棉铃虫eIF3L通过调控Cry1Ac受体基因CAD、ABCC2和ABCC3的表达影响其对Cry1Ac的敏感性

《Toxins》：Helicoverpa zea Boddie (Lepidoptera: Noctuidae) Remains Susceptible to Vip3A Across the Southeastern USA: Eight Years of Diet-Overlay Monitoring Highlight the Need for Annual Benchmarking

　　

大规模种植转Bt基因作物已导致靶标害虫对Bt蛋白（尤其是Cry1Ac）产生抗性。在持续的选择压力下，棉铃虫（Helicoverpa armigera）在室内和田间种群中均已进化出对Bt蛋白的抗性，这凸显了全面阐明害虫Bt抗性分子机制的迫切需求。前期研究已证实，真核翻译起始因子eIF2在调控Bt抗性中发挥关键作用。研究人员前期的RNA-seq数据显示，eIF3L在棉铃虫敏感品系和Cry1Ac抗性品系之间的表达水平存在显著差异。本研究进一步观察到，在Cry1Ac暴露后存活的幼虫中，eIF3L的mRNA水平显著降低。更重要的是，eIF3L的异源表达提高了Sf9细胞对Cry1Ac的敏感性。与此一致的是，敲低eIF3L与棉铃虫幼虫在Cry1Ac暴露下死亡率降低相关。综合体内和体外实验结果，研究人员认为eIF3L参与了Cry1Ac的毒性过程。此外，eIF3L影响Cry1Ac受体基因CAD、ABCC2和ABCC3的表达。综上所述，这些结果表明eIF3L的下调与棉铃虫对Cry1Ac敏感性降低相关，为昆虫对Bt蛋白抗性的分子机制提供了新的见解。

研究背景方面，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）产生的杀虫蛋白广泛应用于全球农业害虫防治，转Bt基因作物带来了巨大的经济和环境效益。然而，随着转Bt基因作物的广泛种植，靶标害虫对Bt蛋白的抗性发生日益增多，涉及至少11种害虫和9种杀虫蛋白，严重威胁Bt蛋白的长期有效性。全面理解靶标害虫对Bt蛋白的抗性机制对于开发抗性监测技术和制定抗性治理策略至关重要。Cry毒素是用于害虫防治的主要Bt蛋白，昆虫摄入后Cry蛋白被蛋白酶激活并与中肠受体结合，损伤上皮细胞最终导致昆虫死亡。中肠受体的突变或下调被认为是抗性的主要原因，已鉴定的中肠受体主要包括碱性磷酸酶（ALP）、钙黏蛋白（CAD）、氨肽酶（APN）和ATP结合盒（ABC）转运蛋白。近年来研究还表明转录因子FOXA和GATA参与调控Cry1Ac受体基因的表达，影响棉铃虫对Cry1Ac的敏感性。在真核细胞中，蛋白质翻译的调控主要发生在起始阶段，真核翻译起始因子（eIF）是蛋白质合成起始阶段的主要调控因子。近期研究表明eIFs具有翻译起始之外的额外调控功能。值得注意的是，棉铃虫Cry1Ac抗性品系中eIF2的转录水平显著降低，eIF2调控受体基因CAD、ABCC2和ABCC3的表达从而赋予棉铃虫Cry1Ac抗性。eIF3由13个保守亚基（a~m）组成，在起始过程中发挥核心作用，eIF3亚基对生物体在多种胁迫条件下的存活至关重要。在秀丽隐杆线虫中，eIF3k或eIF3l的突变增加了通用胁迫抗性。前期研究表明eIF3亚基参与Cry1Ac毒性，eIF3L在酵母双杂交筛选中被鉴定为Cry1Ac的潜在互作蛋白，但eIF3L是否参与Cry1Ac毒性仍不清楚。棉铃虫是Bt作物的主要靶标害虫，在Bt毒素长期选择压力下已对Cry1Ac蛋白产生抗性。鉴于eIF2在Bt抗性中的重要功能，研究人员旨在探索其他eIFs在Cry1Ac毒性中的作用，通过qRT-PCR、细胞毒性实验和RNAi研究eIF3L在Cry1Ac毒性和抗性中的作用，为靶标害虫Cry1Ac抗性机制提供见解。

关键技术方法方面，研究人员从棉铃虫中克隆了eIF3L基因，利用NCBI数据库序列信息和转录组数据设计引物进行基因克隆；采用qRT-PCR检测eIF3L在不同发育阶段、不同组织以及在Cry1Ac胁迫下和抗性品系中的表达模式；构建pIEx-eIF3L-GFP载体在Sf9细胞中瞬时表达并进行细胞毒性实验，通过台盼蓝染色观察细胞死亡；利用Western blot验证蛋白表达；通过dsRNA显微注射进行RNAi实验结合幼虫生物测定评估eIF3L敲低后幼虫对Cry1Ac的敏感性变化；采用双荧光素酶报告基因实验检测eIF3L对受体基因启动子活性的影响。研究所用敏感品系96S于1996年采自中国河南省新乡县田间，Cry1Ac抗性品系BtR通过室内筛选获得，对Cry1Ac的抗性倍数约为3000倍。

研究结果方面，生物信息学特征与系统发育分析表明，从棉铃虫中克隆的eIF3L开放阅读框全长为1632 bp，编码543个氨基酸残基，预测分子量为63.43 kDa，等电点为6.11，系统发育分析显示eIF3L蛋白与粉纹夜蛾同源性最高且进化上保守。时空表达模式方面，eIF3L在棉铃虫各发育阶段均有表达但水平不同，蛹期转录水平最高，其次为卵、幼虫和成虫期，其中四龄幼虫转录水平最低；在五龄幼虫各组织中，eIF3L转录丰度在马氏管中最高，其次为前肠、后肠、中肠、血淋巴、头部、表皮和脂肪体。Cry1Ac处理幼虫及抗性品系中eIF3L表达降低方面，在敏感品系96S幼虫中肠组织中，Cry1Ac处理后的四个时间点eIF3L相对表达量较对照组显著降低；此外，与敏感品系96S相比，Cry1Ac抗性品系BtR中eIF3L表达显著下调。eIF3L瞬时表达增强Sf9细胞对Cry1Ac敏感性方面，转染pIEx-eIF3L-GFP的Sf9细胞呈现GFP荧光，Western blot证实eIF3L在蛋白水平成功过表达；转染48 h后加入活化Cry1Ac蛋白，表达eIF3L-GFP的细胞死亡率较仅表达GFP的细胞显著增加约41个百分点，eIF3L异源表达显著提高了细胞对Cry1Ac的敏感性。敲低eIF3L与Cry1Ac处理下幼虫死亡率降低相关方面，注射dsRNA 48 h后eIF3L转录水平较对照组显著降低，基因沉默效率约为49%；在300 μg/g Cry1Ac杀虫蛋白处理下，敲低eIF3L的幼虫死亡率较对照显著降低约17个百分点。eIF3L影响受体基因CAD、ABCC2和ABCC3表达方面，敲低eIF3L后CAD、ABCC2和ABCC3的mRNA丰度显著降低；双荧光素酶报告基因实验显示，与对照组相比共转染eIF3L显著增加了荧光素酶活性，表明eIF3L影响CAD、ABCC2和ABCC3的表达。

讨论部分总结如下：Cry蛋白抗性的进化严重威胁Bt杀虫蛋白的可持续应用，然而抗性机制的完整调控网络仍知之甚少。真核翻译起始因子在调控基因表达、细胞分化和凋亡中发挥关键功能。本研究中eIF3L在棉铃虫各阶段和组织中广泛表达，与其在鳞翅目昆虫中的表达模式一致，其在马氏管和肠道中的较高表达提示可能参与胁迫响应。eIF3L转录水平在Cry1Ac处理后存活幼虫中降低，暗示其在Cry1Ac毒性过程中的潜在作用。Sf9细胞中eIF3L瞬时表达增强了对Cry1Ac的敏感性，RNAi敲低eIF3L与幼虫死亡率降低相关，这与eIF2的研究结果类似，表明eIF3L也影响Cry1Ac毒性。研究结果还表明eIF3L影响CAD、ABCC2和ABCC3的表达，但结果仅限于转录水平和启动子活性分析，其潜在机制尚不清楚，应视为eIF3L可能影响受体基因表达的初步证据。本研究首次报道了eIF3L与Cry1Ac受体基因表达之间的关联，为未来研究其分子机制提供了理论基础。eIF3L除了在翻译起始中的重要作用外，可能还具有其他生理功能。研究人员推测eIF3L可能直接或间接与Cry1Ac互作：第一，eIF3L调控受体基因表达从而影响Cry1Ac结合能力和毒性；第二，eIF3L可能与Cry1Ac互作或调节细胞胁迫响应，独立于受体表达影响毒性。本研究虽发现eIF3L敲低降低了受体基因转录水平，但未测定受体蛋白水平和Cry1Ac结合能力，因此不能确定受体mRNA变化与敏感性变化之间的直接联系。研究结论部分翻译如下：综上所述，研究人员发现敲低eIF3L与棉铃虫幼虫对Cry1Ac敏感性降低相关。这些发现为棉铃虫对Cry1Ac的抗性机制提供了新的见解，对害虫抗性治理策略的开发具有积极影响。