《Plants》：Genome-Wide Identification of the β-Amylase (BAM) Gene Family in Senna tora and Seven Other Legumes: Characterization of StoBAM6 as a Cold-Responsive Candidate Gene and a Potential Target of StoCBF2
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β-淀粉酶（BAMs）水解淀粉并参与非生物胁迫适应，其中AtBAM3介导拟南芥大部分暂时性淀粉降解；然而，豆科BAM家族的进化及全基因组复制的影响尚未被探究。研究人员在八个豆科基因组中鉴定到92个BAM基因，并将111个BAM蛋白（包括拟南芥和水稻参考序列）划
β-淀粉酶（BAMs）水解淀粉并参与非生物胁迫适应，其中AtBAM3介导拟南芥大部分暂时性淀粉降解；然而，豆科BAM家族的进化及全基因组复制的影响尚未被探究。研究人员在八个豆科基因组中鉴定到92个BAM基因，并将111个BAM蛋白（包括拟南芥和水稻参考序列）划分为四个组，其中亚组II-B包含所有AtBAM3直系同源基因。在决明（Senna tora）中，StoBAM6和StoBAM10形成共线性旁系同源基因对，该基因对不太可能来源于蝶形花亚科特有的复制事件。在4 °C处理下，StoBAM6在1 h内被诱导并在24 h内持续升高，而StoBAM10仅在3 h时短暂升高。StoBAM6表达量与叶片β-淀粉酶活性呈正相关（r = 0.7557，p < 0.001），与淀粉含量呈负相关（r = ?0.7343，p < 0.001），而StoBAM10与β-淀粉酶活性（r = 0.7728，p = 0.75）或淀粉含量（r = ?0.0685，p = 0.77）均无显著相关性。StoCBF2与StoBAM6具有相同的低温诱导表达模式；酵母单杂交实验表明，StoCBF2结合含有DRE核心基序的StoBAM6启动子片段。这些结果表明复制后存在调控分化，鉴定出StoCBF2为StoBAM6的候选上游调控因子，并为决明低温响应淀粉代谢提供了工作模型。
研究背景方面，淀粉代谢对植物生长发育和逆境适应至关重要。在淀粉降解过程中，β-淀粉酶（BAMs）从葡聚糖链的非还原端水解产生麦芽糖，麦芽糖从叶绿体输出至细胞质进行进一步代谢。在低温、高盐等非生物胁迫条件下，麦芽糖还作为渗透保护剂维持叶绿体和细胞膜完整性。BAM介导的淀粉降解也能提高葡萄糖和蔗糖等可溶性糖水平，局部淀粉降解为糖类被认为对低温胁迫响应具有重要意义。然而，豆科植物中BAM家族的全基因组研究及其在低温响应中的作用仍然匮乏，且豆科植物经历了多次全基因组复制（WGD）事件，留下的遗传冗余和亚功能化使功能推断复杂化。决明（Senna tora）属于云实亚科，在蝶形花亚科特有WGD之前已分化，其基因组缺乏该复制事件，且其成熟种子作为中药决明子富含蒽醌类化合物，低温是限制其生长和破坏碳代谢的重要非生物胁迫，但决明中连接低温响应与淀粉代谢的分子机制尚不清楚。因此，研究人员对决明及七个蝶形花亚科物种进行了BAM基因的全基因组鉴定和比较表征，重建了八个豆科基因组中该家族的系统发育关系、基因结构、保守基序和共线性背景，重点关注与AtBAM3最密切相关的决明基因，检测其在不同组织中的表达模式及低温胁迫下的转录响应与β-淀粉酶活性和淀粉含量动态的关系，并通过酵母单杂交实验测试低温响应CBF转录因子与候选基因启动子的结合。
关键技术方法方面，研究人员通过HMMER搜索结合结构域验证鉴定BAM基因家族成员；使用MEGA 12构建邻接法系统发育树；利用TBtools-II进行基因结构分析和MCScanX共线性分析；通过MEME鉴定保守基序；使用PlantCARE预测顺式调控元件；基于公共RNA-seq数据（NCBI SRA登录号SRP159435）分析组织特异性表达；采用RT-qPCR检测基因表达；使用酵母单杂交（Y1H）实验验证转录因子与启动子的结合；通过试剂盒测定β-淀粉酶活性和淀粉含量。植物材料为陕西中医药大学药用植物园采集的决明种子，在25 °C/22 °C（昼/夜）、16 h光照/8 h黑暗、光照强度9000 lx条件下培养，4 °C进行低温处理。
研究结果方面，2.1 BAM家族成员的鉴定与表征：在八个豆科物种中鉴定到92个BAM基因，大豆含有约2.5倍于其他物种的BAM基因数，与大豆谱系额外的全基因组复制一致；MCScanX将大豆15对、花生11对、蒺藜苜蓿和决明各2对BAM基因对分类为WGD/片段性复制，决明中StoBAM6和StoBAM10为其中一对。2.2 系统发育分析：111个BAM蛋白分为四个组（I-IV），亚组II-B中StoBAM6和StoBAM10与AtBAM3聚类，提示二者为决明中最可能的AtBAM3直系同源基因。2.3 理化性质与亚细胞定位预测：111个BAM蛋白长度从222 aa到1332 aa不等，亚组II-B多数成员预测定位于叶绿体或叶绿体类囊体膜。2.4 基因结构分析：各组外显子数目差异显著，亚组II-B以四外显子构型为主（17/20；85%）。2.5 保守基序分析：核心基序排列Motif 10-3-2-7-6-5-9-4-1-12-13-8存在于所有四个组的大部分成员中。2.6 StoBAM启动子顺式调控元件分析：共鉴定69种顺式调控元件类型，StoBAM6启动子中检测到DRE核心基序（CCGAC），而StoBAM10启动子中未检测到。2.7 StoBAM基因组织表达：StoBAM6和StoBAM10在叶片样本中转录丰度最高。2.8 StoBAM6对低温处理的快速响应：StoBAM6在1 h显著诱导并持续至24 h，StoBAM10仅在3 h短暂诱导；StoBAM6转录丰度与叶片β-淀粉酶活性正相关（r = 0.7557，p < 0.001）、与淀粉含量负相关（r = ?0.7343，p < 0.001），StoBAM10与二者均无显著相关性。2.9 亚组II-B中AtBAM3-like同源基因的基因结构与局部共线性：StoBAM6和StoBAM10各含五个外显子，编码蛋白与AtBAM3约70%氨基酸一致性，保留BAM蛋白四个特征性结构；StoBAM6与七个豆科物种及拟南芥同源区域保持共线性。2.10 StoCBF2作为StoBAM6候选上游调控因子的鉴定：鉴定到四个CBF基因，StoCBF2在低温下从1 h起显著上调并持续至24 h，与StoBAM6表达模式相似；Y1H实验表明StoCBF2可结合含DRE核心基序的StoBAM6启动子片段，而不结合缺乏该基序的StoBAM10启动子片段。
讨论部分总结：BAM基因家族在淀粉代谢和植物环境胁迫响应中发挥重要作用，WGD/片段性复制比串联复制对豆科BAM基因家族扩张的贡献更大。系统发育分类与拟南芥、白三叶、石榴等物种的报道基本一致，表明主要BAM谱系在豆科物种分化之前已建立。AtBAM3直系同源基因的低温响应功能在多个物种中已得到充分记录。决明中StoBAM6和StoBAM10为AtBAM3-like基因，二者构成WGD/片段性复制对，其低温响应表达模式的分化与复制后调控分化一致，StoBAM6可能保留了AtBAM3的低温响应角色，而StoBAM10可能进化出更受限的功能。StoBAM10缺乏DRE核心基序且不与StoCBF2结合，其短暂诱导可能依赖其他顺式元件。StoBAM6转录丰度与β-淀粉酶活性和淀粉含量的显著相关性支持其作为强低温响应候选基因。Y1H实验支持StoCBF2作为候选上游转录因子，但由于Y1H为异源系统，需在植物体内进一步验证。研究结论翻译：本研究对八个豆科基因组中的BAM基因家族进行了比较分析。在决明中，StoBAM6和StoBAM10被鉴定为形成共线性旁系同源基因对的重复AtBAM3-like基因，该基因对不太可能来源于蝶形花亚科特有的WGD。两个基因表现出不同的低温响应表达模式。StoBAM6被低温快速且持续诱导，其转录丰度与叶片β-淀粉酶活性正相关、与淀粉含量负相关。相比之下，StoBAM10仅表现出短暂的低温响应，与两个重复基因之间的调控分化一致。StoCBF2同样被低温强烈诱导，编码的StoCBF2蛋白在酵母中结合含有DRE核心基序的StoBAM6启动子片段。这些发现鉴定StoBAM6为与β-淀粉酶活性和淀粉含量相关的低温响应候选基因，并提示StoCBF2可能作为StoBAM6的上游调控因子。需要进一步的遗传学和植物体内启动子实验来确定它们在耐寒性中的作用以及StoBAM6与StoBAM10之间分化的功能意义。
