高海拔原生植物Adesmia subterranea对镉和汞的抗氧化防御与重金属耐受性：植物稳定化潜力及生理机制研究

《Plants》：Antioxidant Defense and Heavy Metal Tolerance in Adesmia subterranea: Physiological Insights into Cadmium and Mercury Phytostabilization

　　

重金属（HM）污染是陆地生态系统的主要威胁。应对该问题需要鉴定能够耐受重金属同时维持生理功能的原生植物物种。本研究在高海拔安第斯物种Adesmia subterranea Clos中，于半水培系统下评估了其对镉（Cd 3、4.5和6 mg L^?1）和汞（Hg 0.8、1.2和1.6 mg L^?1）的生理响应、抗氧化防御机制及植物修复潜力。研究评估了存活率、生长性能、金属积累量、生物富集系数（BCF）、转运系数（TF）、氧化应激生物标志物如过氧化氢（H₂O₂），以及包括过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽（GSH）在内的抗氧化响应。暴露于Cd以浓度依赖方式降低存活率并减少生物量，而Hg不影响存活率且仅在0.8 mg L^?1时降低生物量。两种金属均被有效吸收（BCF > 1）；Cd始终滞留于根部（TF < 1），而Hg的转运随剂量增加而升高（1.6 mg L^?1时TF达0.79）。Cd和Hg暴露诱导氧化应激，表现为H₂O₂积累和脂质过氧化增加，同时伴随抗氧化防御的激活。APX活性和GSH水平显著升高，而CAT表现出金属特异性响应。这些结果表明酶促和非酶促抗氧化途径的协调调控以在重金属胁迫下维持氧化还原稳态。总体而言，这些结果为A. subterranea在金属污染安第斯生态系统中进行植物稳定化的潜力提供了初步指示。

**研究背景与意义**

重金属（HM）污染是陆地生态系统面临的最严峻的环境问题之一，也是环境退化的重要驱动因素。在阿根廷中安第斯地区，金矿和铜矿开采作业位于海拔2500至5000米之间，这些场地产生的大量尾矿和废石可导致镉（Cd）、铜（Cu）、镍（Ni）、铅（Pb）、汞（Hg）、锌（Zn）和砷（As）在周边土壤中积累。其中，Cd和Hg因即使在低浓度下也具有高毒性、在土壤-植物系统中的迁移性以及沿营养级生物累积的能力而尤其令人关注。传统的重金属污染场地处理方法包括土壤挖掘、清洗和化学固定化等，但其应用受限于高成本和能源需求、安全隐患以及二次生态破坏风险。在此背景下，植物修复（phytoremediation）等生物替代方案已成为一种可持续的低成本技术。植物修复主要分为两种策略：植物提取（phytoextraction）依赖重金属向可收获地上生物量的吸收和转运；植物稳定化（phytostabilization）则旨在通过根部积累或根际固定化降低重金属的迁移性和生物可利用性，从而限制污染物通过风蚀或径流扩散。Cd和Hg暴露会产生活性氧（ROS）产生与抗氧化能力之间的失衡，导致大分子损伤。植物已发展出酶促和非酶促抗氧化防御系统，包括过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）以及谷胱甘肽（GSH）等，积极参与ROS解毒并维持细胞氧化还原稳态。植物物种选择对植物修复项目的成功至关重要，原生物种具有局部适应性、种子和幼苗可获得性高以及生物入侵风险低等显著优势。Adesmia属（豆科）物种局限于智利和阿根廷海拔3000米以上的干旱和半干旱高安第斯环境，因其积累和稳定重金属的能力而日益受到关注。尽管阿根廷高安第斯地区采矿活动日益增加，但关于具有植物修复潜力的原生 species 的信息仍然匮乏。此前研究中，研究人员表征了Adesmia subterranea Clos和Adesmia pinifolia Gillies ex Hook. and Arn.在萌发和早期幼苗生长阶段对Cd、Hg、Ni和As的耐受性，鉴定出Hg是植物毒性最低的金属。因此，本研究将评估扩展至后期发育阶段，评估A. subterranea植株在长期暴露于Cd和Hg胁迫后的生理和生化响应，重点关注抗氧化防御机制和氧化应激生物标志物，并确定该物种积累和转运两种金属的能力，以评估其作为半干旱安第斯环境中重金属污染土壤植物修复候选物种的适宜性。

**关键技术方法**

研究人员以Adesmia subterranea Clos为研究对象，种子采集自阿根廷门多萨Manzano Historico自然保护区。采用浓硫酸处理5分钟打破休眠后，在珍珠岩半水培系统中于受控生长箱条件下培养8周（20 ± 2 °C，12小时光/12小时暗周期，PPFD 200 μmol/m²/s，相对湿度50–55%）。重金属处理参照阿根廷农业土壤质量指南值（Law No. 24.051）设定浓度：Cd为3、4.5和6 mg L^?1（以CdCl₂·H₂O形式），Hg为0.8、1.2和1.6 mg L^?1（以Hg(NO₃)₂·H₂O形式）。每处理设3个独立重复，每重复为一个25孔托盘。8周后收获植株，测定存活率、生物量、组织Cd含量（石墨炉原子吸收光谱法）和总Hg含量（冷蒸气原子吸收光谱法），计算生物富集系数（BCF）和转运系数（TF）。同时测定地上部H₂O₂含量、丙二醛（MDA）含量、CAT和APX活性以及GSH含量。数据采用双因素和单因素方差分析（ANOVA），Tukey事后检验，GraphPad Prism 8.0.0软件分析。

**研究结果**

**存活率、植株生长与重金属积累**：8周Cd暴露显著降低A. subterranea存活率（p = 0.0005），较对照降低13–21.5%，但各Cd浓度间无差异。地上部和根部生物量均呈浓度依赖性下降（p < 0.0001）。Hg处理下存活率保持稳定（81–83%），与对照无显著差异（p = 0.1112）。生物量响应因器官类型而异（双因素ANOVA，p = 0.0462）：1.2 mg L^?1 Hg处理地上部生物量最高（18.54 mg），与对照相当；0.8 mg L^?1时最低，降低11.9%。根部生物量除0.8 mg L^?1显著降低外，其余与对照相当。Cd积累方面，各处理根部浓度均高于地上部，地上部Cd含量随金属供应增加显著升高（p = 0.0011），呈明显阈值效应；根部Cd浓度范围为1016.3 ± 115.1至2885.4 ± 306.0 μg g^?1。所有Cd处理下根部和地上部BCF均>1，根部BCF（338.7–480.9）显著高于地上部（53.8–76.0）；TF值均<1且各处理间无显著差异，表明Cd从根部向地上部转运有限。Hg积累方面，根部浓度同样高于地上部，但差异幅度明显小于Cd。地上部Hg含量随浓度增加显著升高（p < 0.0001），1.6 mg L^?1时最高达458.5 μg g^?1。根部BCF随Hg浓度增加从536.4 ± 12.1降至332.8 ± 5.0，地上部BCF保持稳定。TF值随Hg供应增加显著升高，表明高浓度下更大比例的Hg转运至地上部组织，但所有处理TF仍<1.0。

**Cd和Hg胁迫下的氧化应激标志物**：Cd暴露诱导地上部MDA含量较对照显著增加（p < 0.0001），6 mg L^?1 Cd处理最大值达2.98 μmol MDA mg^?1蛋白。Hg暴露同样导致MDA含量显著升高（p < 0.0001），1.2 mg L^?1时最大值为2.31 μmol mg^?1蛋白。Cd处理下地上部H₂O₂含量较对照显著升高（p < 0.0001），增幅34.5%–54.6%。Hg暴露下H₂O₂含量在所有处理中均显著增加（p = 0.0004），从对照的0.32 nmol mg^?1鲜重（FW）增至1.6 mg L^?1时的约0.97 nmol mg^?1 FW，增幅近三倍。

**Cd和Hg胁迫下抗氧化酶活性与谷胱甘肽代谢**：CAT活性表现出金属特异性响应模式。Cd暴露下，3 mg L^?1时CAT活性显著升高（p = 0.0259），较对照增加约16.5%；但更高Cd浓度下CAT活性降至对照水平。Hg处理下CAT活性呈波动模式，0.8 mg L^?1和1.6 mg L^?1时分别显著增加20.6%和37.6%（p = 0.0002）。APX活性在两种金属暴露下均显著升高。Cd暴露下APX活性显著增加（p < 0.0001），较对照提高126%–255%。Hg暴露下APX活性在所有处理中均显著升高（p < 0.0001），1.6 mg L^?1时最大值达1.27 μmol asc mg^?1 prot min^?1。与APX活性上调一致，GSH含量在两种金属处理下均显著增加。Cd处理下GSH随浓度增加显著积累（p < 0.0001），6 mg L^?1时最大值达0.1989 nmol GSH g^?1 FW。Hg暴露下GSH增幅尤为显著，1.2和1.6 mg L^?1时较对照分别增加250%–340%（p < 0.0001）。

**讨论与结论**

讨论部分指出，Cd和Hg毒性严重损害植物存活和生长性能，通常导致生物量积累显著降低。本研究中A. subterranea暴露于递增Cd浓度后地上部和根部生物量显著降低，与先前研究一致。相反，Hg不影响存活率，生物量未表现浓度依赖性抑制，仅在最低浓度（0.8 mg L^?1）时降低，1.2和1.6 mg L^?1时与对照无差异，与其他物种中Hg耐受性维持的报道一致。研究人员此前在早期幼苗阶段也发现Hg暴露对A. subterranea无抑制效应，而Cd具有明显植物毒性。关于重金属吸收和转运，A. subterranea表现出强大的Cd和Hg积累能力，6 mg L^?1时地上部Cd浓度达456.4 μg g^?1，地上部Hg浓度达458.5 μg g^?1，呈显著剂量依赖性积累模式。Cd始终以更高水平滞留于根部，证实根系作为Cd主要 sequestration 位点的作用。Hg根部浓度同样高于地上部，但1.6 mg L^?1时根-冠差异缩小（地上部458.5 μg g^?1，根部532.5 μg g^?1），表明最高剂量下Hg的根部滞留明显弱于Cd。TF分析显示Cd的TF在各浓度范围内保持低而稳定（<1），而Hg的TF随剂量增加整体升高，最大值0.79接近Hg耐受物种Tridax procumbens L.报道的平均TF（0.72）。值得注意的是，同属物种A. pinifolia的TF在所有评估剂量下保持稳定，提示此处观察到的饱和行为可能为A. subterranea所特有而非属的一般特征。Cd的强根部滞留可归因于快速根部吸收 coupled with 向地上部运输较慢。将金属转运限制在地上部之外，结合细胞壁组分结合、富硫配体螯合和液泡隔离，是金属耐受植物公认的耐受策略，也是植物稳定化的先决条件。BCF > 1和TF < 1的组合表明有效吸收，且对Cd而言向地上部转运受限。对于Hg，最高剂量下TF接近1，其根部滞留似乎不太稳定。综上，A. subterranea兼具根部金属滞留和与该策略相关的耐受机制，表明其在半干旱高安第斯环境中对Cd和低至中度Hg污染土壤具有植物稳定化潜力。Cd和Hg毒性破坏关键代谢过程和途径，导致ROS过量产生和氧化应激。本研究中A. subterranea在两种金属处理下H₂O₂含量显著增加，表明细胞氧化还原稳态受损。尽管Cd不是氧化还原活性金属，但通过干扰电子传递链和细胞抗氧化系统间接促进ROS产生。与ROS产生增强一致，MDA含量在两种金属暴露下成比例增加，最高处理水平较对照增加约200–350%。H₂O₂和MDA同步升高支持Cd和Hg不仅刺激ROS产生还触发脂质过氧化、损害A. subterranea膜完整性的假设。关于抗氧化酶，重金属胁迫下抗氧化酶活性通常随金属浓度升高而增加，但过量暴露可损害酶防御导致活性下降。本研究中CAT活性在3 mg L^?1 Cd时增加16.5%，表明适度胁迫下H₂O₂解毒机制的早期激活；更高Cd浓度下CAT活性降至对照水平，提示过量ROS积累或Cd离子置换必需金属辅因子导致的酶抑制或结构损伤。相反，APX活性在Cd暴露下显著增加126%–255%，这种补偿性上调已在其他物种中报道，APX在CAT效率下降时承担H₂O₂解毒的主导角色。APX通常被认为在金属胁迫下比CAT更高效地解毒H₂O₂，可能归因于其多个亚细胞同工型及与抗坏血酸-谷胱甘肽循环的整合。这些结果表明A. subterranea随Cd浓度增加抗氧化响应发生转变：CAT在适度胁迫下参与H₂O₂解毒，而APX活性在较高Cd浓度下增加最显著。与Cd暴露模式不同，Hg处理下CAT和APX活性从最低浓度即被诱导（分别较对照增加超过20%和147%），表明对Hg胁迫的抗氧化响应比Cd更显著。此外，GSH作为中心非酶促抗氧化剂和金属螯合剂，在两种金属处理下均显著升高，最高Cd和Hg浓度下分别达对照的300%–340%。GSH水平升高可能同时有助于直接ROS清除和Cd/Hg硫醇复合物形成，促进细胞内金属隔离并减少金属诱导的细胞损伤。APX活性和GSH积累同步增加与酶促H₂O₂解毒和非酶促Cd/Hg螯合的共同参与一致。结合Cd和Hg向地上部的受限转运，该抗氧化响应与A. subterranea在金属暴露下的植物稳定化潜力一致。本研究是鉴定具有采矿影响区域应用潜力原生 species 的第一步，填补了阿根廷该领域存在的重大知识空白。实验在半水培系统下进行，采用单一金属暴露和单一时间周期，不能完全反映田间土壤或尾矿中多金属条件的复杂性。需要更长期的土壤基试验及Cd-Hg联合暴露以在现实田间条件下验证这些发现。

研究结论部分翻译如下：本研究表明，Adesmia subterranea在受控条件下对Cd和Hg胁迫表现出差异化生理响应。Cd暴露降低植株存活率并导致生物量积累的剂量依赖性减少，而Hg处理不影响存活率且仅引起有限的非浓度依赖性生物量降低。两种金属均被有效吸收（BCF > 1），但其分布不同。Cd始终滞留于根部，TF低而稳定（<1），而Hg表现出剂量依赖性的转运增加，表明根部滞留较弱。该积累模式伴随抗氧化防御的激活，包括CAT、APX和GSH，可能有助于减轻重金属胁迫下的氧化损伤。总体而言，这些结果表明A. subterranea是Cd污染土壤植物稳定化的有前景候选物种，对Hg的潜力则较为有限且呈剂量依赖性。这些特性在高安第斯采矿环境中尤为重要，具有深根系的原生多年生物种可通过降低金属迁移性和生物可利用性，有助于Cd和Hg污染土壤的长期稳定化。因此，本研究结果为A. subterranea可能适合作为植物修复候选物种提供了初步指示。然而，需要进一步研究验证其性能，特别是检查其在土壤环境中的行为、更高浓度和Cd-Hg联合暴露以及更长暴露时间下的表现。