《Toxins》：A Multi-Target Intervention Enhances Intestinal Integrity and Reduces Intestinal Stress in Weaned Piglets Fed Diets Naturally Contaminated with Mixtures of Fusarium Mycotoxins
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本研究旨在探究多靶点干预对饲喂受镰刀菌毒素混合物污染日粮的断奶仔猪肠道健康和生产性能的影响。为模拟养殖场条件，研究采用天然污染的原料。简言之，仔猪在断奶后35天内暴露于四种受多种霉菌毒素污染的日粮。选取两个玉米批次制备试验日粮，以获得低（L_MYC）和高（H_
本研究旨在探究多靶点干预对饲喂受镰刀菌毒素混合物污染日粮的断奶仔猪肠道健康和生产性能的影响。为模拟养殖场条件，研究采用天然污染的原料。简言之，仔猪在断奶后35天内暴露于四种受多种霉菌毒素污染的日粮。选取两个玉米批次制备试验日粮，以获得低（L_MYC）和高（H_MYC）多毒素污染日粮，并分别添加或不添加由膨润土、酵母细胞壁、银杏叶和水飞蓟素组成的混合物，形成2×2析因设计。在断奶后0~14天和14~35天两个饲养期以及整个试验期（断奶后0~35天）评估仔猪生长性能。此外，在断奶后第7天和第21天通过口服灌胃异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-d）并随后采血评估体内肠道完整性。在同一时间点收集粪便样品进行非靶向代谢组学分析。H_MYC日粮在试验前14天损害了仔猪生长性能，对肠道屏障产生负面影响，并在断奶后第21天导致肠道应激。日粮中添加该混合物改善了断奶后第21天的肠道完整性，并抵消了霉菌毒素引起的应激，且不受日粮中霉菌毒素水平的影响。
**研究背景** 镰刀菌毒素（
Fusarium mycotoxins）在饲料质量中具有重要影响，尤其对养猪生产。评估饲料原料污染时最常关注的毒素为受法规监管的
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、
玉米赤霉烯酮（ZEN）、T-2毒素和
伏马菌素B1+B2（FB1+FB2），因其普遍存在且关于其对猪毒性的信息较为充分。近年来其他镰刀菌毒素如
恩镰孢菌素（ENNs）的发生率有所增加，但由于缺乏限量指导值，ENNs未纳入标准饲料监测。因此，受监管镰刀菌毒素含量可忽略的日粮未必不含非监管毒素，对养猪生产仍构成风险。完全饲料的多种霉菌毒素严重污染需要能够覆盖大多数毒素并中和其对肠道完整性、健康和生长性能负面影响的解决方案。目标并非对单一霉菌毒素脱毒，而是最小化混合物效应同时支持肠道完整性。减少畜禽霉菌毒素暴露可部分通过添加某些成分实现，如用于黄曲霉毒素的膨润土或酵母细胞壁。然而，游离毒性化合物仍留在肠腔内，干扰微生物群、影响肠上皮和/或进入血液循环。肠道是日粮污染时第一个暴露于霉菌毒素的器官，导致肠道屏障破坏、免疫紊乱、应激、炎症和饲料效率降低。断奶后最初几天霉菌毒素暴露的影响尤为显著，因为仔猪经历日粮变化和社会动态应激。先前研究强调断奶仔猪比生长育肥猪对霉菌毒素更敏感。银杏叶提取物富含黄酮类化合物（如槲皮素、山柰酚、异鼠李素及其糖苷），已显示具有减轻肠道炎症和增强肠道屏障功能的能力。此外，霉菌毒素在肠道吸收后在肝脏代谢。水飞蓟素已成功用于支持肝功能并减少毒素解毒产生的氧化应激。本研究假设，将膨润土、酵母细胞壁、水飞蓟素和银杏叶提取物组合作为饲料添加剂混合物的日粮干预对饲喂含典型饲料浓度镰刀菌毒素日粮的仔猪具有有益效果。
**研究开展与结论** 研究人员开展了一项2×2析因试验，仔猪断奶后35天内暴露于四种受多种霉菌毒素污染的日粮，基于总污染水平分为低霉菌毒素（L_MYC）和高霉菌毒素（H_MYC），并进一步分为添加或不添加膨润土、酵母细胞壁、银杏叶和水飞蓟素混合物。在断奶后0~14天（weaner I）和14~35天（weaner II）以及整个试验期（0~35天）评估生长性能。此外，在断奶后第7天和第21天使用FITC-d作为标记物评估肠道完整性，并在同一时间点收集粪便样品进行非靶向代谢组学分析。研究得出，接触多种霉菌毒素无法避免；主要镰刀菌毒素水平升高损害了断奶仔猪的早期生长和肠道完整性，表明存在肠道应激。日粮添加该饲料添加剂混合物在断奶后第21天改善了肠道屏障，且不受日粮霉菌毒素水平影响，并减轻了对脂肪吸收和肠道应激的负面影响。该试验模拟养殖场条件，凸显了在仔猪生命早期——其对霉菌毒素暴露特别脆弱的时期——开发多靶点干预的潜力。通过粪便代谢组学使用非侵入性方法评估肠道应激的能力进一步增强了这一潜力。
**关键技术方法** 研究选用240头断奶仔猪（公母各半，29.0±0.6日龄），采用2×2析因设计随机分为四个日粮处理组，每组12个重复栏（每栏6头）。使用两个天然污染玉米批次制备低污染和高污染日粮。生长性能通过断奶时及第14天和第35天个体称重和每栏饲料称重评估平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和饲料转化率（FCR）。肠道完整性在断奶后第7天和第21天通过口服灌胃FITC-d（4.16 mg/kg体重）后150分钟颈静脉采血测定血清FITC-d浓度评估。粪便一致性每周两次按1~10分制评分。粪便样品在断奶后第7天和第21天经直肠刺激采集，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC/Q-TOF）进行非靶向代谢组学分析。数据采用一般线性模型（GLM）方差分析，代谢组学数据导入MetaboAnalyst 6.0进行交互主成分分析（iPCA）和方差分析-同时成分分析（ASCA）。
**研究结果**
**生长性能** 断奶仔猪初始平均体重为7.56 kg（范围6.63~8.35 kg）。霉菌毒素水平与饲料添加剂混合物补充之间的交互作用在weaner I期不显著。饲喂H_MYC日粮的仔猪第14天体重显著低于饲喂L_MYC日粮的仔猪。饲喂H_MYC日粮的断奶仔猪在weaner I期平均日增重显著降低，饲料转化率相对饲喂L_MYC日粮的仔猪呈增加趋势。在weaner II期，霉菌毒素水平×混合物交互作用呈趋势，H_MYC日粮倾向于增加FCR，而H_MYC日粮补充混合物倾向于改善FCR。考虑整个试验期（0~35天），除H_MYC日粮组FCR相对L_MYC无混合物组呈增加趋势外，各处理间性能无差异；L_MYC或H_MYC日粮补充混合物倾向于维持FCR与L_MYC日粮相似。
**肠道完整性评估** 断奶后第7天，霉菌毒素水平×混合物交互作用显著，H_MYC日粮增加了血清FITC-d浓度，但H_MYC日粮补充混合物使血清FITC-d水平维持与L_MYC日粮相似。第21天，霉菌毒素水平和混合物主效应均显著，但交互作用不显著。饲喂H_MYC日粮的仔猪血清FITC-d浓度显著高于饲喂L_MYC日粮的仔猪；另一方面，饲喂含混合物日粮的仔猪血清FITC-d浓度显著低于不含混合物日粮的仔猪。
**粪便一致性评分** weaner I期（0~14天）平均粪便评分为5.6±0.3，weaner II期（14~35天）为6.2±0.3，整个试验期为5.8±0.3。饲喂H_MYC日粮的仔猪weaner I期粪便评分（5.4）显著低于饲喂L_MYC日粮的仔猪（5.9）。在饲喂H_MYC日粮加混合物的仔猪中未观察到这一差异（5.6）。
**粪便代谢组学** 粪便代谢组学数据的多变量分析表明实验组之间存在分离。第7天粪便样品的iPCA显示聚类分离模式，经PERMANOVA确认（p=0.001；999次置换），组别身份解释了14.2%的观察方差。第21天粪便样品也存在聚类分离模式（PERMANOVA：p=0.001；999次置换），组别身份解释了14.2%的观察方差。第7天粪便样品中鉴定出125种代谢物并采用ASCA模型分析，模型经置换方法验证，显示霉菌毒素水平（p<0.005）和混合物（p<0.005）对粪便代谢组均有显著影响，但二者效应独立，霉菌毒素水平×混合物交互作用不显著（p=0.25）。与L_MYC日粮相比，H_MYC日粮增加了粪便中丙基丁酸酯和2-甲基丁醛的水平；与未补充混合物相比，补充混合物降低了粪便中PC(P-18:0/22:1(13Z))和xi-2-乙基-1-己醇水平，增加了8-[(氨甲基)硫烷基]-6-硫烷基辛酸和2-甲基丁醛水平。第21天粪便样品中鉴定出126种代谢物并采用ASCA模型分析，模型验证显示霉菌毒素水平（p<0.005）和混合物（p<0.005）对粪便代谢组均有显著影响，但效应独立（交互作用p=0.11）。与L_MYC日粮相比，H_MYC日粮增加了粪便中皮质酮代谢物corteloxone水平。日粮中添加混合物降低了粪便中DG(16:0/18:1(11Z)/0:0)水平，增加了S-甲基-3-甲硫基丁酸酯和壬醛水平。
**讨论与结论** 本研究应用析因设计评估多靶点饲料干预对暴露于低和高水平霉菌毒素污染的断奶仔猪的效果。L_MYC和H_MYC日粮的区别在于所用玉米批次，但其他成分相同以获得等能和等氮日粮。边际污染DON、ZEN和FB1+FB2的玉米批次ENN水平高于高污染玉米批次，导致L_MYC日粮中ENN水平为449~910 μg/kg，H_MYC日粮中为327~575 μg/kg。其他镰刀菌毒素水平的差异也影响了仔猪生长性能，尤其在断奶后前14天。具体而言，饲喂H_MYC日粮的仔猪ADG低于饲喂L_MYC日粮的仔猪，导致H_MYC组仔猪第14天体重显著降低。断奶后前两周仔猪对肠道损伤更敏感，因为其肠上皮细胞周转效率低，表现为细胞增殖和分化减少以及凋亡增加。此外，断奶应激有利于肠道屏障破坏，尤其在断奶后前21天。这些因素可能解释L_MYC和H_MYC日粮组仔猪在断奶后14~35天ADG无差异。肠道完整性在断奶后第7天和第21天评估。H_MYC日粮降低了肠道屏障完整性，除非日粮中添加混合物。第21天，无论日粮如何，所有仔猪血清FITC-d水平均较低，但H_MYC日粮损害了肠道屏障，而添加混合物改善了肠道屏障。FITC-d是评估肠道旁细胞通透性的常用指标。DON破坏肠道完整性的能力已被证实。本试验中未发生细菌感染暴发。进行非靶向粪便代谢组学以鉴定受霉菌毒素暴露增加和混合物添加影响的生物标志物。各组显示出独特的粪便代谢指纹，表明代谢差异。霉菌毒素水平和混合物对粪便代谢组产生显著的独立效应，与采样时间点无关。日粮中霉菌毒素水平增加导致仔猪应激，表现为第21天粪便中皮质醇代谢物corteloxone水平升高。与唾液分析不同，粪便皮质醇代谢物水平受日常变化或操作应激影响较小，因此在本研究中作为日粮/肠道应激的可靠标志物。在其他代谢物中，大多数效应与挥发性有机化合物（VOCs）的丰度有关，这些化合物由肠上皮代谢、微生物群代谢或日粮变化产生。这些代谢变化可能与肠道微生物种群变化以及肠道应激有关。H_MYC日粮导致第7天丙基丁酸酯和2-甲基丁醛排泄增加以及第21天corteloxone增加。这些VOCs可作为人类胃肠道疾病和应激的潜在生物标志物。日粮中添加混合物导致微生物种群和氨基酸代谢的可能转变，第7天粪便中含硫挥发性代谢物8-[(氨甲基)硫烷基]-6-硫烷基辛酸水平增加，第21天S-甲基-3-甲硫基丁酸酯水平增加。8-[(氨甲基)硫烷基]-6-硫烷基辛酸参与脂肪酸合成和β-氧化，而S-甲基-3-甲硫基丁酸酯在克罗恩病患者中丰度较高，但未被确定为炎症生物标志物。一项体外研究表明壬醛诱导低水平慢性炎症，该代谢物因其激活促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）的能力而被鉴定为小鼠粪便中的促炎挥发性代谢物，并与人类肠道炎症（克罗恩病）相关。在受混合物添加影响的代谢物中，第21天粪便壬醛水平降低。Xi-2-乙基-1-己醇在饲喂不含混合物的L_MYC或H_MYC日粮仔猪粪便中丰度较高。该VOC与增塑剂暴露相关，尤其在新生儿粪便中较成人更为常见。遗憾的是，无法解释为何日粮补充混合物后该VOC水平降低及其生物学意义。饲喂含混合物日粮的仔猪粪便中磷脂酰胆碱PC(P-18:0/22:1(13Z))水平降低。虽然该磷脂酰胆碱尚未在专门研究中被检验，但磷脂酰胆碱排泄增加与人类肠道炎症和蛋鸡霉菌毒素暴露（DON）相关。本研究的局限性在于缺乏细胞因子和急性期蛋白评估或组织分析以确认炎症过程。因此，当前发现不能声称存在肠道炎症，但表明肠道内正在发生应激。饲喂含混合物日粮的仔猪粪便中另一种脂质组学标志物DG(16:0/18:1(11Z)/0:0)也降低，这可能表明脂质消化改善和肠道健康改善。甘油三酯（TG）含有长链脂肪酸，吸收前必须分解为甘油二酯（DG）、甘油单酯（MG）、脂肪酸和甘油。因此，粪便中DG增加可能表明脂肪酸未被正常吸收。饲喂50或500 μg黄曲霉毒素B1/kg日粮干物质的山羊呈现循环DG(16:0/18:1(11Z)/0:0)水平升高等代谢物变化，作为肝细胞损伤和致癌性的指示。混合物的效应独立于霉菌毒素水平，表明该混合物可降低肠道应激并改善健康，无论日粮中霉菌毒素水平如何。代谢组学分析中霉菌毒素水平与混合物之间缺乏交互作用与生长性能和粪便评分的研究结果形成对比。混合物和霉菌毒素可能具有不同的作用机制：混合物可能不针对霉菌毒素影响的特定部位，但最终增强肠道屏障完整性。基于本研究数据，接触多种霉菌毒素无法避免。主要镰刀菌毒素水平升高损害了断奶仔猪的早期生长和肠道完整性，表明存在肠道应激。日粮补充该饲料添加剂混合物在断奶后第21天改善了肠道屏障，无论日粮中霉菌毒素水平如何，并减轻了对脂肪吸收和肠道应激的负面影响。该试验模拟养殖场条件，凸显了在仔猪生命早期——其对霉菌毒素暴露特别脆弱的时期——开发多靶点干预的潜力。通过粪便代谢组学使用非侵入性方法评估肠道应激的能力进一步增强了这一潜力。然而，需要进一步研究评估此类混合物的有效性。因此，有必要将粪便代谢组学数据与使用血清或血浆生物标志物的全身暴露分析以及肠道组织完整性评估相结合。
