《Microorganisms》：Isolation and Characterization of a Bovine Viral Diarrhea Virus Subgenotype 1b Strain from Diarrheal Cattle in Inner Mongolia, China
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牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是威胁全球养牛业的主要病原体，造成严重的经济损失。在中国，BVDV广泛流行，其中BVDV-1是主要的循环基因型。本研究从内蒙古呼和浩特某奶牛场腹泻犊牛的血清样本中，通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Madin-Darby牛肾
牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是威胁全球养牛业的主要病原体，造成严重的经济损失。在中国，BVDV广泛流行，其中BVDV-1是主要的循环基因型。本研究从内蒙古呼和浩特某奶牛场腹泻犊牛的血清样本中，通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Madin-Darby牛肾（MDBK）细胞分离和中和试验，成功分离并鉴定了一株致细胞病变效应（CP）型BVDV毒株，命名为BVDV-HH03。随后进行的全基因组测序和系统发育分析将该分离株鉴定为BVDV-1b亚基因型，其与1990年在美国分离的BVDV-1 Nebraska毒株核苷酸同源性最高（>99%）。初步的犊牛感染实验表明，在该实验条件下，BVDV-HH03表现出低致病性。两组2月龄犊牛通过鼻内-口腔联合途径接种BVDV-HH03，每头犊牛接种7 mL，两组分别接受滴度为106.5或107.5 TCID50/mL的病毒液。在为期14天的监测期内，未观察到接种犊牛出现明显的临床症状或发热。然而，所有感染犊牛在接种后8天（dpi）的监测期内均出现外周血白细胞计数下降，最大降幅超过40%；通过RT-PCR检测，低剂量和高剂量接种组分别有3/5和4/5的动物检测到病毒血症。本研究首次在内蒙古地区分离到BVDV-1b，为BVDV的防控以及BVDV-1b流行病学和致病性的进一步研究提供了宝贵数据。
研究背景与目的
牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是导致牛病毒性腹泻（BVD）的病原体，这是一种对全球畜牧业生产造成严重经济损失的接触性传染病。BVDV感染可导致牛只发热、肠炎、呼吸障碍、繁殖失败及白细胞减少症，同时引起免疫抑制，增加对其他病原体的易感性。BVDV属于黄病毒科瘟病毒属，为单股正链RNA病毒，基于遗传和抗原变异可分为BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3三个基因型。其中BVDV-1在全球范围内广泛分布，尤其在亚洲地区流行率较高，并可进一步细分为至少25个亚型。在中国，BVDV-1是主要流行的基因型，涵盖多个亚型，而BVDV-2和BVDV-3仅有零星报道。由于BVDV的高度遗传多样性导致病毒抗原谱持续变化，给可靠的诊断和有效的疫苗防控带来了巨大挑战。尽管已有研究在内蒙古地区分离出BVDV-1d和BVDV-2b等亚型，但此前尚无关于该地区BVDV-1b亚型分离株的报道。因此，本研究旨在从内蒙古呼和浩特腹泻犊牛中分离并鉴定BVDV毒株，明确其基因型和生物学特性，并评估其对犊牛的致病性，为该病的防控提供基础数据。
主要技术方法
研究人员从内蒙古呼和浩特某奶牛场的8头腹泻犊牛采集血清样本。通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行BVDV检测，阳性样本经0.22μm滤膜过滤后接种于Madin-Darby牛肾（MDBK）细胞进行病毒分离，连续盲传三代，并通过观察致细胞病变效应（CPE）和病毒中和试验（VNT）进行鉴定。采用Illumina NovaSeq 6000 PE150平台进行全基因组测序，并使用SPAdes和SOAPdenovo软件进行从头组装。利用MEGA 11软件中的最大似然法构建基于完整基因组的系统发育树，以确定分离株的基因亚型。此外，研究人员还进行了重组分析和氨基酸序列比对。为评估毒力，将13头BVDV抗原和抗体阴性的健康荷斯坦犊牛分为高剂量感染组、低剂量感染组和对照组，通过鼻内-口腔联合途径接种病毒，并在14天内监测临床体征和直肠温度，在8天内分析外周血白细胞计数和血清病毒RNA水平。
研究结果
3.1 BVDV的分离与鉴定
研究人员通过RT-PCR从8份血清样本中检出4份BVDV阳性。选取其中一份体积最大的阳性血清接种MDBK细胞，连续盲传三代，每代均在接种后4-5天观察到典型的CPE。病毒中和试验显示，BVDV抗体阳性血清在稀释度≤1:256时可完全中和病毒，阻止CPE产生，证实了分离到的病原为BVDV。第三代细胞培养上清液的RT-PCR检测也获得了预期的特异性条带，表明成功分离到BVDV，并将其命名为BVDV-HH03。一步生长曲线测定结果显示，该毒株在MDBK细胞上的滴度在感染后72小时达到峰值，为108 TCID50/mL。
3.2 BVDV-HH03的基因组特征与系统发育分析
全基因组测序获得BVDV-HH03近全长基因组序列，长度为12,297个核苷酸（nt），包含一个11,697 nt的单一开放阅读框（ORF）。BLAST分析显示，该毒株的全基因组、ORF编码序列和3'非翻译区（UTR）均与1990年在美国分离的非致细胞病变型BVDV-1b Nebraska毒株同源性最高（>99%）。然而，其5'UTR部分区域与一株2022年中国分离的BVDV-1毒株CNIM-2202同源性更高。重组分析提示BVDV-HH03可能源自这两个亲本毒株之间的重组事件。氨基酸序列比对发现，BVDV-HH03的多聚蛋白与Nebraska毒株之间存在36个氨基酸替换。系统发育分析证实，BVDV-HH03与多株BVDV-1b参考毒株紧密聚类于同一独立单系分支，确认为BVDV-1b亚型。
3.3 犊牛感染实验
在为期14天的监测期内，接种高剂量和低剂量BVDV-HH03的犊牛均未出现明显临床症状，直肠温度维持在正常生理范围（38.0-39.5°C）。血液学分析显示，接种组犊牛的外周血白细胞计数在病毒感染后逐渐下降，于3-4天达到最低点，最大降幅约40%，之后逐渐恢复；而对照组白细胞计数波动轻微。RT-PCR检测结果显示，高剂量组5头犊牛中有4头在3-4天检测到病毒血症，并于8天转为阴性；低剂量组5头犊牛中有3头在3-4天检测到病毒血症，并于7天转为阴性。对照组始终为阴性。这些结果表明BVDV-HH03能在大多数感染动物中诱导病毒血症，但在本实验条件下表现为亚临床感染。
讨论与结论
讨论部分指出，BVDV-1是中国的主要流行基因型，此前北方和东部地区的调查显示BVDV-1a、1m和1c是优势亚型，但其他亚型如BVDV-1b仍有零星检出。本研究在内蒙古分离到BVDV-1b是该地区的首次报道，结合此前在该地区分离到的BVDV-1d和BVDV-2b，表明当地流行毒株具有显著的遗传多样性。有趣的是，BVDV-HH03与美国1990年分离的Nebraska毒株同源性最高，这与河北、天津等地近期分离的BVDV-1b毒株与美国古老毒株高度同源的现象相似，提示中国BVDV-1b毒株的起源可能与进口牛只、胎牛血清、精液或胚胎有关，亟需更全面的流行病学证据。虽然BVDV-HH03分离自临床发病牛只，但实验感染并未引发明显临床症状，这可能是因为原始病牛存在与其他病原的共感染。研究也指出了自身局限性，包括样本量小、观察期短、缺乏组织病理学检查等，未来需要更深入的研究来全面评估其致病性。
结论部分翻译：总之，本研究成功从内蒙古某牛场分离并鉴定了一株致细胞病变型BVDV-1b毒株。全基因组分析显示，该分离株与1990年在美国分离的一株毒株核苷酸同源性最高。初步的犊牛感染实验表明，该分离株毒力较低。这些发现为BVDV感染的防控以及BVDV-1b流行病学和致病性的进一步研究提供了有价值的数据。
