紫花苜蓿品种特异性种子内生菌及其与盐胁迫下萌发的关联

《Microorganisms》：Cultivar-Specific Seed Endophytes in Medicago sativa and Their Association with Germination Under Salt Stress

　　

紫花苜蓿（Medicago sativa）的建植常受土壤盐渍化限制，尤其在萌发阶段。种子相关微生物可能影响植物表现，但品种相关的种子内生菌群落及其与盐胁迫下萌发的关系尚不清楚。本研究评估了5个紫花苜蓿品种在0、100和150 mM NaCl条件下的萌发情况，并将源自赛沃（Saiwo）的种子内生微生物悬液应用于盐胁迫下的格利特（Gleat）种子。通过16S rRNA和ITS扩增子测序对细菌和真菌群落进行表征，并在非盐条件下检测可培养细菌的植物促生特性。赛沃在100 mM NaCl下表现出较高的萌发率，且赛沃种子来源的悬液显著提高了格利特在盐胁迫下的萌发。假单胞菌门（Pseudomonadota）在细菌群落中占主导地位，Liberibacter为赛沃中最丰富的属，而Pantoea在格利特和Vegron中富集。真菌群落以子囊菌门（Ascomycota）为主，Fusarium、Alternaria和Cladosporium为主要属，Penicillium在赛沃中富集。分离获得的菌株主要属于Bacillus、Erwinia、Kocuria、Leclercia和Pantoea，在Ashby无氮培养基上可生长，具有铁载体产生能力以及解磷和解钾能力，但这些特性未在盐胁迫条件下评估。上述结果表明，品种相关的种子内生菌群落与盐胁迫下的萌发相关，赛沃种子来源的悬液具有改善盐渍土壤中紫花苜蓿萌发的潜力。

**研究背景与问题**

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是豆科多年生饲草，因其高营养价值、消化率及对畜牧生产的贡献而在全球广泛种植。然而，土壤盐渍化严重限制了其饲草品质和生产力。全球盐渍化土壤面积超过8亿公顷，由灌溉、排水不良、海水入侵和气候变化等因素引起。盐胁迫通过渗透胁迫、离子毒害和氧化胁迫影响植物，在种子萌发阶段尤为严重——高盐降低水分吸收、延迟种子吸胀，从而限制代谢重启并降低萌发率和萌发速度。尽管植物自身具有渗透调节、离子区隔化、抗氧化防御和激素调控等应对策略，植物相关微生物也被日益认为是宿主胁迫响应的重要贡献者。种子内生菌可能是最先与宿主互作的微生物，可通过调节IAA等激素途径、增强养分可利用性（固氮、铁载体产生、解磷解钾）等机制影响种子休眠和萌发时间，并能提高植物的耐盐性。然而，关于紫花苜蓿种子微生物组，特别是品种特异性种子内生菌群落及其与盐胁迫下萌发的关系，仍存在关键知识空白。研究人员据此提出假设：紫花苜蓿品种间种子内生菌群落存在差异，且源自相对耐盐品种的种子内生微生物悬液可改善盐敏感品种在盐胁迫下的萌发。

**研究开展与结论**

研究人员首先评估了5个紫花苜蓿品种（赛沃7号、Vegron、Gibraltar、Gleat和新牧4号）在0、100和150 mM NaCl下的萌发情况，确定100 mM NaCl为后续详细比较和内生菌介导萌发试验的盐胁迫剂量。其次，利用16S rRNA和ITS扩增子测序表征种子内生细菌和真菌群落的多样性、结构和组成。第三，从表面消毒种子中分离可培养细菌并评估其植物促生特性。第四，用源自赛沃或格利特的种子内生微生物悬液处理格利特种子，评估在0和100 mM NaCl下的萌发。研究结论表明：赛沃在100 mM NaCl下萌发率较高，其种子来源的内生微生物悬液显著改善了盐敏感品种格利特在盐胁迫下的萌发；种子内生菌群落存在品种间差异，真菌群落组成差异显著；分离菌株在非盐条件下表现出多种植物促生特性，但其耐盐机制未在盐条件下评估。该研究建立了品种特异性种子微生物组与宿主耐盐性之间的联系，为利用有益种子内生菌可持续改善盐渍土壤中紫花苜蓿建植提供了科学依据。

**关键技术方法**

研究人员采用的主要技术方法包括：（1）种子萌发试验，在0、100和150 mM NaCl下于人工培养箱中培养7天并记录萌发；（2）16S rRNA基因V5–V6高变区（引物799F/1115R）和真菌ITS区（引物ITS1F/ITS2R）扩增子测序，基于Illumina NovaSeq 6000平台PE300测序；（3）生物信息学分析，包括DADA2降噪、ASV聚类、Alpha多样性（Chao1、ACE、Simpson、Shannon）、Beta多样性（NMDS、PERMANOVA、ANOSIM、MRPP）、LEfSe差异物种分析和PICRUSt2功能预测；（4）种子内生菌分离纯化（LB、R2A、TSB培养基）及16S rRNA鉴定；（5）植物促生特性检测，包括Ashby无氮培养基生长、CAS琼脂铁载体产生、Aleksandrov培养基解钾、NBRIP培养基无机磷溶解和有机磷培养基溶解；（6）内生菌介导萌发试验，采用种子浸泡法。样本队列来源：赛沃7号、Vegron、Gibraltar、Gleat种子购自北京百斯特草业有限公司，新牧4号由新疆农业大学（乌鲁木齐，中国）培育。

**研究结果**

**3.1 盐胁迫下紫花苜蓿的萌发**：通过0、100和150 mM NaCl下的萌发试验发现，0 mM下各品种萌发无显著差异；150 mM下7天内萌发率低于50%，严重抑制种子生长；100 mM下从第3天起，新牧4号和赛沃的萌发率和速度显著高于其他组，尤其格利特。第7天萌发率分别为新牧4号80%、赛沃86.67%、格利特48.33%、Vegron 63.33%、Gibraltar 78.33%。表明赛沃和新牧4号耐盐性较强，格利特耐盐性最差。

**3.2 紫花苜蓿内生细菌群落的多样性、结构与组成**：通过16S rRNA V5–V6区测序获得707,675条高质量序列，聚类得到804个ASV，分属18门290属。赛沃ASV数量最高，5个品种共有19个ASV，赛沃特有292个ASV。Alpha多样性显示赛沃物种丰富度显著高于格利特和Vegron。NMDS显示赛沃细菌群落与其他品种分离，但PERMANOVA未检测到显著的品种效应（R2=0.33，p=0.145）。门水平上假单胞菌门在各品种中占主导（87.61%–99.12%），放线菌门为次要优势门。属水平上Liberibacter在赛沃中占70.69%，Pantoea在格利特（51.14%）和Vegron（52.69%）中为优势属。LEfSe分析发现47个差异显著的生物标志物，赛沃富集类群最多（36个分支）。PICRUSt2功能预测显示赛沃中碳固定和TCA循环等途径显著富集，赛沃和新牧4号中丙酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢等途径上调。

**3.3 紫花苜蓿内生真菌群落的多样性、结构与组成**：通过ITS测序获得716,818条高质量序列，分类为489个ASV，分属6门152属239种。赛沃真菌Simpson指数和ACE指数高于格利特、Vegron和新牧4号。NMDS显示不同品种真菌群落明显分离（stress=0.05），PERMANOVA检测到显著品种效应（R2=0.59，p=0.001）。子囊菌门在所有样品中占主导（92.20%–98.20%）。属水平上Fusarium为最丰富属，Penicillium在赛沃中显著富集（5.92%）。LEfSe显示赛沃富集分支最多（21个），包括Dothideomycetes和Eurotiomycetes。

**3.4 赛沃内生菌促进盐胁迫下萌发**：通过用赛沃或格利特内生菌悬液浸泡处理格利特种子并在100 mM NaCl下萌发发现，0 mM下不同内生菌处理对萌发无显著影响；100 mM下接种赛沃内生菌的种子萌发速度和萌发率显著高于其原生格利特内生菌处理，表明赛沃品种的内生菌具有更强的促萌发效果。

**3.5 内生菌分离与PGR特性**：通过将种子悬液涂布于LB、R2A和TSB培养基分离纯化菌株，赛沃分离6株，新牧4号、格利特、Vegron和Gibraltar各分离10株。16S rRNA鉴定显示分离菌株主要属于Bacillus、Erwinia、Kocuria、Leclercia和Pantoea，与扩增子测序的优势和富集类群对应良好。例如Pantoea在格利特测序中占51.14%，10株中有5株鉴定为Pantoea；Kocuria仅从赛沃和Gibraltar中分离到。

**3.6 分离菌株的植物促生特性**：通过促生特性检测发现，大多数测试菌株在Ashby无氮培养基上可生长，具有解磷或解钾能力。新牧、格利特、Vegron和Gibraltar的大多数菌株表现出较高的解钾能力，其中新牧分离株解钾能力最高。Gibraltar和新牧4号的多株菌在Ashby无氮培养基上生长。格利特、Vegron和Gibraltar的大多数菌株具有铁载体合成能力。菌株S6（Curtobacterium）溶解无机磷，Vegron来源的Erwinia（W5–W10）溶解有机磷。

**讨论部分总结**

讨论部分围绕三个方面展开：（1）物种和品种影响种子内生菌组成——种子内生微生物组以Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes等细菌门及Ascomycota和Basidiomycota等真菌为主，本研究中假单胞菌门在所有品种中占主导（87%–99%），与已有报道的Proteobacteria优势一致；Fusarium、Alternaria和Cladosporium等子囊菌为优势真菌，与先前工作一致。宿主遗传背景是内生菌群落组成的首要决定因素，分离菌株趋势与测序结果一致，这种特异性可能源于宿主对微生物信号的识别和定殖响应。（2）种子内生微生物组在种子萌发中的功能——种子内生菌通过调节IAA等激素途径、增强养分可利用性等直接促生特性影响种子休眠和萌发时间；本研究萌发试验表明接种内生微生物的种子萌发速度显著改善，提示种子微生物组可能影响种子休眠而非活力。（3）赛沃独特内生微生物组促进盐胁迫下萌发——盐胁迫诱导渗透胁迫和不平衡影响种子萌发，接种赛沃种子内生微生物群落的种子在100 mM NaCl下萌发率和速度显著高于其他处理；赛沃种子内生群落可能以潜在促生细菌的显著富集为特征，稀有类群可能贡献于群落稳定性和功能包括耐盐性；但赛沃可培养细菌仅获得6株且未表现主要促生特性，因未设置0.22 μm过滤对照，活微生物与植物代谢物的相对贡献无法区分；Kocuria多次被报道来源于盐碱条件并具有强耐盐性，本研究中仅从赛沃分离到，Methylobacterium、Burkholderia、Cladosporium和Penicillium等类群也与植物促生或盐适应相关，但这些类群的功能作用未在本研究中通过实验验证。

**结论翻译**

盐胁迫严重限制紫花苜蓿的萌发和建植。本研究比较了5个紫花苜蓿品种的萌发表现和种子内生菌群落。赛沃在100 mM NaCl下表现出相对较高的萌发率，其种子来源的内生微生物悬液显著改善了盐敏感品种格利特在盐胁迫下的萌发。种子内生菌群落存在品种间差异，真菌群落表现出显著的组成差异。这些差异与品种相关。分离菌株在非盐条件下表现出多种植物促生特性，包括在Ashby无氮培养基上生长、铁载体产生以及解磷和解钾能力。然而，其耐盐机制未在盐条件下评估。未来需要进行盐条件试验和单菌株接种等工作，以鉴定负责的类群和机制。总体而言，本研究为理解种子内生菌群落与盐胁迫下紫花苜蓿萌发之间的关联提供了基础，并突出了种子相关内生菌在可持续改善盐渍土壤中紫花苜蓿建植方面的潜力。