塞尔维亚荆芥（Nepeta cataria）精油的化学特征、trans-cis-荆芥内酯的结构表征及初步体外生物活性研究

《Plants》：Chemical Profiles of Serbian Nepeta cataria Essential Oils, Structural Characterization of trans-cis-Nepetalactone, and Preliminary In Vitro Bioactivity

　　

摘要专业翻译 来自塞尔维亚南部和东南部三个野生荆芥（Nepeta cataria L.）种群（NC1–NC3）的精油通过水蒸气蒸馏法获得，并采用气相色谱-氢火焰离子化检测器（GC-FID）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行分析。研究人员从NC1中分离出trans,cis-荆芥内酯（4aα,7α,7aβ-荆芥内酯；NL），并通过核磁共振波谱（NMR）和迭代全自旋分析确定了其构造和相对构型；其绝对构型未予确定。通过与分离并表征的纯化合物共注射，确认了该化合物在各精油谱图中的存在。NL在NC1、NC2和NC3中分别占GC-FID相对峰面积的91.5%、12.9%和87.9%，而NC2含有比例更高的两种额外暂定注释的荆芥内酯组分D（41.0%）和E（16.4%），其构型尚未明确。在探索性体外实验中，研究人员使用无细胞脂质过氧化模型（硫代巴比妥酸-丙二醛法，TBA–MDA法）和胞质分裂阻滞微核试验（CBMN法，对四名男性供体的淋巴细胞进行检测），评估了精油（NC1–NC3）及分离的NL的活性。所有受试样品均抑制了AAPH诱导的脂质过氧化。初步CBMN筛选显示出独特的非单调效应模式：较低浓度（1–2 μg/mL）降低了基线微核频率，而4 μg/mL则导致微核频率升高。这些初步生物学观察结果尚不能确立细胞保护作用或安全性。研究结果记录了所分析的塞尔维亚样品之间显著的化学差异，提示存在复杂的剂量依赖性趋势，需通过独立的细胞毒性测量和更大的供体队列加以验证。

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一、研究背景与科学问题

脂质过氧化（lipid peroxidation, LP）是与生物体氧化应激密切相关的关键过程，可引发铁死亡（ferroptosis），在多种年龄相关疾病中发挥核心机制作用，并参与细胞信号转导。自由基介导的LP产生脂质过氧自由基和氢过氧化物，作为LP传播阶段的主要驱动力，可将初始自由基事件放大为破坏性的、自我维持的链式反应，而抗氧化剂可以阻断或预防这一过程。脂质过氧化诱导的氧化性DNA损伤触发对基因组稳定性至关重要的应答反应，当这些过程失衡时，可能加速病理生理进程，因为氧化性DNA损伤及其导致的致突变过程——染色体畸变和致突变点突变——与衰老、炎症及多种年龄相关疾病（如癌症和神经退行性疾病）的发生发展密切相关。

微核（micronuclei）由有丝分裂过程中未被纳入子细胞核的染色体片段或完整染色体形成，是人类DNA损伤和染色体不稳定性研究中最广泛的生物标志物之一。胞质分裂阻滞微核试验（cytokinesis-block micronucleus assay, CBMN）是标准化的哺乳动物细胞遗传毒性试验，已广泛用于评估环境、职业或生活方式因素导致的遗传毒性暴露，以及遗传易感性和基因组不稳定性相关疾病风险的评估。

近年来，天然化合物和植物提取物的抗氧化治疗潜力受到广泛关注。荆芥属（Nepeta）植物的多种药理活性与其次生代谢产物——精油和黄酮类化合物密切相关。许多荆芥属植物精油以高含量的挥发性环烯醚萜单萜苷元（甲基环戊烷类化合物）——荆芥内酯（nepetalactones）为特征。荆芥内酯在植物与昆虫、植物病原体和邻近植物的复杂相互作用中发挥介导作用，并已知可诱导猫科动物产生短暂行为改变。初步研究提示荆芥内酯可能对人类医学具有药理学意义。

荆芥（Nepeta cataria L.）是荆芥属中分布最广、研究最深入的物种之一，具有悠久的传统药用历史，并具有肝保护、抗糖尿病、抗抑郁、解痉、抗伤害感受和抗炎等特性。然而，现有关于荆芥抗氧化活性的研究几乎完全集中于各种极性溶剂提取物，其活性主要归因于高含量的酚类化合物，而针对荆芥精油活性的研究相对较少。尽管荆芥油的抗氧化特性通常归因于含氧单萜如1,8-桉叶素、芳樟醇或荆芥内酯，但令人惊讶的是，已发表的研究中尚无任何一项实际检验了从荆芥或任何其他荆芥内酯丰富的荆芥属物种中分离的立体异构荆芥内酯的活性。

鉴于荆芥属精油多样的生物学功能、环烯醚萜富集物种的诸多令人鼓舞的研究，以及关于精油/荆芥内酯抗氧化特性文献数据的缺乏，本研究旨在分析和比较塞尔维亚南部和东南部野生荆芥种群的化学特征，并分离纯荆芥内酯，经结构表征后与精油样品一同进行初步生物活性筛选。

二、研究设计与技术方法

研究人员从塞尔维亚南部和东南部三个地点采集了野生荆芥种群的地上部分，分别来自鲁迪纳山（Mt. Rudina）、伊兹沃尔（Izvor）、博西莱格勒（Bosilegrad）（样本NC₁），尼什（Ni?）附近（样本NC₂），以及布什特拉涅（Bu?tranje）、普奇尼亚区（P?inja District）（样本NC₃），于2020年7月盛花期采集，每个地点多个个体植株材料合并为一个混合样本。凭证标本保存于尼什大学（University of Ni?）科学与数学学院植物标本馆（HMN），编号HMN18955–HMN18957。新鲜植物材料采用Clevenger型装置水蒸气蒸馏2.5小时提取精油。

关键技术方法包括：气相色谱-氢火焰离子化检测器（GC-FID）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行精油成分定性与定量分析；柱色谱和制备薄层色谱（preparative TLC）分离纯化荆芥内酯NL；核磁共振波谱（NMR）结合迭代全自旋分析确定NL的构造和相对构型；硫代巴比妥酸-丙二醛法（TBA–MDA法）评估脂质过氧化抑制作用；胞质分裂阻滞微核试验（CBMN法）评估人淋巴细胞微核频率的变化，供体为四名健康非吸烟男性志愿者（平均年龄34岁）。

三、研究结果

3.1 荆芥精油表征与分离荆芥内酯NL的光谱鉴定

GC-FID和GC-MS分析共检测到147种成分，占精油总含量的98.6%–99.7%。从NC₁中通过色谱分离和制备TLC获得150 mg NL，其构造和相对构型经NMR和全自旋分析确定为4aα,7α,7aβ-荆芥内酯（trans-cis-荆芥内酯）。H-4A与H-7A之间异常大的偕偶耦合常数（³J_4A,7A = 15.1 Hz）表明稠环体系内这些质子几乎处于反式共面排列，NOESY数据进一步确定了两个空间相关的质子集合位于分子相对面，支持了该立体化学归属。

NL在NC₁、NC₂和NC₃中分别占GC-FID相对峰面积的91.5%、12.9%和87.9%。NC₂含有更高比例的组分D（41.0%）和E（16.4%），其构型尚未明确，暂注释为荆芥内酯相关成分。倍半萜（E）-石竹烯在NC₁、NC₂和NC₃中分别占2.3%、8.3%和4.0%。萜类组分占总油含量的93.9%–98.8%，其中单萜类占75.8%–94.4%，几乎完全由环状环烯醚萜（iridoids）组成（70.9%–93.0%）。NC₁和NC₃的主要成分谱高度相似，而NC₂中D和E贡献更大、NL贡献更小。

3.2 体外生物学研究

TBA–MDA脂质过氧化试验： 采用基于TBA–MDA法的方法，以咖啡酸和Trolox为阳性对照，评估三种精油样品和纯NL对AAPH引发的磷脂氧化模型中TBA反应信号的抑制作用。精油IC₅₀点估计值分别为NC₁ 102.5 mg/L、NC₃ 160.3 mg/L、NC₂ 272.1 mg/L，但标准误较大，数值排序不能确立各精油间效力的差异。分离的NL的拟合IC₅₀为23.9 mg/L（143.8 μM；95% CI，22.7–25.2 mg/L），而咖啡酸为3.0 mg/L、Trolox为6.3 mg/L。NL抑制了AAPH诱导的脂质过氧化，但弱于作为标准的已知抗氧化剂。

体外胞质分裂阻滞微核（CBMN）试验： 在培养的人淋巴细胞中评估了精油和NL在1.0、2.0和4 μg/mL三个浓度下对微核频率的影响。NC₁、NC₂和NL在1.0 μg/mL时达到峰值活性，微核频率分别较对照降低30.7%、27.2%和21.9%（p < 0.01）；NC₁和NC₃在2.0 μg/mL时分别降低23.2%和28.3%（p < 0.01）；NC₂在2.0 μg/mL时的效应与氨磷汀（amifostine）相当。相反，所有四种样品在4 μg/mL时均表现出微核频率较对照增加的趋势。CBPI用于评估增殖进展，但该终点本身不能排除细胞死亡或受损细胞的选择性丢失，自发微核频率的降低不能解释为已证实的细胞保护作用或无遗传毒性潜力的证据。

四、讨论与结论

三个来自塞尔维亚南部和东南部的混合荆芥样品在主要精油成分的相对丰度上存在差异。NC₁和NC₃以相同的相对荆芥内酯异构体trans-cis-荆芥内酯（NL）为主，而NC₂含有更大比例的荆芥内酯相关组分D和E。NL的构造和相对构型经NMR和全自旋分析确定，但A、D和E的构型仍未解决。由于每个地点仅检查一个混合样本，结果不能确定稳定的种群化学型（chemotypes），也不能区分遗传和环境对成分变异的贡献。

精油和分离的NL在AAPH/磷脂模型中降低了TBA反应信号，并与培养人淋巴细胞中微核频率的浓度依赖性差异相关。所有四种样品在4 μg/mL时的平均微核频率均高于未处理对照的平均值。精油IC₅₀估计不精确，四供体细胞实验仍属探索性研究。NL对全精油反应的贡献以及淋巴细胞发现的潜在机制尚未确定。研究人员指出，需要进一步对剩余主要成分进行结构表征，并纳入补充细胞毒性终点指标的研究，以阐明这些观察结果。研究结论强调，这些初步生物学观察尚不能确立细胞保护作用或安全性，所发现的复杂剂量依赖性趋势需要独立细胞毒性测量和更大供体队列的验证。