西藏自治区地衣叶状体中五个具有抗真菌和细胞毒活性的新篮状菌属物种

《Journal of Fungi》：Five New Tolypocladium Species from Lichen Thalli in the Tibet Autonomous Region with Antifungal and Cytotoxic Activities

　　

与地衣叶状体相关的内生真菌（endolichenic fungi）仍缺乏充分记载。在中国西藏自治区开展的地衣调查中，研究人员从8种地衣中分离获得12株篮状菌属（Tolypocladium）菌株。初步ITS筛查显示其与已描述物种的序列相似性较低，遂进行详细的分类学研究。基于ITS、LSU、rpb2和tef1-α序列的多基因系统发育分析（multilocus phylogenetic analyses）将这些菌株解析为5个获得良好支持、在谱系上相互独立的进化支，分别代表5个新种：Tolypocladium crinitum sp. nov.、T. ellipsoideum sp. nov.、T. orientalis sp. nov.、T. parapustulatum sp. nov.和T. xizangense sp. nov.。各基因座一致的單系性（monophyly）、大量固定核苷酸替换（fixed nucleotide substitutions）以及可鉴别的形态特征支持了物种界定。在初步生物活性测定中，所选菌株在测试浓度下对两种植物病原菌表现出至少50%的抑制率，并对H460和A549细胞表现出不同程度的细胞毒性（cytotoxicity）。由于大多数菌株仅在单一浓度下测试，且未测定IC₅₀值及对正常细胞的影响，上述结果尚属初步。本研究增加了对地衣生境中篮状菌属多样性的认识，并为今后中国高山环境地衣内生真菌的研究提供了基础分类学与生物学数据。

研究背景方面，篮状菌属（Tolypocladium，肉座菌目Hypocreales）是一个在系统发育上界定明确、具有显著生态多样性与代谢潜力的真菌属，最初为容纳3个土壤栖息种而建立，后续多基因系统发育分析不断修正其属的概念并厘清种间关系。该属物种已被记载于土壤、昆虫、植物组织、真菌子座及地衣叶状体等多种生态基质中。这种生态多样性伴随重要的功能与生物技术价值：多种篮状菌属物种为昆虫病原菌、食线虫真菌或重寄生真菌，具备作为生物防治剂的潜力；该属还能生物合成环孢素A、metarhizin、tolypoalbin C、tolypin、cylindromicin、tolypocladamides A–G及tolyprolinol等结构多样的次生代谢产物，具有免疫抑制、抗肿瘤、抗炎及抗寄生虫等生物与药理活性。地衣被认为是篮状菌属反复出现但表征不足的基质，多项独立研究从不同地理区域和气候条件下的地衣叶状体中分离到该属物种，表明地衣关联并非偶然，而是该属内一致的生态策略；在地衣叶状体内，该属物种以内生地衣真菌形式存在，可在不引起可见病害症状的情况下定殖健康宿主。然而，地衣相关篮状菌属类群的系统发育位置、物种边界与功能属性仍知之甚少。地衣是能够定殖极端环境的高度结构化共生系统，其生态适应力由真菌主导的复杂共生关系及具有抗菌和抗癌活性的丰富次生代谢产物库所支撑，这些化合物多由真菌伙伴合成。地衣内生真菌分类学上多样，主要分布于7个真菌目，其中格孢腔菌目、炭角菌目和肉座菌目物种最丰富。尽管篮状菌属作为地衣相关属的认识不断扩大，但其在地衣共生中的物种层面多样性与功能作用仍缺乏充分表征。研究人员在中国西藏自治区开展地衣内生真菌多样性调查时，从8种地衣宿主中获得12株篮状菌属菌株，多基因系统发育分析将其解析为5个获得良好支持的进化支，各代表一个此前未描述的篮状菌属物种。鉴于同属类群已记载的生物活性潜力，研究人员假设这些新种可能具有抗真菌、抗氧化和细胞毒性活性，因此本研究的目标是利用形态学与分子数据对这些新的地衣内生篮状菌属物种进行分类，并开展初步测定以识别这些新种的生物活性潜力。研究得出以下结论：西藏高山极端环境的地衣叶状体蕴藏着多样且此前未被认识的篮状菌属物种群，这些真菌可能在地衣相关微生物群落中发挥作用，并可能是生物活性化合物的来源；但生物活性结果尚属初步，因大多数菌株仅针对单一癌细胞系在单一浓度下测试，且缺乏阳性对照、正常细胞系对照及IC₅₀值，尚需在不同浓度、更广泛的病原菌与癌细胞系及机制层面开展进一步研究以确认上述发现。本研究的重要意义在于增加了对地衣生境中篮状菌属多样性的认识，并为今后中国高山环境地衣内生真菌的研究提供了基础分类学与生物学数据。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：2021年11月自西藏自治区林芝地区察隅县采集73份地衣样品，按形态型分组并依据专著进行形态鉴定，随后通过完整ITS基因区域PCR扩增进行分子鉴定；采用Chang等的方法分离地衣内生真菌，单菌丝尖端纯化后保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，正模干培养物保存于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心；采用CTAB法提取总基因组DNA，以ITS1/ITS4引物扩增完整ITS区域用于初筛，并以LR0R/LR5、fRPB2-5F/RPB2-7cR和728F/2218R引物分别扩增LSU、rpb2和tef1-α部分区域，PCR产物经双向Sanger测序，序列用Geneious v.10.2.2拼接并通过GenBank的BLAST进行初步鉴定；系统发育分析采用单基因与串联数据集，以Polycephalomyces formosus和P. sinensis为外群，分别用最大似然法（IQTREE Web Server，1000次自举重复）、最大简约法（MEGA v.10.2.0，1000次自举重复）和贝叶斯推断（MrBayes v.3.2.7，500万代、4条MCMC链）分析；形态与生长研究将全部分离株接种于PDA、MEA、OA、SNA和CMA五种培养基以诱导产孢，对不产孢者补充无菌松针和干燥地衣粉，用Leica DM6显微镜观察拍照并以ImageJ v.1.53k测量至少50个特征，同时在5–35 °C（5 °C递增）下于PDA上评估温度依赖性生长；生物活性测定采用平板对峙培养法评价对Fusarium nanum和Monilinia fructicola的拮抗活性，以乙酸乙酯提取粗提物并用MTT法评估对H460和A549细胞的细胞毒性；生物测定数据在R v4.2.1中经Shapiro–Wilk检验和Levene检验后采用单因素方差分析及Tukey氏HSD事后检验。

研究结果方面，3.1地衣采集、真菌分离与初步鉴定：本研究采集的73份地衣样品基于形态与分子数据代表8个物种，即Dendriscosticta aff. hookeri、D. wrightii、D. yatabeana、Lobaria isidiophora、Lobaria sp.1、Lobaria sp.2、L. orientalis和L. yunnanensis；共获得288株地衣内生真菌分离株，基于ITS测序的初步鉴定显示其代表40个不同属，其中12株篮状菌属菌株来自代表8个物种的9份地衣标本；对模式材料的初步BLAST检索表明，各分离株与Tolypocladium album CBS 869.73、T. ovalisporum CBS 700.92及T. cylindrosporum ARSEF 2920的序列相似性分别约为93.93%、97%或94.29%及96.70%。3.2系统发育分析：串联比对包含4个基因座（ITS、LSU、rpb2和tef1-α）、75个分类单元、2878个比对字符；串联系统发育解析出两个互为单系、具强支持的姐妹谱系，第一个支（CGMCC3.23757、CGMCC3.23756和CGMCC3.23758）获最大支持（ML/MP/BI：100/100/1），描述为Tolypocladium crinitum，第二个支（CGMCC3.23755、CGMCC3.25469和CGMCC3.23761）同样获良好支持（100/100/1），代表T. ellipsoideum，两支的姐妹关系在所有单基因系统发育中一致恢复；CGMCC3.25470和CGMCC3.29834在多位点系统发育中解析为获完全支持、谱系排他的进化支（100/100/1），与包含若干已描述种和本文4个新种的支形成姐妹关系，单基因树拓扑不一致，该谱系在各标记中反复表现为系统发育上独立，支持其作为新种T. xizangense；CGMCC3.23762和CGMCC3.29833在多基因系统发育中解析为独立谱系（100/100/1），与含T. amazonense、T. endophyticum、T. queenslandicum和T. trecense的支有较宽亲缘关系，单基因树显示不一致的系统发育亲缘性，这种深分支与基因座特异性不稳定模式与缺乏与已描述种近缘关系的进化上独特谱系相一致，据此描述为T. orientalis；CGMCC3.23760和CGMCC3.23754在多位点系统发育中形成获强支持的互为单系支（100/100/1），在串联树和ITS树中均解析为T. pustulatum的姐妹群，两分离株虽存在7个种内多态位点，但与T. pustulatum存在31个分布于4个基因座的固定核苷酸差异（ITS：11 bp；LSU：3 bp；tef1-α：9 bp；rpb2：8 bp），谱系排他性、多位点支持与固定分子分化的协同支持其为新种T. parapustulatum。3.3分类学：研究描述了5个新种的模式、词源、形态描述、检查的附加标本及分类学评注，各新种均给出Fungal Names编号、模式产地（中国西藏自治区察隅县）、宿主、分离日期、保藏号及GenBank登录号；T. crinitum菌落于25 °C PDA上10天后白色、边缘絮状，最适生长温度25 °C，5 °C生长缓慢、35 °C不生长，未见厚垣孢子和有性型；T. ellipsoideum以产生特征性棒状分生孢子与T. crinitum相区别，二者在4个基因座间存在76个固定核苷酸差异（ITS：17 bp；LSU：2 bp；tef1-α：21 bp；rpb2：36 bp）；T. orientalis与T. amazonense、T. endophyticum、T. queenslandicum和T. trecense分别存在55、53、82和55个固定核苷酸差异，形态上T. amazonense和T. endophyticum具毛状分生孢子梗分支，而T. orientalis和T. trecense的分生孢子发生结构非毛状；T. parapustulatum以较长的分生孢子梗和较大的瓶梗与T. pustulatum相区别（最大尺寸分别为114.2 μm对30 μm和33.5 μm对10 μm）；T. xizangense产生明显大于T. phycosomatis的分生孢子（1.3–2.9 × 1.1–2.1 μm对1.1–1.9 × 0.8–1.6 μm），瓶梗大于T. geodes（4.0–20.4 × 0.9–2.4 μm对5.6–12.4 × 1.4–2.4 μm），与T. phycosomatis和T. geodes分别存在65个（3个基因座：ITS 22 bp、LSU 11 bp、tef1-α 32 bp）和17个（2个基因座：ITS 13 bp、LSU 4 bp）固定核苷酸差异。3.4生物活性测定：3.4.1拮抗活性——全部12株菌通过平板对峙法评价对Fusarium nanum和Monilinia fructicola的拮抗活性，抑制率为38%至67%，CGMCC3.23760、CGMCC3.23757和CGMCC3.23756对两种病原菌均一致抑制且抑制率至少为50.8%，对F. nanum活性最强者为CGMCC3.23757、CGMCC3.23760和CGMCC3.23754（均高于60%），对M. fructicola抑制率超过61%者为CGMCC3.25470、CGMCC3.23755和CGMCC3.25469；3.4.2细胞毒性——粗提物先在100 μg/mL下对H460肺癌细胞系评估，CGMCC3.23757、CGMCC3.23755和CGMCC3.23762的提取物表现出显著细胞毒性，分别抑制细胞增殖89.55%、84.82%和80.60%，显著高于其余分离株（p < 0.05），随后在50 μg/mL下对H460和A549细胞评估，所有提取物对H460的细胞毒性均大于对A549，对H460抑制率均超过70%（CGMCC3.23757平均抑制率最高，为83.08%），但三株间差异无统计学意义（p > 0.05），对A549的细胞毒性均低于60%（CGMCC3.23762最高，为58.18%），三株间差异具统计学意义（p < 0.05）。

讨论部分总结：本研究自2021年西藏自治区林芝地区采集的73份代表8个地衣分类单元的样品中回收到12株篮状菌属地衣内生菌株，经多基因系统发育分析与详细形态学检查解析为5个新种；观察到的抗真菌与细胞毒性活性变异提示分离株间存在功能差异，尽管这些活性在地衣叶状体内的生态相关性仍有待确定。青藏高原与南极、北极并列为地球极端环境区域之一，地衣在此作为生态先锋，尽管该地区被认定为地衣生物多样性热点、蕴藏超过382种地衣，但地衣内生真菌群落仍缺乏表征，本文检查的8种宿主地衣均代表西藏的新分布记录，凸显当前对高海拔生态系统中地衣多样性及其相关微生物知识的有限；从多种地衣宿主中反复回收到篮状菌属提示该属成员可能是高山环境中地衣相关真菌群落的常见组分。全部12株菌株被归入5个此前未描述的物种，提示西藏自治区乃至该区域之外地衣相关篮状菌属多样性较高；本研究之前仅报道过T. cylindrosporum和T. ovalisporum两个篮状菌属物种来自地衣，中国其他地区地衣内生真菌既往调查中未出现篮状菌属，可能反映环境条件、宿主组成或采样强度的差异，提示高山地衣可能栖息着受局部生态压力塑造的独特真菌群落，相对有限的采样即发现如此多此前未被认识的多样性，强烈提示地衣叶状体是篮状菌属多样性尚未充分探索的储库而非偶然基质。全部12株菌株经抗真菌与细胞毒性评价，观察到明显的种间与种内变异；类似分离株特异性生物活性变异已在系统发育多样化的真菌类群中报道，如Fusarium oxysporum分离株对线虫的生物活性差异显著、Xylaria cubensis分离株对多种植物病原菌的拮抗作用不同、Diaporthe vochysiae表现出分离株特异性抗真菌性状、Aspergillus flavus在吲哚-3-乙酸产量和对植物病原菌拮抗活性上存在变异，这类功能多样性在远缘真菌中反复出现，表明同种分离株间的代谢异质性是一种广泛现象，可能反映分离株层面的适应性分化而非系统发育上保守的性状；在地衣叶状体背景下，这种变异可能反映微尺度生态分化，即近缘分离株占据略有不同的生态位或在同一宿主环境内参与不同的竞争性相互作用。地衣内生真菌如篮状菌属可能在地衣叶状体内发挥重要功能作用，有助于这些共生微生态系统的稳定性与恢复力：通过产生抗真菌化合物，它们可能有助于抑制竞争性或致病性微生物，保护地衣免受感染并维持宿主结构的完整性；细胞毒性及其他生物活性代谢产物也可能调节共栖微生物间的相互作用，促进叶状体内的生态位划分与资源分配；此外，这些真菌可能间接影响宿主生理，例如通过 contributing to stress tolerance 在高紫外辐射、干燥和营养限制等高山环境常见极端条件下贡献力量；总体而言，这些活性提示地衣内生真菌不仅是被动栖居者，而是塑造地衣微环境的积极参与者，增强宿主存活与生态适合度。研究结论部分翻译如下：本研究表明，极端高山环境中的地衣叶状体栖息着多样且此前未被认识的篮状菌属物种群；结果提示这些真菌可能在地衣相关微生物群落中发挥作用，并可能是生物活性化合物的来源；然而，生物活性结果尚属初步，因大多数分离株仅针对单一癌细胞系在单一浓度下测试，且缺乏阳性对照或正常细胞系对照及IC₅₀值；尚需使用不同浓度、更广泛的病原菌与癌细胞系并探究潜在机制的研究来确认这些发现。