苹果黑腐皮壳菌跨膜蛋白VmEM1介导真菌致病性并触发植物免疫反应

《Journal of Fungi》：A Valsa mali Transmembrane Protein VmEM1 Mediates Fungal Virulence and Triggers Immune Responses in Plants

　　

由苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）引起的苹果黑腐皮壳菌腐烂病（AVC）给苹果生产造成重大年度经济损失。植物病原真菌中的跨膜蛋白介导真菌—寄主互作并调控真菌生长与致病性，然而其在苹果黑腐皮壳菌—苹果病理系统中的作用机制尚不明确。本研究表明，跨膜蛋白VmEM1在苹果黑腐皮壳菌侵染苹果早期显著上调表达。VmEM1缺失突变体（ΔVmEM1）的致病性显著减弱，表明VmEM1对苹果黑腐皮壳菌的完全致病性不可或缺。值得注意的是，VmEM1发挥双重作用：过表达VmEM1减弱苹果黑腐皮壳菌致病性，同时激活寄主免疫反应。纯化的VmEM1ECD诱导本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中活性氧（ROS）与胼胝质积累，增强本氏烟草对病原菌的抗性，并以BAK1、SOBIR1、HSP90和SGT1相关方式触发细胞死亡。此外，纯化的VmEM1ECD促进苹果组织中ROS与胼胝质积累以及免疫相关标记基因的表达，从而增强苹果对苹果黑腐皮壳菌的抗性。总之，本研究揭示VmEM1既是关键致病因子又是免疫激发子，为苹果黑腐皮壳菌致病机制及苹果黑腐皮壳菌—苹果互作的分子基础提供了新见解。

研究背景：由苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）引起的苹果腐烂病（apple valsa canker，AVC）每年给全球苹果生产造成重大经济损失。植物病原真菌侵染已对全球粮食安全和生态系统稳定性构成日益严重的威胁，阐明植物免疫及病原真菌—植物互作的分子机制具有重要意义。植物依靠定位于质膜的模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）识别保守的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），进而启动PAMP触发的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI），引发活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆发、胼胝质沉积及防御相关基因转录重编程等快速生理响应。PRRs主要包括受体样激酶（receptor-like kinases，RLKs）和受体样蛋白（receptor-like proteins，RLPs），其高效识别激发子通常需要共受体如BAK1和SOBIR1的协同参与。已有研究表明，效应蛋白、转录因子、毒素和小RNA等参与苹果黑腐皮壳菌致病过程，且已鉴定出若干激发子，如VmE02兼具PAMP与致病因子双重功能，VmNIS1作为免疫激发子诱导植物防御反应而VmNIS2抑制植物免疫并增强致病性。然而，功能性跨膜蛋白作为致病因子或激发子在苹果黑腐皮壳菌侵染过程中的潜在作用仍很大程度上未知。本研究鉴定了一个跨膜蛋白VmEM1为苹果黑腐皮壳菌的关键致病因子，并揭示其在苹果黑腐皮壳菌—苹果互作中发挥双重且相反的功能：一方面作为关键致病因子参与真菌致病性，另一方面作为免疫激发子触发植物免疫反应。

主要关键技术方法：研究人员通过生物信息学分析（含保守结构域分析、SignalP 6.0信号肽预测及TMHMM 2.0跨膜结构预测）鉴定VmEM1的结构特征；采用聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化构建基因敲除、互补及过表达菌株；利用qRT-PCR检测基因表达；通过离体苹果枝条接种进行致病性测定；采用农杆菌介导的本氏烟草瞬时表达及病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）分析信号组分功能；原核表达并纯化VmEM1ECD-GFP融合蛋白用于蛋白处理试验；结合转录组测序（RNA-seq）及GO、KEGG富集分析寄主差异表达基因；并通过DAB染色、苯胺蓝染色及电解质渗漏测定评估ROS、胼胝质与细胞死亡。

研究结果：

3.1 VmEM1是苹果黑腐皮壳菌的关键致病因子：qRT-PCR显示VmEM1在侵染早期（6和12 hpi）显著上调表达；成功获得两个独立敲除突变体（ΔVmEM1-6和ΔVmEM1-16）。在含SDS、KCl或H2O2的PDA上，各菌株菌落形态与生长速率相似，ΔVmEM1在标准PDA上菌落形态与菌丝生长速率亦无明显改变，表明VmEM1对SDS、KCl和氧化胁迫响应及营养生长非必需。苹果枝条接种试验表明ΔVmEM1致病性显著减弱，互补菌株ΔVmEM1-C恢复至野生型水平，表明VmEM1是必需致病因子。

3.2 ECD与ICD结构域对VmEM1介导的致病性不可或缺：结构预测鉴定出跨越氨基酸残基48–68的单一高置信度跨膜片段，N端区域（1–47）位于质膜外形成胞外域（extracellular domain，ECD），C端区域（69–155）为胞内域（intracellular domain，ICD）。构建ΔVmEM1ECD与ΔVmEM1ICD突变体后，删除任一结构域均不影响PDA上的营养生长；但ΔVmEM1ECD与ΔVmEM1ICD在苹果枝条上的致病性均显著减弱，且ΔVmEM1、ΔVmEM1ECD与ΔVmEM1ICD间致病性无显著差异，表明ECD与ICD均参与VmEM1完全致病性。

3.3 VmEM1过表达导致苹果黑腐皮壳菌致病性降低：构建ICD过表达菌株OEVmEM1ICD，其营养生长与致病性均无显著变化；构建全长过表达菌株OEVmEM1-1和OEVmEM1-2，其营养生长及对SDS、KCl、H2O2的响应无显著影响，但致病性显著降低，提示VmEM1可能通过未知的剂量敏感机制调控致病性。

3.4 VmEM1过表达触发植物免疫反应：对接种OEVmEM1与野生型菌株48 hpi病健交界组织进行转录组测序，鉴定出4157个显著上调与2425个显著下调基因。GO富集显示上调基因主要富集于抗真菌、水杨酸（salicylic acid，SA）与茉莉酸（jasmonic acid，JA）信号、木质素生物合成及创伤响应等过程，定位于质膜并具氧化还原酶活性与序列特异性DNA结合功能；下调基因富集于光合作用与淀粉代谢等核心生理过程。KEGG分析显示上调基因显著富集于植物—病原互作、MAPK信号、植物激素信号转导、抗微生物次生代谢及抗氧化胁迫等通路，下调基因富集于DNA复制修复、光合作用、碳固定与碳水化合物代谢通路，表明过表达VmEM1激发寄主防御反应。

3.5 VmEM1ECD触发本氏烟草细胞死亡：瞬时表达完整VmEM1与VmEM1ΔICD可有效触发本氏烟草叶片细胞死亡，而VmEM1ΔECD不能。原核表达纯化VmEM1ECD蛋白，400 nM处理可触发本氏烟草细胞死亡与电解质渗漏；而在BAK1、SOBIR1、HSP90或SGT1沉默植株中，纯化VmEM1ECD未能触发明显细胞死亡，表明VmEM1ECD触发的细胞死亡与BAK1、SOBIR1、HSP90和SGT1功能相关。

3.6 VmEM1ECD触发本氏烟草免疫反应并增强对核盘菌和辣椒疫霉的抗性：外源施用VmEM1ECD促进本氏烟草ROS与胼胝质积累；qRT-PCR显示病程相关基因NbPR1、NbPR2、NbPR4及调控转录因子基因NbERF1、核心PTI信号基因NbPTI5和植保素合成基因NbCYP71表达显著上调。预处理12 h后接种核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）和辣椒疫霉（Phytophthora capsici），病斑直径显著减小，表明VmEM1ECD激活本氏烟草免疫反应并增强抗病性。

3.7 VmEM1ECD激活苹果免疫反应与抗病性：纯化VmEM1ECD处理组织培养苹果叶片24 h后显著促进ROS积累与胼胝质沉积；qRT-PCR显示MdPR1、MdPR2、MdPR4、MdPR5分别上调约23、9、11、7倍，MdRBOHD上调约12倍，MdWRKY33上调约26倍，MdCYP81上调约9倍，MdNPR1上调约4倍。蛋白预处理24 h后接种野生型苹果黑腐皮壳菌，叶片病斑面积减少约52%，枝条病斑长度减少约27%，表明施用纯化VmEM1ECD蛋白增强苹果对苹果黑腐皮壳菌的抗性。

讨论部分总结：本研究鉴定苹果黑腐皮壳菌跨膜蛋白VmEM1兼具植物免疫激发子与致病因子双重功能。既往研究多关注胞内转录因子、次级代谢全局调控因子及分泌效应蛋白，跨膜蛋白在苹果黑腐皮壳菌致病中的作用知之甚少。VmEM1在侵染早期显著上调，其敲除突变体致病性显著降低，且营养生长及对过氧化氢、盐和渗透胁迫的响应无显著差异，表明VmEM1不执行管家功能而特异性作用于寄主侵染过程。结构域删除试验证明ECD与ICD均为完全致病性所必需，但该表型证据不能确认截短蛋白的表达、稳定性、正确折叠或亚细胞定位；研究人员推测ECD可能介导病原—寄主互作而ICD可能在真菌细胞内发挥信号转导功能，其分子机制仍待阐明。OEVmEM1营养生长与非生物胁迫响应无显著差异而致病性显著降低，转录组分析显示过表达VmEM1诱导苹果免疫相关基因上调，富集于SA、JA信号及真菌防御相关通路；但过表达菌株致病性减弱可能源于寄主对VmEM1识别增强、异常VmEM1积累扰乱真菌内源生理或其他多效效应，目前尚无法区分，且同一时间点取样可能代表不等感染阶段与不同真菌生物量，部分寄主转录变化可能源于病害严重度差异而非VmEM1丰度直接影响。异源表达VmEM1引起本氏烟草细胞死亡，纯化VmEM1ECD激活相关植物免疫反应，其诱导的细胞坏死与NbBAK1、NbSOBIR1、NbHSP90和NbSGT1等保守免疫调控组分相关，提示VmEM1可能与其他PAMPs共享重叠的免疫激活途径；VmEM1ECD处理增强本氏烟草对核盘菌和辣椒疫霉的抗性，但其能否直接抑制这两种病原菌菌丝生长仍有待研究。与在多种微生物谱系中保守的VmE02不同，VmEM1敲除仅导致致病性减弱而无营养生长或胁迫耐受缺陷，这种表型特异性表明VmEM1并非执行管家功能，而是专门的致病因子兼免疫激发子；尽管VmEM1可作为激发子激活植物免疫，但不能被归类为典型PAMP，其双重功能可能代表谱系特异性进化创新或寄主选择压力驱动的适应性优化。

研究结论翻译：总之，VmEM1是苹果黑腐皮壳菌中的一个跨膜蛋白，既是必需的致病因子又是植物免疫激发子。在真菌致病性方面，其胞外域和胞内域均为介导VmEM1在寄主侵染过程中完全致病性所必需。作为一种功能性免疫激发子，VmEM1ECD能够激活相关植物免疫反应，从而提高寄主对苹果黑腐皮壳菌的抗性。总体而言，这些结果推进了研究人员对跨膜蛋白介导的苹果黑腐皮壳菌过程机制的理解。