《Cell Reports》：A single-cell comprehensive atlas of leukemia and its microenvironment
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急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）仍具有高度致死性，其治疗失败与复发由白血病生态系统内动态的细胞状态及不断演化的相互作用所驱动。在本研究中，研究人员构建了白血病及其微环境综合图谱（comprehensive atlas of
急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）仍具有高度致死性，其治疗失败与复发由白血病生态系统内动态的细胞状态及不断演化的相互作用所驱动。在本研究中，研究人员构建了白血病及其微环境综合图谱（comprehensive atlas of leukemia and its microenvironment，CALM），整合了来自73例AML样本和9例健康供者（healthy donors，HD）的单细胞分析、87例初诊患者的批量RNA测序（bulk RNA sequencing，RNA-seq），以及4对配对骨髓（bone marrow，BM）与外周血（peripheral blood，PB）单细胞数据。所有数据集均关联了临床、细胞遗传学、分子学及治疗反应注释。免疫分析揭示了不同疾病状态下T细胞的多样化分布，其中持续性疾病（persistent disease，PD）患者表现出更显著的克隆扩增。基于常规T细胞的机器学习建模鉴定出一个与AML及患者结局相关的T细胞特征，并在两个独立队列中得到验证。CALM是一个公开可访问的交互式门户网站（calm.mdanderson.org），可用于探索细胞组分、细胞间相互作用以及纵向转录和克隆动态，以促进假说生成、生物标志物发现和靶点验证。
研究背景与意义
急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种高度异质性的血液系统恶性肿瘤，其生态系统呈现出深刻的分子和细胞异质性。AML具有独特的生物学特征，包括未成熟造血细胞的克隆性扩增、白血病起始细胞的表型异质性、微环境重编程、复发性遗传学和表观遗传学异常，以及复杂的分化轨迹，这些因素共同导致了其多变的临床表现和治疗反应。尽管异基因造血干细胞移植可通过免疫介导的肿瘤清除发挥治愈潜力，但AML对基于免疫检查点阻断的疗法响应有限，与实体瘤中的显著成功形成鲜明对比。因此，理解疾病各阶段的免疫动态和分子决定因素对于推进肿瘤免疫学和指导免疫治疗策略至关重要。此外，AML及其肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的复杂性对理解基因型与表型之间的相互作用、不同细胞亚群之间的通讯以及免疫重塑的动态过程构成了挑战，从而阻碍了可用于治疗靶向的功能脆弱点的发现。
既往实体瘤单细胞图谱研究已鉴定出罕见的治疗耐药亚群、绘制了免疫抑制细胞状态（如耗竭性CD8+ T细胞和调节性T细胞），并揭示了复杂的基质-免疫相互作用。然而，这些工作主要集中于正常组织或实体瘤，使得白血病及其免疫生态系统在很大程度上未被充分表征。尽管近期人类造血系统的单细胞转录组研究已生成了参考图谱和计算框架，可将AML细胞快速映射至正常细胞状态，但仍缺乏一个以AML为中心、整合了不同疾病背景下恶性与免疫组分的综合图谱。这一空白代表了一个错失的机会，无法系统性地探究控制AML治疗反应、免疫功能障碍和复发的细胞程序。
为解决这一未满足的需求，一个交互式、开放获取的AML单细胞图谱可作为统一的参考框架，使研究者和临床医生能够快速查询恶性及免疫细胞状态下的基因表达、在特定生物学或临床分层中探究信号通路和细胞程序，以及将新患者样本或实验数据集置于大规模、临床注释的参考背景下进行解读。本研究旨在建立CALM，通过整合来自73例不同疾病状态患者样本、9例健康供者以及4例配对BM/PB患者的单细胞测序数据，以及87例初诊患者的批量RNA-seq数据，为AML研究社区提供一个实用的分析框架和资源，以支持大规模分析、发现疾病相关状态和识别新的治疗靶点。
研究内容与主要发现
研究人员构建了CALM，整合了来自43例患者的73份临床样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）及配对单细胞T细胞受体（scTCR）/B细胞受体（scBCR）谱系数据，包括35份诱导治疗前初诊样本、13份缓解期样本和25份持续性疾病样本，以及9例健康供者样本。经严格质量控制后，共获得404,783个高质量细胞，涵盖161,681个恶性细胞和243,102个非恶性骨髓TME细胞。通过整合拷贝数变异推断、聚类分布、谱系特异性基因表达、免疫组化、流式细胞术和常规细胞遗传学信息进行细胞注释，鉴定出8种主要TME细胞类型。CALM以交互式网络门户形式公开提供，包含六个功能模块：基本统计、UMAP可视化、小提琴图、差异表达分析、基因相关性分析和预计算的细胞间相互作用分析。
主要研究结果
重塑的T细胞景观与跨疾病阶段的克隆扩增
通过丰度分析，研究人员观察到AML样本中T细胞和NK细胞比例增加，而髓系细胞和B细胞比例降低。缓解期样本中T细胞密度高于初诊和持续性疾病样本。配对scTCR分析检测到11,208个克隆型，持续性疾病组表现出显著更高的T细胞克隆扩增和最低的克隆多样性，且扩增强烈偏向CD8+亚群，特别是活化和效应CD8簇。
CD4和CD8 T细胞的转录与克隆多样性
无监督聚类分析鉴定出15个CD4簇（定义为6个亚型：初始、记忆、辅助、调节、干扰素应答和细胞毒性）和15个CD8簇（定义为6个亚型：初始、活化、效应、干扰素应答、记忆和增殖）。CD8效应和增殖群体仅在AML患者中富集，而初始和记忆群体在健康供者中丰度较高。持续性疾病主要驱动CD8效应和增殖群体的富集。CD8 T细胞含有显著更大的克隆，克隆优势主要发生在CD8效应和活化亚型中。
轨迹推断揭示CD8 T细胞的功能可塑性
通过比较8种常用轨迹推断工具，Monocle3在识别造血发育趋势方面表现最优。轨迹分析揭示了CD8细胞从初始到效应状态的连续体，持续性疾病组细胞富集于轨迹晚期区域。CD8效应细胞沿连续轨迹从高功能障碍、高细胞毒性的状态向低细胞毒性但更具增殖性的表型转变。
骨髓驻留与循环AML细胞呈现不同转录程序
对4例初诊AML患者的配对BM/PB单细胞分析显示，BM AML细胞高表达单核细胞分化、代谢和增殖相关基因，而PB AML细胞上调NF-κB调控信号和应激反应相关基因。BM中CXCR4表达较高，PB中CD82表达较高。BM微环境表现出更多数量和更强强度的预测配体-受体（ligand-receptor，LR）相互作用，而PB相互作用富集于整合素介导的黏附相关LR对。
机器学习驱动的T细胞特征及其临床意义
通过机器学习特征选择，研究人员从初诊AML患者与健康供者的常规T细胞中鉴定出68个关键基因。进一步整合TCGA、BeatAML和MDACC三个队列共631例初诊AML患者的批量RNA-seq数据，单变量生存分析发现13个基因与总生存期显著相关，多变量Cox模型确定5个基因（EIF4B、CLIC1、SOCS1、DYNLT1和FKBP5）具有独立预后价值。该5基因特征在整合队列和独立验证队列中均与总生存期显著相关，且独立于年龄、原始细胞比例和细胞遗传学/ELN风险等已知预后因素。
研究结论与意义
本研究建立了一个高分辨率的纵向AML单细胞参考图谱，首次将整个造血景观与配对BCR和TCR谱系数据全面整合。该资源揭示了疾病阶段依赖的TME动态重塑、T细胞表型多样性与克隆架构的关联、骨髓驻留与循环AML细胞的差异转录程序，以及具有临床预后价值的5基因T细胞特征。CALM作为一个公开可访问的交互式门户，为白血病研究社区提供了可重复挖掘、分析和可视化的综合资源，有望加速假说生成、生物标志物发现和靶点验证，最终推动更有效的精准免疫治疗策略的发展。研究局限性包括缺乏空间分辨率、CITE-seq表面蛋白信号较低、配对样本量有限（n=4对）以及机器学习衍生T细胞特征需进一步功能验证。
关键技术方法
本研究整合了来自MD Anderson癌症中心的73例AML患者样本和9例健康供者样本的单细胞RNA测序及配对TCR/BCR谱系数据，以及87例初诊患者的批量RNA-seq验证队列。主要技术方法包括：10x Genomics 5′单细胞平台进行基因表达和免疫谱系分析；Harmony算法进行批次效应校正；inferCNV推断拷贝数变异辅助恶性细胞鉴定；Symphony将细胞投射至BoneMarrowMap参考图谱验证注释；miloR进行邻域差异丰度分析；STARTRAC和scRepertoire进行克隆动态分析；DoRothEA和PROGENy推断转录因子活性和通路活性；Monocle3进行轨迹推断；MultiNicheNet推断配体-受体相互作用；机器学习（Wilcoxon秩和检验、逻辑回归、混合效应模型）进行特征基因选择；Cox比例风险模型和Kaplan-Meier分析进行生存分析。
