《Plants》：A Cotyledon-Derived Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation System for Regenerating Transgenic ‘Carrizo’ Citrange Plants
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柑橘遗传转化体系对作物的遗传改良和功能研究至关重要。与常规的根癌农杆菌（A. tumefaciens）介导的转化相比，发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的柑橘转化能够高效、快速地获得转化根组织。然而，该体系中合适的外植体和转化条
柑橘遗传转化体系对作物的遗传改良和功能研究至关重要。与常规的根癌农杆菌（A. tumefaciens）介导的转化相比，发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的柑橘转化能够高效、快速地获得转化根组织。然而，该体系中合适的外植体和转化条件仍需进一步优化，以获得充足的纯净转化根，这是后续再生芽进而获得稳定转基因植株的前提条件。本研究建立了一套整合的子叶来源、发根农杆菌介导的毛状根转化与植株再生体系，适用于‘Carrizo’枳橙。子叶和上胚轴外植体均可诱导产生转化毛状根；但在各自优化条件下，子叶外植体表现出更高的毛状根诱导率和毛状根转化效率。研究人员确定3 h乙酰丁香酮（AS）预诱导时间、30 min侵染时间和0.1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）浓度为子叶转化的最优条件，毛状根诱导率、GFP阳性毛状根频率和毛状根转化效率分别达到平均值69.22 ± 3.13%、74.21 ± 1.08%和51.36 ± 1.99%。转化毛状根进一步通过愈伤组织介导的再生途径再生出芽，随后通过微嫁接和后续嫁接恢复完整植株。最终成功获得再生植株并完成分子验证。本研究报道了一套高效的发根农杆菌介导的柑橘转化与再生体系。
柑橘（Citrus）是世界范围内经济上最重要的果树作物之一，对全球水果产业贡献显著。柑橘常规育种在很大程度上受限于其较长的童期、多年生生长习性和复杂的遗传背景，这些因素制约了重要农艺性状的快速改良。因此，高效的遗传转化技术对于直接导入优良性状以及实现基于基因组编辑的作物改良至关重要。尽管柑橘生物技术已取得显著进展，但稳定高效转化体系的建立在该物种中仍具有挑战性。常规柑橘转化体系主要基于根癌农杆菌（A. tumefaciens）介导的转化，该体系已在多种柑橘基因型（包括‘Carrizo’枳橙）中实现了转基因植株的获得，并促进了与重要农艺性状相关基因的功能研究。然而，该体系受到基因型依赖性响应、再生能力和组织培养限制等因素的制约。作为替代方案，发根农杆菌（A. rhizogenes）介导的毛状根转化已成为植物遗传研究的有价值方法。通过Ri质粒介导的T-DNA转移，发根农杆菌诱导产生遗传转化的毛状根，可快速生成并用于遗传研究。与常规整株转化方法相比，毛状根系统为获得遗传修饰组织提供了快速高效的平台，并已在包括柑橘在内的多种植物物种中成功应用。然而，这些系统通常局限于转化根组织，当需要在整株水平评价基因功能时其应用受到限制。Irigoyen等建立了柑橘毛状根平台，用于高通量鉴定抗Candidatus Liberibacter spp.的抗菌物质，展示了毛状根在宿主-病原互作研究中的潜力。随后，Ramasamy等开发了从转化毛状根再生的策略，获得了稳定的转基因柑橘株系。然而，充足转化毛状根的生产和芽再生的可重复性仍是限制因素，凸显了进一步优化发根农杆菌介导的柑橘转化体系的必要性。外植体选择和转化条件是影响发根农杆菌介导转化体系效率的关键因素。在柑橘中，不同外植体来源已被用于发根农杆菌介导的毛状根诱导和再生。Irigoyen等使用成熟柑橘植株的单节芽条组织，而Ramasamy等采用组织培养来源的上胚轴外植体和健康柑橘芽进行毛状根诱导和植株再生。由于外植体发育状态和细胞感受态是影响毛状根转化效率和再生能力的重要因素，探索替代外植体来源可能为改善柑橘转化体系提供新机遇。子叶外植体已被报道为发根农杆菌介导转化和植株再生的合适材料，表明其建立替代转化体系的潜力。此外，基于子叶的毛状根诱导体系已在大豆、辣椒和棉花等多种植物物种中成功建立，展示了幼嫩子叶组织强大的再生能力和转化潜力。因此，鉴定具有高再生潜力的合适外植体来源（尤其是幼嫩外植体）对于提高发根农杆菌介导转化体系的效率和可重复性具有重要意义。除外植体选择外，转化条件也是影响发根农杆菌介导转化体系效率的关键因素。T-DNA转移效率受多种参数影响，包括乙酰丁香酮（AS）预诱导时间、侵染时间和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）浓度。优化侵染条件和培养参数对于提高毛状根转化效率同时维持外植体在发根农杆菌介导转化过程中的活力至关重要。在柑橘中，发根农杆菌介导的毛状根系统已实现快速功能分析，包括基因过表达、基因组编辑和分子表征。当基因功能涉及地上组织、发育性状、代谢产物生产、抗病性或植物-环境互作时，仍需要稳定转基因植株进行整株功能评价。因此，从转化毛状根恢复再生芽是扩展发根农杆菌介导转化应用超越根系分析的重要步骤。尽管Ramasamy等展示了从转化柑橘毛状根恢复完整植株，但仍需进一步优化再生培养基、激素组合和毛状根材料选择以提高该过程的效率和可重复性。在先前报道的发根农杆菌介导柑橘转化和再生体系基础上，本研究旨在建立和优化一套高效、快速、简便的柑橘转化体系，作为常规方法的替代方案，使用‘Carrizo’枳橙子叶外植体并将毛状根转化与整株恢复相衔接。本研究建立了整合的基于子叶的发根农杆菌介导毛状根转化与再生流程。该体系将转化毛状根的快速生成与后续稳定转基因植株的恢复相结合，为超越常规转化方法的柑橘功能研究提供了替代策略。本研究的贡献在于通过建立基于子叶的工作流程，扩展了现有柑橘毛状根转化与再生体系的外植体选择。研究人员使用子叶作为外植体替代上胚轴，并优化了关键转化参数（包括AS预诱导时间、侵染时间和2,4-D浓度）以提高毛状根转化效率。此外，建立了结合愈伤组织诱导、芽再生、微嫁接和植株恢复的再生策略以获得稳定转基因柑橘植株。
研究人员开展的研究及结论：本研究成功建立了一套整合的子叶来源、发根农杆菌介导的毛状根转化与植株再生体系，适用于‘Carrizo’枳橙，并证明子叶外植体在优化条件下表现出高于上胚轴的毛状根诱导率和转化效率，转化毛状根可通过愈伤组织介导途径再生出芽并经嫁接恢复为完整稳定转基因植株。重要意义：该体系衔接了快速毛状根转化与整株恢复，为柑橘稳定遗传转化和功能基因组研究提供了实用平台，扩展了发根农杆菌介导转化在整株水平功能研究中的应用。
关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员以‘Carrizo’枳橙（Citrus sinensis × Poncirus trifoliata）种子为材料，种子来源于中国重庆忠县商业果园，经表面消毒后在改良MS萌发培养基上暗培养3周获得黄化苗，再转光周期培养13天后制备子叶和上胚轴外植体。采用含GFP报告基因的pNmGFPer空载体及Cs2g22100过表达载体，通过热激法转入发根农杆菌K599菌株。以单因素优化策略评价AS预诱导时间、侵染时间和2,4-D浓度对毛状根诱导率、GFP阳性毛状根频率和毛状根转化效率的影响。转化毛状根经愈伤组织诱导、芽诱导、芽伸长后，通过微嫁接于黄化苗及后续嫁接于土培根砧恢复完整植株，并进行PCR和RT-qPCR分子验证。
研究结果：（1）子叶基发根农杆菌介导毛状根转化体系的建立与优化——通过单因素优化策略结合GFP可视化筛选，确定3 h AS预诱导时间、30 min侵染时间和0.1 mg/L 2,4-D浓度为子叶转化最优条件，此条件下毛状根诱导率、GFP阳性毛状根频率和毛状根转化效率分别达到69.22 ± 3.13%、74.21 ± 1.08%和51.36 ± 1.99%，过高2,4-D浓度（0.3~0.5 mg/L）促进愈伤组织积累并抑制毛状根发育。（2）上胚轴与子叶外植体毛状根诱导与转化评价——通过比较两种外植体在各自优化条件下的转化表现，发现子叶外植体的毛状根诱导率、GFP阳性毛状根频率和毛状根转化效率显著高于上胚轴外植体（后者分别为14.92 ± 3.22%、60.67 ± 6.54%和8.93 ± 1.29%），且子叶外植体毛状根出现更快；上胚轴在3 h AS预诱导和30 min侵染条件下出现严重细菌过度繁殖，故按先前报道条件转化。（3）从转化毛状根再生与恢复稳定转基因‘Carrizo’枳橙植株——通过GFP阳性毛状根片段经愈伤组织诱导（7~10天约30%片段形成愈伤组织）、芽诱导、芽伸长，14个再生芽经微嫁接和后续嫁接，最终获得6个独立转基因株系和4个空载体对照植株，证明该流程可从发根农杆菌诱导的毛状根恢复再生植株。（4）再生转基因植株的分子验证——通过将Cs2g22100基因导入同一载体骨架，经毛状根转化、芽再生和两轮嫁接后，PCR检测到再生植株中Cs2g22100表达盒的存在，RT-qPCR显示OE_1至OE_6株系中Cs2g22100相对表达量较空载体植株分别提高10.58、8.04、8.96、266.73、56.63和176.04倍，验证了该体系可递送并表达目的柑橘基因。
讨论部分总结：讨论首先指出外植体类型是影响发根农杆菌介导转化体系效率和可重复性的关键因素，子叶和上胚轴为‘Carrizo’枳橙毛状根生产提供互补来源；子叶因其幼嫩发育状态和细胞可塑性表现出更强响应，扩展外植体来源是提高柑橘毛状根转化体系灵活性和效率的有效策略，并指出叶和根段未在本研究中评价。其次，讨论分析了AS预诱导时间、侵染时间和2,4-D浓度优化对提高再生感受态毛状根产量的作用，AS通过激活农杆菌毒力基因促进T-DNA转移，3 h预诱导显著提高转化效率但延长无额外益处，30 min侵染时间为最优，适宜2,4-D浓度促进毛状根诱导而过高浓度导致愈伤组织过度形成和组织褐化坏死。第三，讨论指出愈伤组织介导再生可实现从转化毛状根恢复稳定转基因柑橘植株，短预再生培养阶段促进毛状根向芽再生转变，但体细胞无性系变异可能性和再生植株遗传保真性需进一步评估，PCR检测表达盒不能完全排除残留农杆菌DNA，建议未来以靶向农杆菌染色体序列的PCR进行筛查；嫁接程序促进再生芽恢复和生长。与常规根癌农杆菌介导转化体系相比，该流程提供替代策略，但涉及多步骤培养再生，其植株恢复和总时间需求的潜在优势仍需直接比较量化。Cs2g22100实验为通过该流程导入和表达目的柑橘基因提供了概念验证。
研究结论翻译：本研究建立了一套整合的发根农杆菌介导的‘Carrizo’枳橙转化与植株再生流程。子叶和上胚轴外植体提供了互补的转化毛状根来源，扩展了后续再生所需转基因根材料的可获得性。AS预诱导时间、侵染时间和2,4-D浓度的优化提高了毛状根诱导和转化表现，同时维持了外植体正常发育。此外，转基因毛状根通过愈伤组织介导途径成功再生出芽，并通过嫁接辅助的植株建立恢复了稳定转基因植株。该整合流程衔接了快速毛状根转化与整株恢复，为柑橘稳定遗传转化和功能基因组研究提供了实用平台。
