基于UV图像与VGG16深度学习模型的污染干无花果中黄曲霉毒素B1浓度分类研究

《Toxins》：Classification of Contaminated Dried Figs According to Their Aflatoxin B1 Concentrations by Deep Learning-Based VGG16 Model

　　

黄曲霉毒素是毒性次级代谢产物，其中黄曲霉毒素B₁被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物。黄曲霉毒素在紫外光下呈现荧光。曲酸是曲霉属（Aspergillus）产生的另一种物质，亦被报道具有荧光特性。上述化合物通常采用色谱法及快速检测试纸条进行检测。本研究旨在通过卷积神经网络（CNN）图像处理方法分析紫外（UV）图像，对干无花果中黄曲霉毒素B₁浓度进行分类，从而降低对色谱法的依赖。新鲜无花果经切片、干燥后接种黄曲霉（Aspergillus flavus，A. flavus）。在21天培养期内以7天为间隔，通过色谱分析监测黄曲霉毒素与曲酸水平变化，并同步采集图像。利用浓度为5至250 μg/L的不同黄曲霉毒素B₁标准溶液的UV图像构建训练集、验证集与测试集。基于VGG16的模型总体精确率、召回率与F₁分数分别为0.96、0.96与0.95。模型对无花果样本的准确率为0.64至1.00，凸显了基于图像分析作为快速筛查方法的潜力。第0天高效液相色谱（HPLC）未检出黄曲霉毒素B₁，无花果样本中亦未观察到荧光，据此模型将所有样本判定为黄曲霉毒素B₁阴性。综上，所构建模型能够对预定义的黄曲霉毒素B₁浓度水平（包括最低5 μg/L类别）进行分类，有望为快速、低成本、基于图像的分析系统的开发作出重要贡献。

本研究针对干无花果中黄曲霉毒素B₁（AFB₁）污染快速筛查的需求，探索了紫外（UV）荧光成像结合深度学习图像处理方法对AFB₁浓度进行预定义类别分类的可行性。研究背景在于：无花果（Ficus carica）在开放环境下干燥过程中易受曲霉属（Aspergillus）真菌侵染而产生黄曲霉毒素，其中AFB₁被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物，欧盟对即食干无花果中AFB₁和总黄曲霉毒素分别设定了6 μg/kg和10 μg/kg的最高限量，各国限量在2至30 μg/kg之间不等。目前依赖高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱及免疫层析快速检测试纸条等色谱或免疫学方法进行检测，这些方法或耗时、成本高、需专业人员操作，或在检测限、分析特异性及可检测浓度范围方面存在局限。土耳其工业界长期利用紫外灯（365 nm）下亮绿黄色荧光（BGYF）对干无花果进行人工分选，但荧光的来源尚未完全阐明，且荧光强度可能受日照或水洗影响而减弱，部分产毒菌株不产生曲酸，仅凭荧光存在与否并不能必然指示AFB₁污染，存在误判风险。已有基于荧光、高光谱成像与机器学习的黄曲霉毒素检测研究多集中于区分样本是否含毒或检测高浓度水平，对接近或低于法定限量的浓度缺乏可靠检测研究，且"有/无"的二分类结果不足以确定黄曲霉毒素浓度。鉴于此，研究人员提出假设：UV-A图像中含有可供基于VGG16的模型区分预定义AFB₁浓度类别的特征，并在受控条件下以接种黄曲霉（A. flavus）的干无花果切片及自然污染样本开展研究，同时监测AFB₁与曲酸的产生，评估图像处理技术在基于图像的浓度分类方面的适用性。研究结果表明，基于VGG16的模型在AFB₁标准溶液图像上取得总体精确率、召回率与F₁分数分别为0.96、0.96与0.95的性能；在无花果样本上模型准确率为0.64至1.00；第0天HPLC未检出AFB₁且样本无荧光，模型将全部样本判为阴性；模型能够对包括最低5 μg/L类别在内的预定义AFB₁浓度水平进行分类。该研究的意义在于，所构建方法虽仍需匀质、溶剂提取、过滤、稀释及免疫亲和柱净化等前处理步骤，但可免除色谱检测环节，模型处理图像并给出分类结果的时间可短至1分钟（取决于计算硬件或可进一步缩短至数秒），有望减少对训练有素人员操作HPLC及解读结果的需求，为快速、低成本、基于图像的分析系统开发提供潜力，并为干无花果的快速筛查提供替代途径；同时研究人员指出，模型目前仅对预定义浓度类别进行分类，对接近法规限量的干无花果样本的可靠分类能力尚未确立，尚需在更宽浓度范围和更多样本上进一步验证。

在技术方法方面，研究以新鲜Sar?lop无花果横向切片（厚1 cm），经家用食品干燥机分别干燥4、8、12、16 h并监测水分活度（a_w）与水分含量，选取干燥8 h（a_w：0.942 ± 0.01）的切片用于后续实验；以黄曲霉（A. flavus，MAM-200682，TüBITAK马尔马拉研究中心菌种保藏中心）制备浓度为3.0 × 10⁷孢子/mL的孢子悬液接种，30 °C培养21天，于第0、7、14、21天取样，每个采样时间设三个平行组、每组10片，组内匀质后作为独立重复（n = 3）。黄曲霉毒素分析采用改良AOAC 991.31法，经甲醇-水提取、免疫亲和柱（Aflastar）净化后以配备荧光检测器的HPLC定量，激发与发射波长分别为362 nm与455 nm，并采用电化学柱后衍生；曲酸分析参照Kushiro等方法，经甲醇提取、超声、过滤后以配备光电二极管阵列检测器的HPLC于270 nm检测。成像方面，在紫外柜内构建成像箱，以智能手机相机（48 MP，8000 × 6000像素）配合365 nm UV-A光源，对置于石英管中的1 mL提取液拍摄图像，每个类别设三个独立实验组分别构建训练集（300张）、验证集（300张）与测试集（90张），共690张图像以降低数据泄漏风险；图像处理采用OpenCV将图像二值化并以10 × 10椭圆结构元素滤波，裁剪发光区域后输入以ImageNet预训练权重初始化的VGG16卷积神经网络（CNN）模型，全网络可训练，加装含256个神经元的全连接隐藏层（ReLU激活）与含6个神经元及Softmax激活的输出层，采用RMSprop优化算法、批大小16、训练25个轮次，损失函数为sparse_categorical_crossentropy，学习率0.001，并通过旋转、色彩与亮度调整（对比度与亮度变化20%、随机缩放[0.8, 1.2]）进行数据增强；统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验，以p < 0.05为差异显著。自然污染样本由出口商协会提供，约10 kg（约500个果实）在UV灯下逐个检查，选取荧光果实分为三组（每组约3.3 kg，150–160个果实），各组分别研磨后取300 g子样本分析；未污染对照样本购自超市，经UV灯确认为无荧光后分为三组（每组约300 g）分别匀质。

研究结果如下。在"干燥对黄曲霉生长及水分的影响"方面，研究人员测定了不同干燥时间（4、8、12、16 h）无花果切片的水分活度与水分含量，并接种黄曲霉孢子悬液培养7天；结果显示，干燥4 h的样品中霉菌孢子扩散、切片失水且无法保持结构完整性，干燥12 h仅见极少量霉菌生长，干燥16 h未见生长；水分活度为0.99与0.94的人工污染样品可见霉菌生长，而水分活度为0.86与0.65的样品未见生长；由于黄曲霉在干燥8 h（a_w：0.942 ± 0.01）的切片上保持结构并持续生长，该切片被用于后续研究。在"HPLC测定无花果中黄曲霉毒素与曲酸产生"方面，色谱分析显示人工污染样品在培养起始时不含黄曲霉毒素与曲酸；培养前7天黄曲霉毒素水平快速升高至24.23 ± 1.06 μg/L，曲酸同期快速升高至139.00 ± 12.00 mg/L；培养后期黄曲霉毒素水平基本恒定、无统计学显著变化，而曲酸产量出现波动并检出统计学显著变化；培养前14天内该菌株在无花果基质中产生的曲酸可达300 mg/L，至第21天曲酸水平大幅下降至106.00 ± 0.03 mg/L；自然污染样品中检出黄曲霉毒素（22.16 ± 0.97 μg/L），但未检出曲酸。在"成像与图像处理在无花果中的应用"方面，研究首先以AFB₁标准溶液（5、25、50、75、125、250 μg/L）在UV成像箱（365 nm，UV-A）中拍摄图像，观察到荧光随AFB₁浓度升高而增强；VGG16模型训练后总体准确率为0.96，5 μg/L类别的精确率为0.94、召回率为1.00，25、75与250 μg/L标准品的精确率、召回率与F₁分数均为1.00，表明所提出的图像处理与VGG16方法能够成功判定不同AFB₁浓度。将训练好的模型用于UV-A（365 nm）下拍摄的干无花果样本图像时，溶剂（甲醇）及培养第0天未见明显荧光，第7、14、21天可见荧光，自然污染样品呈现相似荧光模式；接种黄曲霉后培养7、14、21天的切片经HPLC测定浓度处于20–25 μg/L范围，因无20 μg/L专用类别而按25 μg/L归类；培养7天的切片全部分类正确，培养14天与21天的切片分类正确率分别为0.64与0.77，自然污染样本分类准确率为0.86；测试均使用第0、7、14、21天及自然污染类别各22张图像（来自同一实验装置），第0天与第7天22张图像全部分类正确，第14天有14张判为25 μg/L、6张判为50 μg/L、2张判为75 μg/L，第21天有17张正确判为25 μg/L、2张判为75 μg/L、3张判为50 μg/L，自然污染类别中19张判为25 μg/L、2张判为50 μg/L、1张判为75 μg/L，并给出了相应的混淆矩阵。在"曲酸的图像处理分类"方面，研究人员首先以不同浓度曲酸（5、12.5、25、50、75、100、250、500 mg/L）成像，未检测到荧光发射，遂提高成像所用曲酸浓度；1000 mg/L曲酸标准品虽可见荧光，但强度低于相同实验条件下黄曲霉毒素标准的荧光；对不同培养期的曲酸样品分析成像，均未检测到荧光发射。

讨论部分总结如下。在水分活度对黄曲霉生长的影响方面，研究确定干无花果切片上霉菌形成的最佳干燥时间为8 h，干燥8 h的切片（a_w：0.942）为黄曲霉生长提供了理想环境；既往研究表明，在25–35 °C及不同培养基（鹰嘴豆、脱壳花生）条件下黄曲霉生长与产毒的最佳水分活度须为0.92及以上，水分活度0.85及以下生长显著减弱、0.75及以下完全停止，本研究结果与文献报道一致。在黄曲霉毒素与曲酸产生方面，新鲜无花果可受多种微生物污染，黄曲霉毒素在无花果尚处半干燥状态的干燥过程中形成；树上干燥过程中无花果受黄曲霉等霉菌污染并迅速产生黄曲霉毒素；市场供应链调查显示干无花果中AFB₁水平变幅可从0.18至193.00 μg/L；接种黄曲霉的样品在培养期检出曲酸，而UV灯下发荧光的自然污染样品未检出曲酸，其原因可能包括所存在的黄曲霉菌株不能产生曲酸、化合物降解、提取回收率低或浓度低于检测限等，但由于本研究未开展真菌分离与鉴定，无法确定致污染的具体菌株，且有研究报道某些黄曲霉菌株可能不产生曲酸；黄曲霉的曲酸发酵可分为生长阶段与生产阶段，生长阶段部分葡萄糖与氮源用于促进生长并产生曲酸所需酶类，随后进入曲酸生产阶段，当曲酸浓度升至最大值后开始下降，其原因可解释为培养基中葡萄糖耗尽后曲酸进一步降解为草酸与乙酸，该分解过程产生细胞生长所需能量以维持生命，本研究分析结果与黄曲霉产生黄曲霉毒素和曲酸及其数量变化相一致。在UV成像与深度学习检测黄曲霉毒素方面，黄曲霉毒素与曲酸均被报道在UV照射下呈现荧光，部分研究将黄曲霉毒素与曲酸确定为荧光来源，另一些研究则特指黄曲霉毒素为荧光来源；传统上疑似受黄曲霉毒素污染的干无花果依据UV灯下的BGYF进行筛查，而本研究中受黄曲霉毒素污染的无花果样品提取物在UV照射下呈蓝色荧光，与工业上通常描述的绿黄色不同，一种可能解释是本研究采用的提取与净化程序去除或减少了无花果基质中存在的其他荧光化合物从而影响所观察的荧光特征；但由于免疫亲和柱净化程序旨在保留黄曲霉毒素而去除其他基质组分，仅凭成像结果无法将所观察荧光具体归因于AFB₁、曲酸或其他真菌代谢物，黄曲霉毒素及其他天然化合物对无花果中所观察荧光的贡献及其在UV照射下的潜在相互作用仍需进一步研究；黄曲霉毒素的荧光特性亦反映在其主要组别的命名中，UV照射下AFB₁与AFB₂发蓝色荧光，而AFG₁与AFG₂发绿色荧光。各国法规中AFB₁与总黄曲霉毒素限量范围为2至30 μg/kg；本研究中受污染干无花果样品在所分析提取物中约含22–24 μg/L AFB₁，分别相当于原始无花果样品中的35.2与38.4 μg/kg；所测试的最低黄曲霉毒素标准浓度（5 μg/L）相当于干无花果中的8 μg/kg；尽管计算浓度超过欧盟即食干无花果6 μg/kg的最高限量，结果仍表明VGG16模型对AFB₁浓度水平分类的潜力，但需进一步以干无花果样本验证其用于法规筛查的适用性；由于AFB₁浓度在单个无花果间可能存在较大变异，匀质组样本所测浓度可能无法完全反映单个果实间的差异；尽管VGG16模型在使用AFB₁标准溶液时表现出分类性能，但其对处于或接近法规限量的干无花果样本的可靠分类能力尚未确立，需使用AFB₁浓度更低（尤其接近法规阈值）的干无花果样本进一步验证以评估模型用于法规筛查的适宜性；结果显示所开发的AI模型能够准确分类低至5 μg/L的黄曲霉毒素浓度，模型在低与高AFB₁浓度下的性能表明所提方法是一种有前景的AFB₁水平快速分类途径；尽管流程仍涉及匀质、溶剂提取、过滤、稀释与免疫亲和柱净化，但模型免除了色谱检测的需要。与既往研究比较，Sadimantara等使用多种CNN模型（GoogLeNet、SqueezeNet、AlexNet与ResNet50）检测受黄曲霉毒素污染的可可豆，准确率达96%；另一项研究使用CNN模型（VGG16与1D-AlexNet）评估经高光谱成像获得的不同产品（如花生与玉米）图像，污染与未污染产品的测试准确率为96.35%至79.70%；现有研究多基于有无而非测定黄曲霉毒素浓度，而"有/无"分类不足以确定黄曲霉毒素浓度；Chakraborty等以含不同浓度AFB₁（25、40、70、200、300与500 μg/L）的标准污染玉米籽粒，经多种方法（多元散射校正（MSC）、标准正态变量变换（SNV）、Savitsky–Golay平滑及其组合）处理后以偏最小二乘判别分析（PLS-DA）与K近邻（KNN）分类以估计黄曲霉毒素浓度，但浓度为25、40与70 μg/L的样品被归为"低水平"类别且得分相似，据此认为该方法无法有效按浓度分类，而高浓度样品分类准确率可达98.30%；另一项研究采集高光谱图像检测玉米籽粒中不同浓度黄曲霉毒素（100、50、30、20与10 μg/L），经预处理（无、MSC、SNV与5–3平滑）后采用主成分分析（PCA）、X-loading与连续投影算法（SPA）进行波长与特征选择，最后以KNN、线性判别分析（LDA）与支持向量机（SVM）评估，模型性能为77.80%至87.30%；上述涉及10–500 μg/L AFB₁检测的两项研究虽取得成功，但应用于较低浓度（10、20、30与40 μg/L）时模型成功率较低；而本研究使用AFB₁标准图像在5 μg/L浓度下取得精确率0.94、召回率1.00与F₁分数0.97；但涉及玉米、花生与可可的研究针对表面特性异质的固体食品基质，样品外观与表面特性的变化可能带来额外挑战，相比之下本研究聚焦于受控且一致成像条件下预定义AFB₁浓度水平的分类，尽管样品基质与分析目标的差异限制了对分类准确率的直接比较，结果仍表明所提模型在所研究条件下用于AFB₁浓度类别分类的潜力。目前可用的黄曲霉毒素分析方法包括基于免疫亲和的荧光法，本研究开发的方法可为利用图像处理与AI对AFB₁浓度水平分类提供替代途径；尽管样品制备步骤仍需人工参与，但操作HPLC设备与解读结果所需的受训人员需求可能降低；样品装入HPLC后至少需20分钟方可获得结果，视色谱柱特性可能延长至1小时，而所开发的AI模型处理图像并给出分类结果可能仅需1分钟，视计算硬件或可缩短至数秒；但本研究未进行直接的时间或成本分析，故无法量化潜在的时间与成本节约；此外，所开发方法可为现有基于免疫亲和的荧光法（已具备定量、快速且无需色谱的特点）提供替代途径。在曲酸成像方面，本研究在1000 mg/L曲酸标准品中观察到微弱青绿色荧光，而在所用实验条件下所得提取物中未检测到可见荧光；研究所用成像箱配备365 nm（UV-A）灯，故图像在该波长下拍摄，但有研究报道曲酸的最大UV吸收位于280至284 nm之间，Hruska等（2014）报道曲酸衍生物的激发峰为395 nm、发射峰为495 nm；相比之下，基于VGG16的模型利用荧光图像对预定义AFB₁浓度类别进行了分类，表明该方法用于干无花果基于图像筛查的潜力。随着数字技术融入生活，各领域正发生深刻变化，利用数字技术进行分析可提供便利与速度并带来提高效率的机会；黄曲霉毒素分析在食品安全中具有重要作用，鉴于其毒性效应，监测农产品中的黄曲霉毒素至关重要；黄曲霉毒素分析包括从食品中提取黄曲霉毒素后采用HPLC等分析技术，所提方法虽未完全免除提取步骤，但通过图像处理与AI模型对预定义黄曲霉毒素浓度水平分类，为基于HPLC的分析提供了潜在替代途径，在本研究所评估的条件下可减少对色谱分析的需求；但尚需进一步验证以评估其适用于更宽浓度范围与更多样本的能力；当前模型对预定义黄曲霉毒素浓度水平进行分类，尚需开展额外工作以评估中间浓度。研究结论为：所开发的模型能够对预定义黄曲霉毒素B₁浓度水平（包括最低5 μg/L类别）进行分类，有望为快速、低成本、基于图像的分析系统的开发作出重要贡献。