VvRALF9–VvFER2模块通过激素信号与转录因子调控介导葡萄盐胁迫响应

《Plants》：VvRALF9–VvFER2 Module Mediates Grapevine Salt Stress Responses Through Hormone Signaling and Transcription Factor Regulation

　　

土壤盐渍化严重限制葡萄产量与果实品质，然而耐盐机制尚不清楚。小分泌肽，尤其是快速碱化因子（RALF）肽，是植物环境胁迫响应的关键调控因子。然而，葡萄（Vitis vinifera L.）RALF基因家族的系统分析尚未开展。本研究在葡萄基因组（PN_T2T）中鉴定出11个VvRALF，并表征其理化性质、结构特征与进化关系。表达谱分析显示，VvRALF9在盐敏感砧木'Beta'根中持续上调，而在耐盐砧木'3309C'中下调。沉默葡萄砧木根中VvRALF9显著增强其耐盐性。蛋白互作实验（包括酵母双杂交、split-LUC和pull-down）鉴定VvFER2为VvRALF9的潜在受体。葡萄砧木根中过表达VvFER2同样提高耐盐性。VvRALF9-RNAi根的转录组分析显示植物激素信号转导通路显著富集，同时转录因子及多个激素信号通路相关基因表达发生广泛变化。综上，这些发现表明VvRALF9–VvFER2模块参与葡萄盐胁迫响应的调控。

土壤盐渍化是限制全球农业生产的重要环境因素之一，盐渍土约占地球陆地面积的7%，接近10亿公顷并持续扩张。过量土壤盐分引起养分失衡、氧化损伤、渗透胁迫与离子毒害，损害植物生长、果实品质与作物生产力。葡萄（Vitis vinifera L.）是经济重要性突出的多年生果树，利用耐盐种质培育耐盐品种与砧木是维持轻中度盐碱地葡萄生产的重要策略，但其耐盐分子机制尚不完全清楚，制约了耐盐相关基因与遗传资源的鉴定和育种利用。植物激素是植物细胞间通讯的核心调控因子，但越来越多证据表明小信号肽是另一类重要的细胞间信号，参与植物生长发育与环境胁迫响应。这类肽一般分泌至细胞外空间，由质膜定位的特异性受体感知，将胞外信号转化为胞内信号响应。在拟南芥中，根源CLE25肽作为长距离干旱信号，通过叶片BAM1/BAM3依赖的信号促进脱落酸（ABA）积累与气孔关闭。FERONIA（FER）是Catharanthus roseus receptor-like kinase 1-like（CrRLK1L）家族成员，作为连接胞外信号与胞内响应的重要信号枢纽，参与植物生长、细胞壁完整性与环境适应。在拟南芥中，FER感知盐诱导的细胞壁完整性扰动并激活细胞特异性Ca²⁺信号，促进盐胁迫下根生长恢复；苹果中MdFER受NaCl和ABA诱导，过表达增强耐盐性，抑制则增加盐敏感性。快速碱化因子（RALFs）是由小开放阅读框（ORFs）编码的富含半胱氨酸的小分泌肽，最初在烟草叶片蛋白的肽类激素筛选中被发现，可使烟草悬浮细胞胞外pH快速升高并激活胞内促分裂原活化蛋白激酶。此后研究表明RALF肽在多种植物中具有多样生物学功能，拟南芥中多个RALF成员调控主根生长、花粉管完整性与生殖信号，部分成员参与环境胁迫响应。尽管RALF基因家族已在多个物种中被鉴定，但葡萄中尚未系统研究，参与葡萄盐胁迫响应的具体VvRALF成员仍 largely 未知。RALF肽的生物学功能常通过与细胞表面受体尤其是FER互作介导。拟南芥中LRX3/4/5–RALF22/23–FER模块在盐胁迫信号中起重要作用：胞外Na⁺增加促进RALF22/23从LRX3/4/5解离，伴随FER内化、FER信号减弱、ABA积累与活性氧（ROS）产生增强，最终增加盐敏感性。其他物种证据也支持RALF相关信号参与盐响应：破坏PpRALF3增强Physcomitrium patens对NaCl和氧化胁迫的耐受性，保守的CqRALF–FER信号系统参与Chenopodium quinoa盐胁迫响应。植物盐响应还受ABA、茉莉酸（JA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）和乙烯（ETH）等多个激素通路及胁迫响应转录网络协同调控。RALF–FER信号与胁迫相关激素响应的既有联系提示激素信号与转录调控可能是RALF–FER介导盐响应的重要下游组分。然而，葡萄根中是否存在功能性RALF–FER调控模块以及该模块如何与下游激素信号和转录调控关联尚不清楚。为此，研究人员对VvRALF基因家族进行全基因组分析，表征其进化、结构与表达特征；比较盐敏感砧木'Beta'与耐盐砧木'3309C'中VvRALFs的盐响应表达模式以鉴定与差异盐响应相关的候选基因；随后选择VvRALF9在葡萄根中进行功能鉴定，研究其与葡萄FER蛋白的互作，并对VvFER2进行功能分析；最后通过RNA-Seq分析探讨与VvRALF9抑制相关的转录变化，重点关注激素信号通路与胁迫响应转录因子（TFs）。本研究旨在阐明VvRALF9–VvFER2模块在葡萄盐胁迫响应中的潜在作用，为葡萄耐盐分子机制提供新见解。

研究人员开展了以下研究：以34个AtRALF蛋白序列为参考，针对葡萄PN_T2T基因组进行BLASTP搜索，经NCBI-CDD和SMART验证RALF结构域，最终鉴定11个VvRALFs（VvRALF1–VvRALF11），并用ExPASy ProtParam计算蛋白长度、分子量（MW）与理论等电点（pI）；用MEGA X构建邻接（NJ）系统进化树（1000次bootstrap），用MCScanX分析基因复制与共线性，用TBtools-II可视化；用GSDS 2.0分析基因结构，MEME鉴定保守基序，PlantCARE注释启动子顺式调控元件；从BAR数据库获取21个葡萄组织的FPKM数据绘制热图。以18月龄扦插'Beta'（Vitis riparia × Vitis labrusca）和'3309C'（Vitis riparia × Vitis rupestris）为材料，每砧木15株、5株混为1个生物学重复、3个重复，单次灌溉200 mmol·L^?1 NaCl处理，于0、6、24、48 h及7、14 d采集新发根段，qRT-PCR以VvUBI为内参、2^?ΔΔCt法计算相对表达。构建VvRALF9-RNAi与VvFER2-OE的pROKII-GFP载体，经Rhizobium rhizogenes K599介导的毛状根转化获得转基因根，GFP筛选并经PCR与qRT-PCR验证；转基因毛状根经200 mmol·L^?1 NaCl处理14 d后进行组织学与生理指标测定。采用酵母双杂交（Y2H）、split-LUC与pull-down验证VvRALF9–VvFER2互作。对EV与VvRALF9-RNAi根（各3个生物学重复）进行RNA-Seq（DNBSEQ平台），SOAPnuke过滤、HISAT2比对T2T参考基因组、RSEM定量FPKM，DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs，|log2FC| ≥ 1且Q ≤ 0.05），并进行GO与KEGG富集分析。

研究结果如下：2.1 VvRALFs的鉴定、系统进化关系与共线性分析。以AtRALFs为参考经BLASTP初获32个候选蛋白，验证保守RALF结构域后最终鉴定11个VvRALFs并按染色体位置命名为VvRALF1–VvRALF11；MW为12.15 kDa（VvRALF1）至14.60 kDa（VvRALF3），蛋白长度110（VvRALF1）至131个氨基酸（VvRALF3），pI为7.54（VvRALF4）至9.50（VvRALF11）。NJ树将34个AtRALFs与11个VvRALFs分为7个组（I–VII），组I和II各含3个VvRALFs，组III至VII各含1个，该分类与拟南芥6组体系不同；VvRALFs不规则分布于7条染色体，染色体近端或远端数量远超中央区域；未检测到串联复制，63.64%（7个基因）涉及5对片段复制；与A. thaliana、N. tabacum、F. ananassa、M. domestica分别鉴定8、3、10、23对直系同源基因对，表明葡萄与M. domestica亲缘最近、与N. tabacum共线性较弱。2.2 VvRALFs的基因、蛋白与启动子结构分析。鉴定3个长度分别为50、20、13个氨基酸的保守基序，同一进化组内基序位置与分布一致：组I、III、V、VI仅含基序1和2，组II含基序1、2、3，组IV和VII仅含基序1。除组IV外各组均含单外显子基因，组IV独特地含3个外显子；除组II和IV中2个基因缺乏非翻译区（UTRs）外，其余基因均具5′-和3′-UTRs。启动子中鉴定出响应MeJA、SA、ABA、生长素和GA的6类激素相关顺式元件，以及4类潜在胁迫相关和5类生长相关顺式元件；主要元件为响应MeJA和ABA的元件及分生组织表达和玉米醇溶蛋白代谢调控相关元件；组I生长与胁迫响应相关元件最丰富，组II激素相关元件最丰富。2.3 VvRALFs在不同组织及盐胁迫下的表达模式。基于BAR数据库21个组织的表达谱将VvRALFs分为4组：A组1个基因除成熟茎和花粉外各组织表达较高；B组4个基因除花粉外多数组织表达升高；C组3个基因除开花和花粉外各组织表达降低；D组3个基因除根外各组织表达降低。盐处理6、24、48 h及7、14 d后，VvRALF9是唯一表达模式与砧木耐盐性相关的成员，在盐敏感'Beta'根中持续上调、在耐盐'3309C'中下调，因其与耐盐性负相关且根特异性高表达被选作进一步功能鉴定。2.4 VvRALF9负调控葡萄砧木根耐盐性。将VvRALF9 RNAi片段克隆入含CaMV 35S驱动GFP的pROKII载体，经R. rhizogenes介导获得VvRALF9-RNAi与空载体（EV）转基因根，GFP荧光筛选并经PCR确认，qRT-PCR验证3个独立VvRALF9-RNAi根系VvRALF9转录水平显著低于EV根。200 mmol·L^?1 NaCl处理14 d后，每组10个独立转基因根作生物学重复（n = 10）进行组织学观察与生理指标测定：盐处理使EV和VvRALF9-RNAi根均出现不同程度结构损伤，但VvRALF9-RNAi根细胞与组织结构相对完整、损伤较轻；EV根MDA、Pro含量、SOD活性、ROS荧光强度与相对电解质渗漏（EL）分别为4.59 nmol·g^?1、5.85 ng·g^?1、26.17 U·g^?1、22,674.46和58.98%，VvRALF9-RNAi根相应值分别为2.14 nmol·g^?1、1.53 ng·g^?1、18.33 U·g^?1、14,887.98和24.71%，均显著低于EV根，表明沉默VvRALF9缓解盐诱导的ROS积累、膜脂过氧化与细胞膜损伤，从而增强葡萄砧木根耐盐性。2.5 VvFER2是VvRALF9在葡萄中的潜在受体并正调控葡萄根抗盐性。葡萄FER全基因组分析鉴定14个VvFERs；Y2H显示共表达BD-VvRALF9与AD-VvFER2的酵母细胞在?Trp/?Leu/?His/?Ade选择培养基上正常生长并变蓝，表明阳性互作；VvFER2 mRNA在盐敏感'Beta'根中不变、在耐盐'3309C'中受盐胁迫上调；split-LUC显示共表达nLUC-VvRALF9与cLUC-VvFER2的烟草叶片出现强荧光素酶活性；pull-down中VvRALF9-His与VvFER2-GST共洗脱，支持直接物理互作。经R. rhizogenes系统获得VvFER2过表达（VvFER2-OE）与EV转基因根并经GFP荧光、PCR与qRT-PCR验证。200 mM NaCl处理14 d后，与EV根相比，VvFER2-OE根MDA含量（2.04 vs. 5.20 nmol·g^?1）、Pro含量（1.38 vs. 6.85 ng·g^?1）、SOD活性（13.66 vs. 22.83 U·g^?1）、ROS荧光强度（11,887.98 vs. 16,140.79）与相对EL（38.04% vs. 75.65%）均显著降低，支持VvFER2在葡萄根耐盐性中的正作用。2.6 EV与VvRALF9-RNAi根间差异表达基因（DEGs）的鉴定。RNA-Seq共鉴定2996个DEGs，其中上调1549个、下调1447个；VvRALF9自身为DEG（log2FC = ?2.7，FDR < 1.0 × 10^?12），证实其在VvRALF9-RNAi根中被成功下调。GO分类显示上下调DEGs主要关联"cell part"和"cell"条目，KEGG分析显示"plant hormone signal transduction"通路显著富集。沉默VvRALF9显著改变多个TF家族表达，ERF家族DEGs最多（39个显著上/下调成员），其次为WRKY（30个）、MYB（27个）、NAC（27个）和bZIP（26个）；所有TF家族中上调基因多于下调基因；尽管ABA依赖的转录调控主要由bZIP的AREB/ABF亚家族介导，但AREB/ABF基因RNA水平在VvRALF9-RNAi与EV根间无差异，提示这些TFs在测试条件下可能不参与对VvRALF9抑制的响应。2.7 沉默VvRALF9改变激素信号相关基因mRNA水平。与EV相比，VvRALF9-RNAi根中6个PYR/PYLs显著上调；2个COI1基因下调而5个JAZ基因表达升高；11个DELLA基因上调；5个TGA基因上调；2个ETR基因、1个EIN3基因和3个ERF1/2基因显著上调。

讨论部分总结：土壤盐分严重限制葡萄生长与生产，但其耐盐分子机制尚不完全清楚；RALF肽是植物生长与胁迫响应的重要调控因子，但在葡萄中尚未系统研究。本研究鉴定11个VvRALF基因并表征其进化关系、基因与蛋白结构、启动子特征及组织特异性表达模式；盐响应表达分析与功能实验鉴定VvRALF9为葡萄根耐盐性的负调控因子，VvFER2为潜在互作受体；转录组分析表明VvRALF9抑制伴随激素信号转导与胁迫响应转录网络的广泛变化，提示VvRALF9–VvFER2模块通过涉及激素信号与下游转录重编程的调控机制参与葡萄盐胁迫响应。系统进化将葡萄RALF家族分为7组，兼具保守与物种特异性特征，组VII为葡萄特有，组I和II组成变异大于组III–VII；葡萄RALF家族仅11个成员，远少于拟南芥34个，无串联复制而存在5对片段复制基因，可能部分解释该家族规模较小；各组内基因结构与保守基序相似，而启动子顺式元件与组织特异性表达差异提示功能分化，启动子中激素、发育与胁迫响应元件的存在支持不同RALF成员被招募至不同调控过程。值得注意的是，与AtRALF22/23进化接近并不直接对应葡萄中的盐响应行为：VvRALF10与AtRALF22/23进化关系最近，其次为VvRALF2和VvRALF4，但这些基因在'Beta'和'3309C'中均未显著响应盐胁迫，尽管其在根中转录丰度较高；相反，与AtRALF22/23关系较远的VvRALF9在根中高表达且在'Beta'中上调、'3309C'中下调，这种进化关系与盐响应表达的脱节提示RALF家族成员被招募至盐胁迫调控在拟南芥与葡萄间可能已发生分化，且VvRALF9在耐盐性相反砧木中的相反表达响应提示其调控可能与基因型依赖的盐适应相关。功能分析支持这一解释：盐胁迫下沉默VvRALF9降低ROS积累、MDA含量与EL，缓解氧化与膜损伤，脯氨酸积累与SOD活性变化进一步反映生理响应改变，结合'Beta'与'3309C'中的相反表达模式，支持VvRALF9在葡萄耐盐性中的负调控作用；这提示葡萄RALFs对盐度的功能贡献不能仅由与拟南芥RALF22/23的序列同源性推断，物种特异性与基因型依赖的调控分化是葡萄RALF介导盐响应的重要特征。RALF肽通常通过与质膜受体互作发挥功能，FER是研究最充分的受体之一；本研究中筛选葡萄FER蛋白鉴定VvFER2为VvRALF9候选互作伙伴，Y2H、split-LUC与pull-down支持其互作，功能分析支持VvFER2在葡萄耐盐性中的正作用：盐胁迫下VvFER2-OE根MDA与脯氨酸积累较低，ROS积累与EL降低，表明缓解盐诱导的氧化与膜损伤；SOD活性在VvFER2-OE根中也较低，结合ROS积累同时减少，该模式可能反映氧化负荷较低因而抗氧化酶活性需求降低，而非抗氧化能力受损。因此，VvRALF9负调控耐盐性而VvFER2与增强抗盐性相关，支持VvRALF9–VvFER2信号模块参与葡萄盐胁迫响应；然而，尽管互作实验证明VvRALF9与VvFER2存在物理结合，仍需进一步生化证据明确其精确的配体–受体关系及连接VvRALF9感知与VvFER2依赖信号的分子事件。第二个重要发现涉及RALF–FER信号与激素调控的关系：拟南芥中RALF22/23–FER模块通过JA、SA和ABA水平变化与盐胁迫响应关联；本研究中VvRALF9-RNAi与EV根DEGs的KEGG富集分析鉴定"plant hormone signal transduction"为显著富集通路，而激素生物合成与代谢相关通路未显著富集，这一差异提示在转录水平上葡萄中VvRALF9抑制相关响应可能主要表现为激素感知与信号转导的重编程，而非激素生物合成或代谢途径转录的广泛变化；因此，尽管RALF–FER信号在拟南芥与葡萄中均与激素调控相关，该连接最显著体现的调控层次可能在物种间存在差异，进一步支持RALF–FER介导的盐响应经历了物种特异性功能分化。与此一致，沉默VvRALF9影响ABA、JA、GA、SA和ETH信号通路的多个组分：ABA信号是植物适应渗透与盐胁迫的核心，VvRALF9-RNAi根中PYR/PYL基因表达升高提示ABA信号组分调控改变；JA通路中2个COI1基因下调与5个JAZ基因上调表明JA信号显著重组，与盐度下根生长调控密切相关；DELLA基因表达升高与GA信号在胁迫适应中的生长限制作用一致，TGA基因表达改变提示SA相关信号参与；ETH信号亦受影响，2个ETR基因、1个EIN3基因和3个ERF1/2基因在VvRALF9-RNAi根中上调。这些协同转录变化并非表明这些基因是VvRALF9的直接靶标，而是提示VvRALF9抑制伴随激素响应信号网络的广泛重组；同时WRKY、bZIP、ERF/AP2、MYB和NAC等主要胁迫响应TF家族差异表达，这些TFs可能提供连接激素信号改变与下游胁迫响应基因表达的额外调控层。综上，结果支持VvRALF9–VvFER2模块参与葡萄根盐响应的作用模型；该模型的一个显著特征是葡萄中鉴定的盐响应RALF成员并非拟南芥RALF22/23的最亲近同源基因，表明RALF介导盐调控在两物种间存在功能分化；此外，VvRALF9抑制主要与激素信号转导组分和胁迫响应TFs的转录变化相关，而非激素生物合成或代谢途径的显著富集。这些发现提示VvRALF9–VvFER2模块可能在葡萄盐适应中协调激素响应信号与下游转录调控；然而，VvFER2与各激素信号组分间的直接分子联系以及这些转录变化反映直接还是间接调控仍有待确定，需整合激素测定、受体信号分析与下游靶标验证的进一步研究完善该调控模型。结论部分翻译：本研究表征了葡萄11个VvRALFs的分子特征与表达模式。结果支持VvRALF9–VvFER2模块参与葡萄盐胁迫响应，并提示该模块可能与激素信号和转录调控的变化相关。这些发现为RALF–FER信号在葡萄盐适应中的潜在作用提供了新见解，并为耐盐葡萄品种的遗传改良提供了理论基础。