俄罗斯大豆相关附球菌属真菌的物种多样性、致病潜力与基因组特征研究

《Plants》：Epicoccum Associated with Soybean in Russia: Species Diversity, Pathogenic Potential, and Genomic Features

　　

摘要专业翻译 附球菌属（Epicoccum）真菌是广泛分布于植物相关的真菌类群，然而其在大豆上的植物病理学意义尚未得到充分研究。本研究对2024–2026年间从俄罗斯四个地区的大豆病叶和种子中获得的15株附球菌属分离物，采用多位点系统发育分析、全基因组测序、控制接种试验、胞外酶活性评估及杀菌剂敏感性测试进行了综合表征。其中9株被鉴定为E. tobaicum，5株为E. mezzettii，1株为E. oryzae。5个测序基因组大小为32.84–34.62 Mb，BUSCO完整度为97.1%–98.9%。在不进行叶片针刺的菌丝块接种试验中，最大平均坏死病斑直径为12.75 ± 5.03 mm；在另一项创伤辅助接种试验中，将E. tobaicum分生孢子悬浮液接种至标准化针伤处，接种后7天坏死小叶面积比例最高达26.17 ± 8.93%。用E. tobaicum分离株152H进行人工种子接种后，未发育出正常幼苗，100%的种子表面出现可见的真菌定殖迹象，表明在试验条件下该菌株对幼苗发育具有显著不利影响。15株分离株中有14株在最高测试浓度下（EC50 > 1000 μg/mL）未能达到50%菌丝生长抑制，表明在测试条件下对嘧菌酯（azoxystrobin）敏感性较低；而啶酰菌胺（boscalid）的EC50范围为0.0448–0.3837 μg/mL，咯菌腈（fludioxonil）为0.0760–0.2736 μg/mL，戊唑醇（tebuconazole）为3.735–49.542 μg/mL。这些发现表明所测分离株在杀菌剂敏感性方面存在显著差异，但需进一步比较研究以确定其抗性状态。据研究人员所知，本研究首次在俄罗斯分子水平确认了E. tobaicum、E. mezzettii和E. oryzae与大豆的关联，并首次在控制接种条件下实验证实了E. tobaicum在俄罗斯对大豆叶片具有致病潜力。由于分生孢子接种试验是在创伤叶片上进行的，该结果并不能证明这些分离株在自然条件下具有侵染完整叶片的能力。

论文解读

一、研究背景与意义

大豆（Glycine max (L.) Merr.）是全球最重要的粮豆兼油料作物之一，在俄罗斯作物生产中地位日益重要。据FAOSTAT最新数据，2024年俄罗斯大豆种植面积约413万公顷，产量达700万吨。近十年来该作物在俄罗斯的种植面积和总产量显著增长，凸显了植物检疫监测和微生物复合体研究的重要性。附球菌属（Epicoccum）真菌广泛分布于土壤、空气、活体与死亡植物组织、种子及储存农产品中，属内物种传统上多被视为腐生或内生真菌，但具有确认致病活性的物种数量持续增加。已有18种附球菌属真菌与20个国家46种植物病害相关，叶斑为最常见症状。然而，附球菌属与大豆的关联研究相对有限，此前仅在波兰、乌克兰等地报道其作为种子菌群组分存在，缺乏致病性的实验证据。近年来，E. sorghinum、E. nigrum和E. italicum已分别被确认为中国和北美大豆叶斑病、叶枯病及种子病害的病原，但E. tobaicum、E. oryzae尤其是E. mezzettii在大豆上的致病潜力仍基本未知。此外，附球菌属物种表现出显著的表型异质性，其胞外酶产生能力、杀菌剂敏感性及基因组功能特征均缺乏系统研究。在俄罗斯，附球菌属的多样性和植物病理学意义信息亦十分零散，E. tobaicum、E. mezzettii和E. oryzae此前未在俄罗斯大豆上获得分子水平确认，其致病性也未经实验研究。因此，本研究旨在对俄罗斯大豆叶片和种子来源的附球菌属分离株进行全面的分类学与功能学表征。

二、研究内容与主要结论

研究人员从俄罗斯哈巴罗夫斯克边疆区、阿穆尔州、犹太自治州和图拉州四个地区采集的具症状大豆叶片和种子中，通过真菌分离获得15株附球菌属分离株，其中10株来自叶片、5株来自种子。基于ITS、RPB2和TUB2三个基因片段的串联多位点系统发育分析，15株分离株被划分为三个系统发育谱系：9株为E. tobaicum，5株为E. mezzettii，1株为E. oryzae。该结果首次在俄罗斯分子水平确认了这三个物种与大豆的关联。研究人员选取代表三个谱系且涵盖表型差异的5株分离株（E. mezzettii 46H、E. oryzae 164H、E. tobaicum 152H、193H和288H）进行全基因组测序与比较分析。基因组大小为32.84–34.62 Mb，BUSCO完整度为97.1%–98.9%。基因组间FungANI值显示三个E. tobaicum基因组间相似性最高（97.66%–98.88%），E. mezzettii与E. tobaicum间为94.10%–94.16%，E. oryzae与其他基因组间为89.59%–89.77%。预测的经典分泌组包含802–867个蛋白，其中220–252个为候选效应蛋白；高置信度碳水化合物活性酶（CAZymes）为545–557个。最显著的分离株相关拷贝数差异为E. tobaicum 152H中球蛋白/类胚蛋白Cupin_1结构域直系同源群OG0000216的扩增，该分离株含有4个拷贝而其他基因组各含1个或缺失，但该差异与致病性的因果关系未经功能实验验证。

三、关键技术方法

本研究采用多项关键技术：多位点系统发育分析（基于ITS、RPB2和TUB2序列的最大似然法建树）；全基因组测序（DNBSEQ-G400平台）与de novo组装（SPAdes）；基因组注释（Funannotate流程结合RepeatModeler/RepeatMasker重复序列屏蔽）；分泌组与效应蛋白预测（DeepTMHMM、SignalP 6.0和EffectorP 3.0）；CAZyme注释（dbCAN）；直系同源群分析（OrthoFinder）；基因组相似性评估（FungANI）；控制接种试验（菌丝块接种和创伤辅助分生孢子接种）；种子人工接种试验；胞外酶活性测定（淀粉酶、果胶酶、纤维素酶和蛋白酶底物琼脂平板法）；以及体外杀菌剂敏感性测定（4种杀菌剂的EC₅₀评估）。

四、主要研究结果

2.1 植物检疫监测与分离株收集。 在症状导向的采样中，从大豆叶片和种子获得15株附球菌属分离株，叶片表现圆形或不规则形坏死斑点，种子表现种皮变色和斑点。

2.2 多位点鉴定与比较基因组学。 基于ITS、RPB2和TUB2的多位点系统发育分析将15株分离株分为三个谱系，对应E. tobaicum（9株）、E. mezzettii（5株）和E. oryzae（1株）。全基因组分析显示五个基因组在功能 repertoire 大小上总体相似，最显著的拷贝数差异为152H中OG0000216直系同源群的扩增。

2.3 培养形态与生长速率。 分离株在PDA、MEA和OA三种培养基上表现出显著的菌落颜色、结构和生长速率差异。E. tobaicum分离株在PDA上均能产孢，分生孢子近球形至球形，多细胞，黄褐色至深褐色，具横纵隔膜，大小约15.6–31.4 × 13.7–25.5 μm；E. mezzettii和E. oryzae在所采用的培养条件下未能获得分生孢子。生长速率在不同培养基上差异显著，最高达10.000 ± 0.143 mm/天（193H，PDA）。

2.4 叶片反应与分离株致病力。 在菌丝块接种试验（不刺伤叶片）中，所有附球菌属处理均产生坏死病斑，E. tobaicum 124H和288H产生的病斑最大（12.75 ± 5.03 mm和11.06 ± 4.32 mm），而E. oryzae 164H、多数E. mezzettii分离株及E. tobaicum 193H与对照无显著差异。在创伤辅助分生孢子接种试验中，E. tobaicum 288H最具有致病力（坏死面积26.17 ± 8.93%），152H次之（19.60 ± 8.52%），而193H、17H、124H和120H与对照无显著差异。接种后均成功从症状组织再分离出附球菌属真菌，ITS序列与接种菌株完全一致。

2.5 种子与幼苗影响。 人工种子接种试验显示，E. tobaicum 152H处理组发芽势和最终发芽率均为0%，可见种子表面定殖率达100%，未发育出正常幼苗；193H和E. mezzettii 190H也显著降低最终发芽率（60.3 ± 2.5%和66.7 ± 5.5%）；而143H和200H虽表面定殖率达100%，最终发芽率仍保持在96%以上。

2.6 胞外酶活性。 所有分离株均检测到淀粉酶活性（REA 0.9807–1.8896）；果胶酶活性在E. mezzettii 250H、E. tobaicum 193H和152H中未检出；纤维素酶活性仅在152H中缺失；所有分离株在所采用的测定条件下均未检测到蛋白酶活性。

2.7 性状间相关性。 经Benjamini-Hochberg多重比较校正后，叶片致病力、种子发芽率降低、生长速率和胞外酶活性之间均无统计学显著相关关系。

2.8 体外杀菌剂敏感性。 15株分离株中有14株对嘧菌酯的EC₅₀ > 1000 μg/mL（右删失数据），仅152H敏感（EC₅₀ = 0.787 ± 0.212 μg/mL）；啶酰菌胺EC₅₀范围为0.0448–0.3837 μg/mL，咯菌腈为0.0760–0.2736 μg/mL，戊唑醇为3.735–49.542 μg/mL，均表现出显著的株间差异。

五、讨论与结论

研究表明，大豆相关附球菌属的生物学特性主要由个体分离株及其与植物组织的互作性质决定，这与附球菌属作为生态可塑性属的观点一致，其成员可表现内生、腐生、拮抗或植物病原生活方式。E. tobaicum部分分离株在控制接种条件下表现出较强的叶片损伤能力，但创伤辅助接种不能证明其自然侵染完整叶片的能力；E. mezzettii和E. oryzae的数据仅支持分离株水平解释，不足以将其确立为大豆叶斑病的病原。种子接种试验表明个别E. tobaicum和E. mezzettii分离株可显著降低发芽率，但需利用自然感病种子进行独立试验以证实种子-幼苗的自然传播。对嘧菌酯的低表型敏感性不应被解释为QoI类杀菌剂的已证实抗性，需结合分子机制分析（如cytB基因突变检测）进一步确认。本研究存在若干局限：采样为症状导向而非流行率调查；E. oryzae仅1株；分生孢子接种仅针对E. tobaicum且涉及预先创伤；种子试验基于人工接种且接种物活力未独立量化；全基因组比较仅含5株选择性分离株；预测的效应蛋白、CAZymes等未进行功能验证；杀菌剂敏感性仅在体外评估。这些局限不否定所观察到的分离株水平表型差异，但排除了对自然侵染效率、物种级基因组特征、自然种子传播或田间抗性的推断。未来研究应重点在完整植株上确认致病性、评估自然定殖和种子传播、扩大种群监测及其杀菌剂敏感性，并通过功能验证阐明个体分离株致病力的分子机制。