《Italian Journal of Animal Science》：Dietary inclusion of 10% Azolla pinnata leaf meal optimises rabbit growth via gut mTOR downstream target p70S6k1 activation and Enterobacteriaceae suppression
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本研究评估了日粮中添加满江红叶粉（ALM）对生长期家兔生长性能、盲肠发酵特性、肝脏氧化状态、肠道黏膜屏障及胃肠道p70S6K1（核糖体蛋白S6激酶β-1，为雷帕霉素靶蛋白mTOR信号通路的下游靶点）的影响。选取80只断奶雄性V-Line家兔，按体重区组后随机分
本研究评估了日粮中添加满江红叶粉（ALM）对生长期家兔生长性能、盲肠发酵特性、肝脏氧化状态、肠道黏膜屏障及胃肠道p70S6K1（核糖体蛋白S6激酶β-1，为雷帕霉素靶蛋白mTOR信号通路的下游靶点）的影响。选取80只断奶雄性V-Line家兔，按体重区组后随机分配至4个日粮组（n=20/组）：0% ALM（CON）、10% ALM（AZO10）、20% ALM（AZO20）和30% ALM（AZO30）。实验期为45 d。研究人员对生长指标、盲肠挥发性脂肪酸、肝脏抗氧化指标、组织形态学、黏蛋白组织化学、肠道总p70S6K1及磷酸化p70S6K1（P-p70S6K1）表达量以及选定盲肠微生物菌群的基因丰度进行了定量分析。AZO10组采食量最低，且伴随体增重、蛋白质效率比（PER）和相对生长率（RGR）的增加。肝脏代谢物的大部分变化与AZO10组相关，包括GSH:GSSG比值升高、ATP和8-羟基脱氧鸟苷水平降低。添加30% ALM降低了盲肠乙酸盐浓度及乙酸盐:丙酸盐比值。肠道黏蛋白随ALM添加水平的增加呈线性增加。肠道p70S6K1的磷酸化亦随ALM添加水平的增加呈线性增加。饲喂ALM的家兔盲肠肠杆菌科（Enterobacteriaceae）丰度降低。据研究人员所知，这是首次研究ALM诱导的家兔肠道p70S6K1激活及选定微生物丰度变化。总之，日粮中添加不超过10%的ALM可能通过影响mTOR的关键下游靶点p70S6K1而有益于肠道和肝脏健康。
研究背景：兔肉在全球许多地区是重要的生产和消费肉类，亚洲为最大生产区。然而养兔业面临双重挑战：大豆粕等常规蛋白源成本上升，以及断奶后生长期家兔对流行性兔肠病和氧化应激的高度易感性。这促使研究人员寻找功能性、气候友好的饲料资源以替代传统饲料并促进胃肠道健康。满江红是一种水生漂浮蕨类，与固氮菌共生而具备固氮能力，其叶粉（ALM）被视为兼具经济与环境可持续性的饲料原料，且不与人类粮食资源竞争、所需土地较少。ALM含15–35%粗蛋白、约4%脂肪和约12%粗纤维，并富含黄酮类、生物碱、酚类和三萜衍生物等生物活性植物化学物，具有系统性抗氧化、营养感知免疫调节和靶向抗菌活性。此外，替代性植物源性日粮与家兔组织蛋白合成之间的分子机制尚不清楚。在哺乳动物系统中，p70S6K1（核糖体蛋白S6激酶1）作为mTOR（雷帕霉素靶蛋白）的关键下游靶点被磷酸化激活后，可驱动核糖体生物合成和肽链延伸。评估胃肠道连续各段中总p70S6K1和磷酸化p70S6K1（P-p70S6K1）的变化，有助于阐明日粮ALM是诱导局部生理适应还是触发全身组织沉积。家兔因盲肠发达而比鸡更能耐受高纤维，故ALM可在兔日粮中以较高比例添加。研究人员前期报道了ALM对生长期家兔生长性能的影响，发现10% ALM添加时饲料转化率（FCR）改善。因此，本研究评估了日粮添加ALM将刺激局部肠道黏膜生长并通过p70S6K1通路激活mTOR下游翻译信号的假设，目的是研究前期研究中所用的相同梯度ALM添加水平（0%、10%、20%和30%）对生长期家兔生长性能、盲肠发酵动态、肝脏氧化还原稳态、黏膜屏障结构和胃肠道p70S6K1信号的影响，以理解各层面的潜在变化。
主要技术方法：研究人员选用80只30日龄断奶雄性V-Line家兔（来自埃及Benha一商业农场），按初始体重区组后随机分为4组（n=20/组），分别饲喂含0%、10%、20%和30%晒干ALM的等氮等能颗粒日粮，实验期45 d。测定了生长性能指标（体重、采食量、RGR、PER）；采用高效液相色谱（HPLC）测定肝脏谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、三磷酸腺苷（ATP）、8-羟基脱氧鸟苷（8-HDG）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）水平及盲肠挥发性脂肪酸（VFAs）；采用苏木精-伊红（H&E）染色和PAS-阿利新蓝染色进行肠道组织形态学和黏蛋白组织化学分析；采用免疫组织化学（IHC）结合组织芯片技术检测肠道各段总p70S6K1和P-p70S6K1表达；采用16S rRNA提取及定量PCR（qPCR）检测盲肠选定菌群丰度。数据采用SAS 9.4的MIXED程序分析，评估ALM添加水平的线性和二次效应。
研究结果：
生长性能：随ALM添加水平从0%升至30%，总采食量呈线性增加（p<0.01），AZO10组采食量最低，AZO30组最高；体增重、平均日增重、RGR和PER在10%添加水平（AZO10）持续升高，随后随添加水平增加而下降（p<0.01）。
盲肠发酵与挥发性脂肪酸：AZO30组盲肠乙酸盐浓度和乙酸盐:丙酸盐比值降低、丁酸盐升高（p<0.05），丙酸盐在ALM饲喂组呈升高趋势（p=0.09），盲肠pH组间无显著差异。
肝脏氧化状态：AZO10组GSH水平升高、GSSG趋于降低、GSH:GSSG比值升高（p<0.05），ATP、8-HDG和NO在AZO10组最低；MDA在所有ALM饲喂组均较低（p<0.05）。
肠道形态与黏蛋白：AZO10和AZO20组十二指肠绒毛:隐窝比值降低（p=0.01）；各ALM组回肠绒毛长度增加（p=0.01）；日粮ALM增加了十二指肠、回肠和盲肠的酸性及中性黏蛋白面积（p<0.05）。
p70S6K1表达：ALM组十二指肠、空肠、回肠和盲肠中p70S6K1和P-p70S6K1丰度呈线性增加（p<0.05）。
盲肠菌群：Proteobacteria（?纲）丰度在AZO10组最高，肠杆菌科（Enterobacteriaceae）丰度在所有ALM饲喂组均降低（p<0.05）。
讨论与结论：与前期研究一致，ALM对生长性能呈剂量依赖性影响。采食量随添加水平线性增加表明ALM未损害适口性，但超过10%添加水平的采食量增加未正向反映于生长性能，提示低水平（10%）添加优化了营养素同步与代谢效率，而高水平（30%）可能构成容重限制或存在单宁酸、植酸等抗营养因子；过量膳食纤维通过加速食糜流通率或损害营养物质消化率限制可消化能摄入。胃肠道生理变化为ALM支持肠道健康提供了机制解释：AZO10和AZO20组十二指肠绒毛:隐窝比值降低提示上皮细胞更新局部增加或隐窝增生，而各ALM组回肠绒毛一致延长表明远端营养吸收黏膜表面积扩大；十二指肠、回肠和盲肠酸性与中性黏蛋白面积显著增加进一步支持此形态适应，而肠杆菌科可降解肠道黏蛋白，其丰度降低可能解释黏蛋白面积增加。盲肠VFA谱变化方面，AZO30组乙酸盐降低、乙酸盐:丙酸盐比值降低、丁酸盐升高，丁酸盐作为结肠细胞主要能量底物可刺激黏膜细胞增殖、绒毛生长和紧密连接完整性，代表高纤维负荷下维持后肠完整性的局部代偿机制。GSH显著升高及高GSH:GSSG比值表明强细胞氧化还原状态，各处理组MDA持续低水平证明脂质过氧化减轻；MDA与肠杆菌科正相关，AZO10组NO和8-OHdG最低表明全身炎症最小化及基因组DNA免受氧化修饰保护，AZO10组肝脏ATP较低可能表明细胞生物能量从代谢应激反应通路重新分配至该组观察到的外周组织生长。分子水平上，十二指肠、空肠、回肠和盲肠中总及P-p70S6K1丰度线性增加为生长性能阈值提供了精确解释：P-p70S6K1是翻译起始、肽链延伸和核糖体生物合成的主控因子，其持续上调表明ALM中支链氨基酸或特定多酚等生物活性成分主动触发了整个胃肠道局部蛋白合成机制。10%添加水平时该胞内信号与全身体蛋白质效率（PER）和日增重峰值相匹配，表明肠道组织合成与骨骼肌沉积之间达到理想平衡；而更高添加水平（30%）时肠道P-p70S6K1持续线性增加提示大部分吸收氨基酸被局部重新分配以维持肠道，因高水平ALM添加需要增加黏蛋白产生、杯状细胞增殖和黏膜修复以应对高纤维负荷，肠道可能局部消耗这些资源，留给外周骨骼肌肥大的系统性营养减少，从而解释尽管肠壁翻译信号活跃但全身生长性能下降；另一种解释是p70S6K1的渐进性上调可触发强大的负反馈环路使上游生长信号脱敏。研究结论：日粮中添加不超过10%的ALM可支持生产指标、影响盲肠选定细菌（包括肠杆菌科）丰度、通过激活mTOR下游靶点p70S6K1调节肠道蛋白合成并改善生长期家兔肝脏氧化还原状态；更高添加水平益处较不一致且似乎降低生产性能。这些发现提示ALM可作为兔日粮的部分饲料原料，但其最适添加水平不应超过10%。未来研究方面，本研究仅使用雄性家兔（因生长性能研究仅允许使用雄性），未来仍需研究ALM对雌性家兔的影响，并需要对包括mTORC1表达在内的完整信号通路进行详细机制研究。
