《Plants》：Phenolic Profile, Antioxidant Activity, and Wound-Healing Potential of Oenothera rosea and Taxodium mucronatum Extracts
粉红月见草（Oenothera rosea）与蒙特苏马柏（Taxodium mucronatum）在美洲传统上用于伤口愈合，但其生物活性特性仍未充分标准化和科学验证。因此，本研究旨在建立能够最大化粉红月见草与蒙特苏马柏提取物抗氧化潜力的提取条件，表征其酚类成分谱，并在体外评价其生物学效应。采用全因子设计评价提取温度、溶剂和提取时间，以总酚含量和自由基清除能力（DPPH和ABTS）作为响应变量。提取物的酚类成分谱通过UHPLC-PDA-Orbitrap-MS/MS进行表征。通过Griess法测定亚硝酸盐以评估RAW 264.7巨噬细胞中一氧化氮的产生。在标准葡萄糖和高葡萄糖条件下评价成纤维细胞迁移，作为体外伤口愈合模型。采用70%乙醇在60 °C提取24 h获得的提取物表现出最高的总体抗氧化活性。粉红月见草富含酚酸和黄酮类化合物，而蒙特苏马柏主要含有双黄酮和二萜类化合物。蒙特苏马柏显著降低一氧化氮产生，而粉红月见草与对照组相比无显著差异。在标准葡萄糖条件下，两种提取物与阴性对照相比均显著增强成纤维细胞迁移。然而，在高葡萄糖条件下，仅50:50混合物诱导了部分伤口闭合。这些发现支持这两种植物作为伤口管理生物活性化合物来源的潜力。
伤口愈合是一个复杂的生物学过程，涉及四个相互重叠的阶段：止血、炎症、增殖和组织重塑。这些阶段的推进依赖于细胞信号传导、炎症调节和氧化还原稳态之间的受控平衡。活性氧（ROS）的过量产生和持续性炎症可破坏该过程，导致伤口闭合延迟和慢性伤口的形成。这些并发症在糖尿病等代谢紊乱个体中尤为常见，其中血糖升高促进氧化应激，进一步影响细胞迁移、血管生成和细胞外基质沉积。药用植物及其衍生物历史上被用于治疗包括伤口管理在内的多种疾病。在其生物活性成分中，酚类化合物因其抗氧化和抗炎特性而受到特别关注。这些代谢物可清除活性氧（ROS）并调节参与炎症和组织修复的信号通路，包括与一氧化氮调节相关的通路。由于氧化应激和炎症失衡是愈合受损的主要因素，植物来源的多酚已成为促进组织再生的有前景的候选物。因此，鉴定和表征能够支持伤口愈合的生物活性植物化学物仍然是一个活跃的研究领域。粉红月见草（Oenothera rosea L'Hér. ex Ait，异名Hartmannia rosea），俗称粉色月见草或hierba del golpe，以及蒙特苏马柏（Taxodium mucronatum Ten.，柏科），俗称蒙特苏马柏或ahuehuete，根据《墨西哥合众国药典》被认定为具有愈合效果的药用植物。粉红月见草传统上用于治疗瘀伤和伤口。它是一种源自柳叶菜科的美国本土野生植物。它以其抗炎、镇痛和抗菌特性而闻名。先前的一项体内研究证明了粉红月见草提取物应用于大鼠切割伤口上的伤口愈合功效，与对照组相比显示出显著改善的愈合效果；然而，其对氯仿和石油醚等有毒溶剂的依赖需要进一步研究，以验证使用更安全和可获得的替代溶剂获得的提取物的临床适用性。另一方面，蒙特苏马柏有着悠久的传统药用历史，尤其是在墨西哥。其树皮和叶的提取物已证明具有抗炎作用，以及额外的已报道的愈合和抗菌益处。尽管有传统使用和已报道的生物活性，这两种植物在植物化学方面仍未得到充分表征。现有研究仅提供了其次生代谢物的部分描述，且最大化生物活性化合物回收所需的提取条件尚未被系统地研究。由于提取参数强烈影响植物化学成分和生物活性，优化对于开发标准化的植物来源制剂至关重要。此外，代谢组学和高分辨率质谱的最新进展使得能够更全面地表征复杂植物提取物，有助于鉴定可能负责其生物效应的代谢物。因此，本研究的目的是使用全因子设计在实际相关的加工变量范围内确定最大化粉红月见草和蒙特苏马柏抗氧化潜力的提取条件。所选提取物随后通过UHPLC-PDA-Orbitrap-MS/MS进行表征，并评价其抗氧化和抗炎活性以及体外成纤维细胞迁移。作为一项探索性研究，目标是建立植物化学成分与生物活性之间的关联，鉴定有前景的生物活性提取物，并为未来的机制研究生成假设。通过整合提取优化、代谢组学表征和生物学评价，本工作有助于对这些传统使用的植物进行科学验证，并为其在伤口管理中的潜在应用提供基础。
2. 结果
2.1. 总产率
提取产率根据全因子设计中评价的条件对粉红月见草和蒙特苏马柏均有变化（表1）。对于粉红月见草，产率受所有三个自变量（溶剂类型、提取时间和温度）的显著影响（p < 0.05）。使用水的提取物平均产率为117.39 mg/g，而使用70%乙醇的提取物为66.53 mg/g。进行1 h的提取平均产率为75.81 mg/g，而进行24 h的提取平均产率为108.12 mg/g。关于温度，25 °C、40 °C和60 °C的平均产率分别为84.02 mg/g、87.32 mg/g和104.55 mg/g。对于蒙特苏马柏，只有溶剂类型和提取时间对产率有显著影响（p < 0.05）。使用水的提取物平均产率为71.19 mg/g，而使用70%乙醇的提取物平均为91.01 mg/g。持续1 h的提取平均产率为75.75 mg/g，而持续24 h的提取为86.45 mg/g。就温度而言，25 °C、40 °C和60 °C的平均产率分别为78.14 mg/g、79.75 mg/g和85.42 mg/g；然而，这些差异不具有统计学显著性（p > 0.05）。在分析单个运行时，样品24（在60 °C下用70%乙醇提取24 h）的产率为117.3 mg/g，统计学上显著高于（p < 0.05）其余样品。
表1. 不同溶剂、温度和时间条件下粉红月见草和蒙特苏马柏提取物的产率。
这些结果表明，与最大产率相关的提取条件在物种间存在差异，粉红月见草偏好水提取，而蒙特苏马柏偏好水醇提取。
2.2. 总酚含量和体外抗氧化能力
粉红月见草提取物各测定的单独抗氧化活性报告于表2。可以观察到TPC范围为90.9至220.2 mg GAE/g提取物干重。值得注意的是，样品12、4和3表现出显著更高的水平（p < 0.05），TPC值分别为220.2、210.6和203.6 mg GAE/g提取物。在DPPH自由基清除测定中，抗氧化值在45.6至99.0 μmol Trolox/g提取物之间变化，样品12与所有其他样品相比具有显著更高的值（p < 0.05）。对于ABTS清除测定，值范围为140.5至268.4 μmol Trolox/g提取物，其中样品12和11表现出最高的抗氧化活性，分别为268.4和239.2 μmol Trolox/g提取物。先前的研究人员报告了类似的结果，评价了粉红月见草的抗氧化能力，得出乙醇提取物的TPC为135.68 mg GAE/g，水提取物为26.78 mg GAE/g。乙醇和水提取物的DPPH自由基清除活性分别为72.9%和76.97%。在另一项研究中，报告了使用80%甲醇作为溶剂在酸性条件下提取的样品的TPC为65.8 mg GAE/g，DPPH值为615.5 μmol TE/g，ABTS值为438 μmol TE/g。通过总体意愿函数（图1A）获得的粉红月见草最高抗氧化活性是使用70%乙醇在60 °C下提取24 h实现的，对应于样品12（O100）。
表2. 粉红月见草的抗氧化活性测定。
图1. 用算术平均值计算的所有抗氧化能力测定的总体意愿函数。（A）粉红月见草的结果。（B）蒙特苏马柏的结果。柱代表n = 3次独立实验的平均值 ± 标准差。不同字母表示使用Tukey检验（p < 0.05）处理条件之间的差异。
对于蒙特苏马柏，每种处理下获得的单独提取物的抗氧化活性见表3。TPC从70.3至189.6 mg GAE/g提取物变化；样品19与其他样品相比具有显著更高的TPC（p < 0.05）（表3）。对于DPPH自由基清除测定，值范围为30.2至88.8 μmol Trolox/g提取物，样品24、22和20显示出最高值，分别为88.8、83.4和84.1 μmol Trolox/g提取物。ABTS测定结果范围为132.7至316.8 μmol Trolox/g提取物，样品24与其他样品相比表现出统计学上显著更高的值（p < 0.05）。对于蒙特苏马柏，没有直接发表的结果；然而，类似的落羽杉（Taxodium distichum）水提取物的抗氧化活性得出TPC为70.99 mg GAE/g dw，DPPH自由基清除率为13.1%。通过总体意愿函数分析（图1B）确定的蒙特苏马柏抗氧化活性在水提取物中显著低于水醇提取物（p < 0.05），表明抗氧化化合物的回收减少。这种差异可能与水对某些抗氧化成分的较低提取效率有关，以及溶剂渗透和植物基质内传质的差异。
表3. 蒙特苏马柏的抗氧化活性测定。
这些发现表明溶剂对抗氧化活性的影响是物种依赖性的。虽然水醇提取持续增强蒙特苏马柏的抗氧化活性，但粉红月见草的响应受溶剂、温度和提取时间之间相互作用的影响，水提取物在某些提取条件下表现出更高的活性。
2.3. 单个酚类化合物的UHPLC-PDA-ESI-MS分析
分析了在60 °C下用70%乙醇提取24 h获得的粉红月见草提取物，在两个不同波长（280和320 nm）下获得的色谱图见图2A。相关特征使用NIST和MoNA数据库进行初步注释，辅以SIRIUS进行分子式和未知物化合物家族的阐明，得出不同水平的鉴定。这种多工具方法导致了不同的鉴定水平，总结于表4。峰1、6和15是最突出的峰，分别初步鉴定为没食子酸、香豆酸衍生物和槲皮素-3-O-己糖苷。在3至7 min的保留时间范围内还注意到额外的显著峰，展现出多样且化学丰富的次生代谢物谱，特别是酚类化合物和黄酮类化合物。初步鉴定的化合物包括羟基苯甲酸类（如原儿茶酸、没食子酸乙酯）、羟基肉桂酸类（如咖啡酰酒石酸、新绿原酸、4-O-对香豆酰奎宁酸）、各种槲皮素衍生物和其他复杂黄酮糖苷如飞燕草素3-O-芸香糖苷、阿福豆苷和其他黄酮-3-O-糖苷。粉红月见草的植物化学成分谱与先前的报道既有一致性又有扩展。没食子酸、对香豆酸和槲皮素衍生物等化合物先前已在该物种中描述。然而，本分析揭示了更广泛的羟基苯甲酸、羟基肉桂酸和黄酮糖苷的多样性。同样，Calva-Candelaria等人使用质谱报告了许多先前未表征的酚酸、黄酮类化合物和相关代谢物。相反，先前报道的粉红月见草化合物，包括新绿原酸、飞燕草素和矢车菊素，在本研究中未检测到。
图2. 通过UHPLC-PDA获得的植物提取物色谱图。实线代表280 nm处的吸光度；虚线代表320 nm处的吸光度。（A）粉红月见草；（B）蒙特苏马柏。两种提取物均用70%乙醇在60 °C下提取24 h获得。
表4. 通过MS/MS比较在粉红月见草中初步鉴定的化合物。
相反，表5展示了在60 °C下用70%乙醇提取24 h获得的蒙特苏马柏提取物中初步鉴定的化合物，相应的UV色谱图见图2B。非靶向UHPLC-MS/MS谱分析揭示了多样的植物化学成分，基于精确质量测量、MS/MS碎片模式和与可用光谱数据库和参考文库的比较，特征初步注释为黄烷-3-醇、黄酮醇糖苷、双黄酮和二萜类化合物。在黄烷-3-醇中，鉴定了儿茶素、表儿茶素和原花青素，而黄酮醇部分包括槲皮素-3-O-维糖苷、槲皮素-3-O-己糖苷、虎杖苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷和苷元槲皮素。双黄酮谱包括C–C和C–O–C连接的结构，如柏黄酮、穗花杉双黄酮、4′-O-甲基化黄酮和异银杏黄素。鉴定的二萜类主要为松香烷型，以及Labdane相关化合物如pisiferal衍生物。样品组成进一步包括特征性代谢物如柚皮素。几种二萜及其二聚体仍未表征，目前未在LC-MS文库中收录；然而，其碎片模式正在研究中，表明大多数这些化合物是脱氢松香酸衍生物。蒙特苏马柏的植物化学成分谱与先前描述酚酸、黄酮类化合物、双黄酮和二萜类化合物存在的报道一致。几个检测到的特征显示出与该物种及相关分类群中先前报道的双黄酮一致的m/z值和碎片模式，包括罗汉松双黄酮A、Sciadoptysin、双芹菜素、柳杉素和穗花杉双黄酮衍生物。同样，在先前研究中观察到对应于二萜类化合物如铁锈醇、 sugiol、 taxodione、 salvinolone和 royleanone的m/z值。虽然一些先前报道的代谢物未检测到，但槲皮素和柚皮素等化合物以苷元或糖基化形式被确认。因此，结果支持了早期的植物化学发现，同时扩展了蒙特苏马柏化学多样性的证据。
表5. 通过MS/MS在蒙特苏马柏中初步鉴定的化合物。
2.4. 细胞抗氧化活性
粉红月见草和蒙特苏马柏提取物在50 μg/mL浓度下均显著降低成纤维细胞中AAPH诱导的氧化应激，相对于AAPH刺激的对照细胞，抑制值分别为16.8%和16.2%。虽然两种提取物与刺激对照相比均表现出显著的抗氧化活性，但两种提取物处理之间未观察到统计学显著差异（p > 0.05）（图3）。尽管植物化学成分不同，两种提取物在评价条件下表现出相当的细胞抗氧化活性。这些发现表明不同的植物化学成分谱可能在该细胞模型中导致相似的总体抗氧化效应。
图3. 表示为90 min内相对曲线下面积（AUC）的细胞抗氧化活性。人真皮成纤维细胞加载DCFH-DA并用AAPH刺激以诱导氧化应激。处理样品暴露于在60 °C下用70%乙醇提取24 h获得的粉红月见草和蒙特苏马柏提取物，浓度为50 μg/mL；对照样品未处理。每个样品的AUC值归一化至对照（设为100%氧化）。柱代表技术三重复的平均值 ± 标准差。柱上方的字母表示根据Tukey检验在α = 0.05水平下处理之间的显著差异。
2.5. 一氧化氮定量测定
亚硝酸盐产生被测量作为NO合成的间接标志物，NO在伤口愈合的炎症阶段起关键作用。如图4所示，蒙特苏马柏提取物处理导致LPS刺激和非刺激细胞中亚硝酸盐产生的显著降低（p < 0.05），表明对巨噬细胞介导的NO合成具有明显的抑制作用，提示强烈的抗炎活性。相反，当细胞用粉红月见草提取物处理时，未观察到NO合成的降低。
图4. 使用Griess比色法在提取物处理的RAW 264.7细胞中测量的一氧化氮产生。值归一化至非LPS刺激的对照。浅灰色柱代表未刺激细胞，深灰色柱代表LPS刺激细胞。粉红月见草和蒙特苏马柏提取物均用70%乙醇在60 °C下提取24 h获得，以20 μg/mL浓度添加。对照 = 未处理细胞。柱代表技术三重复的平均值 ± 标准差。柱上方的字母表示根据Tukey检验在α = 0.05水平下处理之间的显著差异。
2.6. 体外成纤维细胞迁移测定
成纤维细胞迁移测定揭示了粉红月见草在标准葡萄糖条件下的有益效果。如图5A所示，闭合百分比有明显增加，对应于更高浓度的粉红月见草提取物。样品O100（纯粉红月见草提取物）在72 h达到约90%闭合，优于阳性对照（积雪草），后者达到80%闭合。相反，添加蒙特苏马柏提取物限制了伤口闭合，T100达到43%，低于O100，但高于未处理对照样品的28%。标准葡萄糖条件下的细胞迁移可见于图6A–E的上方面板。
图5. 用粉红月见草和蒙特苏马柏提取物混合物处理的真皮成纤维细胞体外迁移测定，表示为72 h内闭合百分比。（A）在标准培养基（1 g/L葡萄糖）中培养的细胞的闭合；（B）在高葡萄糖培养基（5 g/L葡萄糖）中培养的细胞的闭合。样品代码表示提取物比例：O = 粉红月见草，T = 蒙特苏马柏；数字表示百分比组成（例如O100 = 100%粉红月见草，T50,O50 = 50%蒙特苏马柏，50%粉红月见草）。CA = 积雪草；对照 = 未处理细胞。上标字母表示在72 h时处理之间的显著差异（Tukey检验，α = 0.05）。
图6. 体外成纤维细胞迁移测定期间人皮肤成纤维细胞的代表性显微图像。每行说明在0、24、48和72 h的闭合进展。处理：（A）粉红月见草提取物；（B）50%蒙特苏马柏 + 50%粉红月见草提取物；（C）蒙特苏马柏提取物；（D）未处理对照；（E）积雪草提取物。所有处理在标准葡萄糖（1 g/L）和高葡萄糖（5 g/L）条件下均以20 μg/mL的最终浓度测试。
在高血糖条件下（模拟糖尿病伤口环境），所有组的伤口闭合均明显受损。如图6B所示，大多数样品表现出最小的闭合（5–10%），例外是T50,O50样品，其保持了30%的中等闭合率。形态学分析（图6A–E的下方面板）进一步支持了这些发现；高葡萄糖下的细胞显示圆形形态，偏离了迁移成纤维细胞典型的伸长表型，表明运动性降低。
3. 讨论
提取处理之间观察到的对比响应突出了在评价生物活性化合物回收时同时考虑提取产率和提取物组成的重要性。粉红月见草在水提取下获得的较高产率表明存在极性化合物，其在水中的溶解度较高。然而，在较高温度和较长提取时间的水醇条件下观察到的优异抗氧化活性表明，对抗氧化能力贡献最大的化合物在有机溶剂存在下更有效地回收或更好地保存。相反，蒙特苏马柏水醇提取物持续较高的抗氧化活性表明其主要抗氧化成分可能极性较低，更依赖于有机溶剂进行有效提取。水醇系统已知可改善细胞壁渗透性并促进跨更宽极性范围的酚类化合物的回收。此外，增加温度和提取时间促进细胞壁结合酚类化合物的释放，但也可能加速水解和氧化降解，特别是在水系统中。因此，表现出最高总体抗氧化活性的样品12和24（分别对应于用70%乙醇在60 °C下提取24 h获得的粉红月见草和蒙特苏马柏提取物）被选择用于后续表征和生物学评价。此后，这些提取物分别命名为O100和T100。
尽管植物化学成分谱形成对比，O100和T100相对于对照均表现出显著的细胞抗氧化活性。这一发现表明两种提取物均含有能够保护细胞免受氧化应激的成分，尽管其化学组成明显不同。粉红月见草主要以酚酸和黄酮糖苷为特征，而蒙特苏马柏含有额外的双黄酮和二萜类化合物。值得注意的是，两种提取物均含有槲皮素衍生的糖苷，鉴于这些黄酮类化合物已充分确立的细胞抗氧化活性，这可能部分解释其相当的抗氧化效应。这些结构中多个羟基促进电子捐赠和自由基清除，而糖基化通常增强水溶性。然而，缺乏代谢物定量阻止了将观察到的活性归因于特定化合物。此外，T100中存在的额外二萜类化合物对测得的细胞抗氧化响应贡献可能较小，因为其相对疏水性可能限制在体外条件下的溶解度和细胞可利用性，这种现象先前已在富含萜类提取物的细胞渗透性模型中报道。这些解释仍是推测性的，应通过涉及代谢物定量、摄取分析和分离化合物测试的未来研究来确认。
在这方面，一氧化氮产生的评价揭示了提取物之间重要的功能差异。T100显著降低LPS刺激巨噬细胞中亚硝酸盐的积累，而O100未显示显著抑制。先前研究表明黄酮和双黄酮比许多其他酚类亚类具有更强的NO抑制活性，特别是当羟基和甲氧基取代位于与增强抗炎活性相关的位置时。这种NO产生的抑制与自由基清除活性、iNOS表达抑制以及干扰NF-κB等上游信号通路有关。与这些观察一致，T100富含双黄酮包括柏黄酮、穗花杉双黄酮和4′-O-甲基化黄酮。与这些代谢物结构相关的化合物已被报道可抑制NF-κB活化并抑制活化巨噬细胞中iNOS和COX的表达。因此，在T100处理细胞中观察到的NO产生减少可能与能够调节炎症信号的双黄酮结构的丰度有关。
相反，O100缺乏黄酮，主要由黄酮糖苷组成。据报道，糖基化相对于相应的苷元降低NO抑制活性，主要因为糖基增加亲水性并在空间上阻碍与细胞靶标的相互作用。这些结构特征可能解释O100尽管具有显著的抗氧化活性但对NO产生有限影响的原因。总之，这些发现表明抗氧化活性和NO调节受不同的植物化学特征支配，后者更依赖于单个酚类化合物的特定结构特征。
伤口愈合结果进一步支持了这一解释。在正常血糖条件下，两种提取物与阴性对照相比均促进成纤维细胞迁移，表明抗氧化保护对修复过程有积极贡献。然而，O100比T100产生更大的伤口闭合响应，同时伴随着NO产生的维持。已知一氧化氮通过调节成纤维细胞活化、胶原合成、血管生成以及参与组织修复的细胞因子和生长因子的表达在伤口愈合中起核心作用。此外，NO有助于调节炎症细胞募集和IL-8和TGF-β1等介质。这些观察表明，抗氧化保护与持续NO信号的结合可能比单独的抗氧化活性产生更有利于成纤维细胞迁移的环境。
氧化应激与NO可用性之间的关系可能与解释这些结果特别相关。虽然NO促进组织修复，但其生物活性高度依赖于周围的氧化还原环境。过量的ROS可与NO反应形成过氧亚硝酸盐，从而降低NO生物利用度并损害与伤口愈合相关的细胞响应。在阴性对照中，缺乏抗氧化保护可能有利于氧化应激并限制成纤维细胞迁移。相反，两种提取物的抗氧化活性可能通过降低ROS水平帮助保持NO生物利用度。在这些条件下，O100可能提供了ROS清除和NO信号之间更有利的平衡，导致成纤维细胞迁移增强。
这种相互作用在高血糖条件下变得更加明显。先前研究表明，升高的葡萄糖浓度促进ROS积累、线粒体功能障碍和晚期糖基化终产物的形成，所有这些都损害成纤维细胞功能并延迟伤口闭合。任一提取物单独无法完全恢复迁移表明其抗氧化活性不足以克服与高血糖相关的严重氧化应激。有趣的是，用O50:T50处理观察到的部分恢复指向两种植物之间的互补相互作用。虽然O100富含酚酸和黄酮糖苷并显示出更强的迁移促进作用，但T100表现出更多样的植物化学成分谱，进一步富含双黄酮和二萜类化合物，并通过抑制一氧化氮产生显示出更强的抗炎活性。在高血糖条件下，氧化应激和炎症同时作用损害伤口修复，这些植物化学类别的组合可能比任一提取物单独提供更广泛的生物保护。虽然这些机制仍是假设性的，需要通过ROS、iNOS和细胞因子分析直接确认，但发现表明结合具有互补作用模式的植物化学物可能在高氧化应激条件下比单独提取物提供更大的益处。
4. 材料与方法
4.1. 材料与试剂
蒸馏水和商业制备的乙醇（70%，v/v；Desarrollo de Especialidades Químicas S.A. de C.V. (DEQ)，蒙特雷，新莱昂，墨西哥）用作提取溶剂。甲醇（99.8%）和乙醇（96%，v/v）购自DEQ，用于抗氧化测定。Folin–Ciocalteu试剂（2 M）、碳酸钠（99.5%）、没食子酸（99%）、ABTS盐（>98%）、DPPH（>90%）、过硫酸钾（99.99%）、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（Trolox，99.5%）和AAPH（99.78%）购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）。LC-MS级水和乙腈购自Fisher Scientific（沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国），而甲酸购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）和100×青霉素–链霉素抗生素溶液购自Gibco（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）。人真皮成纤维细胞（HDFa）和RAW 264.7巨噬细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国）。Griess试剂系统和CellTiter 96? Aqueous One Solution细胞增殖测定购自Promega（麦迪逊，威斯康星州，美国）。
4.2. 植物样品
蒙特苏马柏的叶和枝于2023年3月在墨西哥新莱昂州蒙特雷附近野外采集（25°35′45.427″ N，100°15′44.528″ W）。此外，粉红月见草（Oenothera rosea L'Hér. ex Aiton）的干燥地上部分，当地称为"hierba del golpe"，从认证草药供应商以EHYA Herbolaria品牌（Casa de Herbolaria，Naucalpan de Juárez，墨西哥州）购买。供应商确认符合COFEPRIS法规。植物鉴定使用标准分类学检索表和蒙特苏马柏和粉红月见草的权威植物志参考文献进行。植物名称在The Plant List（http://www.theplantlist.org，2023年3月14日访问）中验证。植物材料的代表性照片提供于补充材料（S2）。样品用冷水彻底洗涤以去除污垢和土壤，切成约1英寸的碎片，冻干并在?80 °C储存直至进一步处理。在提取前，两种植物的植物材料分为叶/花和茎/枝部分。由于这些部分之间的平均比例在物种间相似，样品标准化为所有后续分析的平均叶/花:茎/枝比例30:70（w/w）。
4.3. 溶剂提取和实验设计
采用全因子实验设计评估溶剂类型（70%乙醇和水）、提取温度（25 °C、40 °C和60 °C）和提取时间（1 h和24 h）对具有抗氧化特性化合物提取效率的影响。所得的2 × 3 × 2设计包含12个处理组合，每个进行三次独立提取。植物化学提取对每种植物分别进行，使用4 g植物材料，每个以1:10（w/v）的植物与溶剂比例处理。样品置于50 mL密封管中以防止溶剂蒸发和污染，并在设定为250 rpm的摇床中孵育以确保均匀混合并保持在指定温度。提取过程后，上清液通过0.11 μm纸滤器真空过滤。含70%乙醇的提取物进一步经受直接氮气流以蒸发有机溶剂。随后，所有提取物冻干。提取产率以溶剂去除后回收的干燥提取物质量与用于提取的初始植物材料质量的比率重量法计算。产率表示为每克植物材料的干燥提取物毫克数（mg/g）。干燥提取物重新溶解于原始提取溶剂中至最终浓度1000 ppm用于后续抗氧化测定。
4.4. 体外化学抗氧化活性
总酚含量（TPC）和2,2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）清除活性在96孔微板中根据先前验证的方法稍作修改进行评价。对于TPC，从每个提取物中取20 μL等分试样分配到96孔微板的各个孔中，随后加入100 μL用蒸馏水1:10（v/v）稀释的Folin–Ciocalteu试剂。室温孵育5 min后，向每孔加入80 μL碳酸钠溶液（7.5%）。微板在黑暗中室温孵育90 min。使用微板读数器（Biotek，Synergy HT KC4，Winosski，佛蒙特州，美国）在765 nm处测量吸光度。包含仅含提取溶剂的校正空白以考虑背景吸光度。总酚含量表示为每克干基提取物的没食子酸当量毫克数（mg GAE），使用没食子酸制备的标准曲线。对于抗氧化活性，制备60 μM的DPPH甲醇溶液。将每个提取物的等分试样（7 μL）加入96孔微板的各个孔中以及193 μL DPPH溶液。微板在黑暗中保持30 min，之后使用微板读数器在517 nm处测量吸光度并通过减去校正空白的值进行校正。DPPH自由基清除活性表示为每克提取物的Trolox当量微摩尔数（μmol TE/g提取物），使用Trolox制备的校准曲线。2,2′-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸（ABTS）测定按照方法稍作修改进行。ABTS•+自由基阳离子通过将7 mM ABTS储备溶液（在PBS中制备）与2.45 mM过硫酸钾以1:1 v/v比例反应并在室温黑暗中静置14 h后使用来产生。ABTS•+溶液用96%乙醇（v/v）稀释以达到734 nm处0.70 ± 0.02的吸光度。将每个提取物的1 μL等分试样加入96孔微板的各个孔中，随后加入180 μL稀释的ABTS•+溶液。在黑暗中反应15 min后，使用微板读数器在734 nm处测量吸光度并通过减去校正空白的值进行校正。ABTS自由基清除活性表示为每克提取物的Trolox当量微摩尔数（μmol TE/g提取物），使用Trolox制备的校准曲线。
4.5. 总体抗氧化活性
为确定最大化总体抗氧化活性的提取条件组合，采用意愿函数方法，整合TPC、DPPH和ABTS测定获得的结果。这种多响应优化技术涉及两个主要步骤。首先，使用公式为k个响应变量中的每一个计算单个意愿值（di）：（1）其次，根据以下将单个意愿值聚合为复合意愿指数（D）：（2）单个意愿值（di）和复合意愿指数（D）范围为0到1，其中0代表完全不可取的响应，1代表最可取的结果。
4.6. 通过UHPLC-MS/MS表征植物化学物
将2 μL等分试样（对于ESI正性和ESI负性分析）注入UHPLC-MS/MS系统，该系统由Vanquish Horizon UHPLC（Thermo Fisher Scientific，不来梅，德国）与Orbitrap Exploris 120质谱仪（Thermo Fisher Scientific，不来梅，德国）联用组成。化合物使用ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 × 100 mm，1.8 μm）分离。分离中使用的流动相为LC-MS级水（溶剂A）和乙腈（溶剂B），各含0.1%（v/v）甲酸（FA）。编程梯度为0–7 min（0–30%B），7–9 min（30–80%B），9–11 min（80–100%B），11–14 min（100%B），溶剂系统以0.5 mL/min的流速运行。柱温维持在40 °C，光电二极管阵列（PDA）的采集波长范围设定为190–680 nm。最初，样品在全扫描模式下以60,000的分辨率和60–900 m/z的扫描范围进行分析。随后进行MS/MS分析，以15,000的分辨率进行，CID以20%、30%和40%的能量应用。质谱数据使用Thermo Scientific Xcalibur v4.7（Thermo Fisher Scientific，不来梅，德国）采集和处理，并使用Thermo FreeStyle v1.8（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）处理。原始MS数据使用MZmine（版本4.5.20）处理进行特征检测、去卷积、同位素分组和比对。色谱峰使用ADAP色谱图构建器检测，随后跨样品进行特征连接。对于代谢物注释，使用包含在相同色谱条件下分析的416种真实参考标准的精确质量（m/z）和保留时间（RT）的内部文库，结合公共和商业MS/MS光谱数据库。通过组合来自NIST23 MS/MS数据库和北美MassBank（MoNA；http://massbank.us，2025年10月30日访问）的光谱生成MSP文库。实验MS/MS光谱与组合MSP文库和内部mzRT数据库匹配以支持化合物注释。无法通过光谱匹配自信分配的特征使用SIRIUS v. 6.1.1（耶拿大学，耶拿，德国）进一步评估，其用于基于碎片树和计算机数据库的分子式预测和化合物分类。代谢物根据Schymanski的置信度框架进行注释。MSI level 1分配给具有前体m/z、内部mzRT文库匹配和MS/MS光谱文库匹配的代谢物。MSI level 2a分配给具有前体m/z和针对私有光谱文库（NIST23）的MS/MS光谱文库匹配的代谢物。MSI level 2b分配给具有前体m/z和针对公共光谱数据库（包括MoNA）的MS/MS光谱文库匹配的代谢物。MSI level 3分配给由光谱证据支持但结构模糊性未解决（包括位置和立体异构体）的初步结构注释。MSI level 4分配给只能确定分子式的特征。额外的补充文件提供了本研究中讨论的所有相关特征的完整MS/MS光谱（补充文件S1）。
4.7. 细胞抗氧化活性测定
细胞抗氧化活性（CAA）使用方法稍作修改进行评估。HDFa在含5% FBS的DMEM中在标准条件下（37 °C，5% CO2）培养，使用第38–40代。细胞接种于96孔板（50,000细胞/孔）并孵育过夜。用PBS洗涤后，处理孔接受100 μL提取物（50 μg/mL）与DCFH-DA（60 μM）1:1混合并孵育20 min。然后洗涤细胞并暴露于500 μM的2,20-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐（AAPH）以诱导氧化应激。空白孔包含细胞，但不加DCFH-DA和AAPH。阳性对照孔包含DCFH-DA和AAPH但不含提取物。阴性对照孔包含DCFH-DA但不含AAPH或提取物。在37 °C下每2 min记录荧光（激发485 nm/发射538 nm）持续90 min。CAA表示为相对曲线下面积（AUC），归一化至氧化对照：（3）其中是读取90 min期间处理细胞荧光的积分面积，是阳性对照的积分面积，空白积分面积平均值。
4.8. 一氧化氮产生测定用于抗炎活性
一氧化氮（NO）产生按照所述方案评估。RAW 264.7小鼠巨噬细胞以每孔50,000细胞的密度接种于96孔板中，在100 μL含10% FBS和1%抗生素的DMEM中，孵育过夜。随后，向细胞中加入50 μL提取物以达到20 μg/mL的最终浓度，板孵育24 h。为诱导一氧化氮产生，将来自大肠杆菌的脂多糖（LPS）以4 μg/mL的最终浓度加入指定孔。实验组包括：（i）无提取物处理的LPS刺激细胞（阳性对照），代表最大一氧化氮产生；（ii）无提取物处理的非刺激细胞（阴性对照）；（iii）用提取物处理的LPS刺激细胞（处理组）；和（iv）用提取物处理的非刺激细胞（提取物对照），以评估与炎症刺激无关的任何效应。孵育24 h后，从每孔转移100 μL上清液至单独的96孔微板，使用Griess试剂系统按照制造商说明测量亚硝酸盐浓度。使用微板读数器（Biotek，Synergy HT KC4，Winoski，佛蒙特州，美国）在550 nm处测量吸光度。结果表示为亚硝酸盐产生水平（μM）。板上剩余细胞使用CellTiter测定处理。
4.9. 体外成纤维细胞迁移测定
为评估潜在伤口闭合，根据方法稍作修改进行成纤维细胞自发迁移。简言之，将插入物置于24孔板孔的中心，并将70 μL HDFa细胞悬液（500,000细胞/mL）置于每个插入孔中。细胞在37 °C，5% CO2下孵育24 h。小心移除培养插入物，用PBS冲洗细胞碎片。细胞与500 μL提取物混合物孵育，最终浓度为20 μg/mL，分别在标准葡萄糖培养基或高葡萄糖培养基中制备，均不含FBS，而未处理细胞作为对照。在该浓度下，所有处理维持细胞活力高于92%。处理应用后立即使用倒置显微镜拍摄间隙图像；在24、48和72 h拍摄额外图像以监测细胞迁移进入间隙区域。使用ImageJ软件（版本1.54r）测量每个时间点细胞覆盖间隙的面积。结果报告为伤口闭合百分比，使用以下公式，其中Ai是初始间隙面积，At是每个时间的空面积。（4）
4.10. 统计分析
数据获得自至少三次独立提取。统计分析使用JMP学生版18（SAS Institute Inc.，卡里，北卡罗来纳州，美国）软件进行。使用三因素方差分析（ANOVA）评估温度、溶剂类型和提取时间对提取产率的影响。实验条件之间意愿得分的差异使用单因素ANOVA评估，随后进行Tukey诚实显著差异（HSD）事后检验以识别提取条件组合之间的显著差异。结果在p < 0.05时被认为具有统计学显著性。
5. 结论
本研究强调了粉红月见草和蒙特苏马柏这两种在墨西哥传统上用于此目的的植物的伤口愈合潜力。最有效的提取条件为70%乙醇在60 °C下提取24 h，在两种植物中产生最高的抗氧化活性。化学谱分析显示粉红月见草富含酚酸和黄酮糖苷，而蒙特苏马柏含有双黄酮、黄烷-3-醇和二萜类化合物。这些不同的植物化学成分谱反映在其生物活性中。粉红月见草表现出显著的抗氧化活性并在正常葡萄糖水平下显著促进成纤维细胞迁移，尽管它不抑制一氧化氮（NO）。蒙特苏马柏也显示出强抗氧化效应并抑制巨噬细胞中的NO，成纤维细胞迁移高于对照但低于粉红月见草。在高血糖条件下，只有两种提取物的1:1混合物部分支持成纤维细胞迁移，表明它们的联合作用可能平衡NO调节和活性氧清除。值得注意的是，这些植物传统上用于治疗急性伤口；然而，没有先前记录表明其应用于糖尿病足溃疡。本研究强调了结合两种提取物的潜在益处，其协同机制在糖尿病高度应激的生化环境中可能特别有价值，其中氧化应激、细胞迁移受损和慢性炎症阻碍愈合。这一证据支持蒙特苏马柏和粉红月见草提取物的联合使用可能代表增强糖尿病足溃疡伤口修复的有前景策略的可能性，值得在临床前和临床环境中进一步探索。
补充材料
以下支持信息可在https://www.mdpi.com/article/10.3390/plants15213391/s1下载，表S1. 表4中报告的粉红月见草所有特征的MS2碎片。图S1. 表4中报告的化合物的所有m/z值的注释质谱图。表S2. 表5中报告的蒙特苏马柏所有特征的MS2碎片。图S2. 表5中报告的化合物的所有m/z值的注释质谱图。图S3. 商业获得的粉红月见草（"hierba del golpe"）加工前的代表性照片。图S4. 在墨西哥新莱昂州蒙特雷附近采集的蒙特苏马柏的代表性照片，显示用于样品制备的地上组织。植物鉴定使用标准分类学检索表和植物志参考文献进行。图S5. 墨西哥新莱昂州蒙特雷采集地点的蒙特苏马柏树。
