商业HBV DNA定量检测方法比较研究的结果一致，表明尽管存在小的系统性正偏差，但整体一致性良好。Bland-Altman一致性限（?0.345至+0.594 log₁₀ IU/mL）提示个体标本间的差异可能大于平均偏倚，这在结果接近临床决策阈值或解读微小纵向变化时尤为重要。因此，研究强调，在可行的情况下，个体患者的监测应使用相同的检测方法和分析平台；如需更换方法，HBV DNA浓度的微小变化可能与所用平台有关，不一定代表真实的生物学变化。

研究的局限性包括：单中心回顾性设计，仅使用EDTA血浆标本和特定的提取扩增配置；仅使用一种商业对照方法（Aptima^? HBV定量检测法）；对照阴性组仅含20份标本，导致NPA估计精度低于PPA；标本匿名化导致无法获取详细的临床信息和基因型数据；缺乏独立第三方方法解决单一分类不一致问题。未来多中心研究应包括更大规模、更多样化的标本集合、已知基因型的样本以及额外的对照平台。

研究结论：在本研究所评估的EDTA血浆标本中，Bosphore^? HBV定量试剂盒与Aptima^? HBV定量检测法显示出高度的分类一致性和定量一致性。所有对照阳性标本均被Bosphore^?检测法检出，109/110对配对数值结果落在预设的±0.5 log₁₀ IU/mL范围内。两种方法间观察到较小的正平均差异，这与不同定量分子平台间预期的分析变异一致，并未实质性影响整体一致性。综上所述，这些发现支持Bosphore^? HBV定量试剂盒作为本研究所评估分析工作流程中HBV DNA定量的潜在可靠替代方案。进一步的多中心研究，包括更大规模、更多样化的标本收集、已知基因型的样本以及额外的对照平台，将有助于确认这些发现的普适性。