贵州遵义辣椒白绢病病原菌的分离、鉴定及室内杀菌剂筛选

《Journal of Fungi》：Isolation, Identification, and In Vitro Fungicide Screening of the Pathogen Causing Southern Blight of Pepper in Zunyi, Guizhou, China

　　

辣椒白绢病是一种毁灭性土传真菌病害，在连作制度下严重制约辣椒产量与品质。为明确贵州遵义辣椒白绢病的致病病原并筛选高效杀菌剂以支持科学防控，研究人员通过形态学观察、多位点分子系统发育分析及致病性验证对病原真菌进行了分离与鉴定，并采用毒力培养基法开展室内杀菌剂毒力测定。结果表明，病原菌被确认为Agroathelia rolfsii（A. rolfsii）。致病性试验证实该菌株对辣椒幼苗具有强致病性，接种后3 d发病率达90%，病情指数为43.33 ± 2.89。研究人员从病组织成功重新分离到该病原菌，并经形态特征及ITS/LSU/TEF1-α多基因测序验证，满足柯赫氏法则。室内杀菌剂筛选结果表明，噻呋酰胺、咯菌腈和吡唑醚菌酯对供试菌株表现出较强抑菌效果，处理3 d后半数抑制浓度（EC₅₀）为0.031–0.358 mg/L；其次为三唑酮和咪鲜胺，EC₅₀为9.731~18.593 mg/L，表现出中等抑菌活性。本研究系统确认A. rolfsii为中国遵义辣椒白绢病的致病病原，噻呋酰胺、咯菌腈和吡唑醚菌酯对该病原菌具有良好的抑制作用，可推荐用于该病害的防控。

辣椒（Capsicum annuum L.）是中国重要的经济蔬菜和调味作物。截至2022年，中国辣椒种植面积已达223万hm²，种植范围遍布全国，已形成涵盖种植、加工、贸易和出口的完整产业链。遵义在全国地级市中辣椒种植规模居首位，辣椒种植面积稳定在13.33万hm²，占贵州全省的40%、全国的8%和全球的3%，辣椒产业是遵义重要的十亿元级农业支柱产业。随着设施蔬菜规模化生产和连作制度的发展，辣椒复种指数上升，连作单作可能破坏土壤微生态平衡，提高土传病害的发生风险和严重程度，成为限制辣椒优质生产和产业可持续发展的主要瓶颈。其中，辣椒白绢病作为一种典型土传真菌病害，在高温高湿条件下流行，常发生于中国南方的温室和大田，导致植株萎蔫和死亡，造成重大经济损失，制约辣椒产业的标准化和优质化发展。

辣椒白绢病的病原菌为Agroathelia rolfsii（Sacc.）Redhead & Mullineux，其基原名为Sclerotium rolfsii Sacc.，异名为Athelia rolfsii（Curzi）C.C. Tu & Kimbr.。该菌为死体营养型病原菌，寄主范围广泛，可侵染100科500余种植物，除辣椒外还可危害番茄、茄子、花生、大豆等经济作物。病原菌主要危害辣椒茎基部和根系，通过分泌细胞壁降解酶、草酸等破坏寄主表皮细胞，或通过伤口、气孔等完成侵染，导致维管束阻塞，植株萎蔫直至整体腐烂死亡。病害初期植株无明显症状，随着病情发展，茎基部皮层褐变腐烂，表层产生白色丝状菌丝体，后期形成圆形、椭圆形或不规则褐色菌核。

在辣椒白绢病治理中，抗性品种利用受限于高抗种质资源的匮乏，且在中国农药信息网上登记用于该病害的专用杀菌剂较少。因此，准确鉴定病原菌是有效防控的前提。由A. rolfsii引起的辣椒白绢病严重威胁中国西南核心辣椒产区遵义的辣椒生产。当地A. rolfsii种群属于独立的地理分支，具有明显的遗传分化。遵义的喀斯特环境和种植制度可能重塑病原菌的杀菌剂敏感性，因此不能直接套用其他地区的敏感性数据。此外，以往多数生物测定仅关注原药，对商品制剂中助剂效应的信息有限。因此，筛选高效杀菌剂对于支撑科学用药和绿色防控具有重要意义。本研究旨在：（i）通过形态学特征、致病性测试及ITS、LSU和TEF1-α多 locus 系统发育分析，分离和鉴定中国遵义辣椒白绢病的致病病原；（ii）通过满足柯赫氏法则确认分离菌株ZYBJ的致病性；（iii）在体外评价分离菌株对原药和商品制剂的敏感性，为辣椒白绢病的化学防控提供依据。

研究人员从中国遵义辣椒种植基地（27.56° N，107.03° E，海拔880 m）采集具有典型症状的病株根系，带回实验室进行分离纯化。致病性试验所用辣椒幼苗由贵州辉煌农业科技有限公司（贵州安顺）培育。供试5种原药杀菌剂为噻呋酰胺（99.0%）、咯菌腈（99.3%）、吡唑醚菌酯（99.5%）、咪鲜胺（99.1%）和三唑酮（99.1%）；5种商品制剂包括20%咯菌腈悬浮剂（SC）、240 g/L噻呋酰胺悬浮剂（SC）、25%吡唑醚菌酯悬浮剂（SC）、15%三唑酮可湿性粉剂（WP）和450 g/L咪鲜胺水乳剂（EW）。原药杀菌剂均购自北京勤诚亦信科技有限公司，商品制剂中240 g/L噻呋酰胺SC、25%吡唑醚菌酯SC、15%三唑酮WP和450 g/L咪鲜胺EW购自中保绿农集团有限公司和中国农业科学院植物保护研究所，20%咯菌腈SC购自大地农业科技有限公司。原药用丙酮配制母液，噻呋酰胺、咯菌腈和吡唑醚菌酯母液浓度为1.6 mg/mL，咪鲜胺为2.0 mg/mL，三唑酮为4.0 mg/mL。整个实验使用无菌水。

研究人员采用组织分离法从田间典型病株茎基部挑取单个菌核，经表面消毒后接种于PDA平板，于（28 ± 1）°C培养，获得纯化菌株ZYBJ，保存于4°C备用。致病性测定采用根部针刺接种法，将5 mm菌丝饼接种于7–8叶期辣椒幼苗根部，以空白PDA饼为阴性对照，每处理10株，独立重复3次。接种后逐日观察症状，7 d内记录发病率，并按0–4级病情指数标准评估病情严重度。从接种发病植株和对照植株上重新分离病原菌，经形态学和ITS测序鉴定，与ZYBJ比较。形态学观察包括菌落特征、菌核大小和颜色，使用三维超景深显微镜测量20个随机选取菌核的直径，并利用扫描电子显微镜观察菌丝和菌核表面形态。分子鉴定采用优化的CTAB法提取基因组DNA，选择ITS、LSU和TEF1-α三个系统发育标记进行PCR扩增和测序，序列经BLASTn比对，使用MEGA 12.0.9软件以MUSCLE比对后采用最大似然法（ML）构建系统发育树，bootstrap重复1000次。ITS序列已注册于GenBank（登录号QB153978），LSU和TEF1-α序列一并提交（提交ID：SUB16513849）。室内杀菌剂筛选采用菌丝生长速率法，将不同浓度杀菌剂加入冷却至45–50°C的PDA中制备含药平板，接种5 mm菌丝饼，28°C培养4 d后测量菌落直径，计算抑制率，求EC₅₀值，并按Chechi等标准分级：EC₅₀ < 1 mg/L为强活性，1–10 mg/L为中等活性，> 10 mg/L为弱活性。数据分析使用Excel整理，MEGA 12.0.9构建系统发育树，OriginPro 2024b计算毒力回归方程并作图，OriginPro 2024进行单因素方差分析和Tukey氏HSD检验（α = 0.05）。

研究结果显示：田间症状方面，辣椒白绢病症状高度典型，关键诊断特征为茎基部白色丝状菌丝体和褐色菌核，最终导致植株萎蔫死亡。病害主要发生在茎基部和根部，病斑始于土表下1–5 cm茎段，向上扩展数厘米，向下侵染主根和侧根。早期症状为茎基部出现水渍状浅褐色小斑点，逐渐扩展并环缢茎秆；菌丝和菌核特征为病部产生大量疏松白色丝状菌丝，呈放射状向外扩展，如白色棉絮状包裹茎基部，后蔓延至根周土表，最终在白色菌丝垫中形成大量小菌核，菌核初为白色，后转黄褐色，最终深褐色，质地坚硬，大小与油菜籽或米粒相当。全株表现为早期中午轻微萎蔫、早晚恢复，随病情发展茎基部组织丧失水分和养分输导能力，叶片持续萎蔫、黄化、干枯脱落，最终整株死亡，后期病组织菌丝上形成大量褐色或浅褐色油菜籽大小菌核。根部逐渐腐烂，腐烂根上着生稀疏白色菌丝，接触土壤的果实也可被侵染，病果软腐并覆盖白色丝状菌丝，转为褐至黑色；病根丧失吸收功能，拔株时易断裂，根表常附着白色菌丝和菌核。

形态学特征方面，纯化菌株ZYBJ在PDA上培养2–3 d后，菌落白色、绒毛状、放射状扩展，菌丝密集近圆形，散发明显蘑菇气味。随后产生球形、椭圆形或不规则菌核，初为白色，逐渐变黄，多数最终呈黄褐色且有光泽，形似油菜籽。20个随机选取菌核经十字测量法测得平均直径为1.27 ± 0.19 mm（n = 40）。扫描电镜显示菌丝光滑、分枝，菌核表面不平整且多孔，菌核易从菌丝上脱落。基于形态特征，菌株ZYBJ被初步鉴定为A. rolfsii。

致病性测定方面，采用针刺接种法将菌株ZYBJ菌丝块接种于健康辣椒根部，接种后1–5 d逐日观察。接种后1 d植株无症状，未见明显菌丝；2 d出现稀疏菌丝、部分叶片萎蔫和根部褐变；3–4 d菌丝在根部积累，形成坏死褐环，全部叶片萎蔫，4 d出现落叶；5 d根部及土表蔓延菌丝上形成菌核，根部形成成熟坏死环，植株死亡。本试验中，30株接种幼苗在3 d发病率达90%，病情指数为40 ± 2.5，而对照植株7 d内始终无症状（发病率0%）。从10株随机选取的病株中重新分离到病原菌，回收菌株在形态及ITS、LSU和TEF1-α序列上与ZYBJ一致，经NCBI BLAST比对确认为A. rolfsii，满足柯赫氏法则。

分子鉴定方面，以菌株ZYBJ基因组DNA为模板，用通用引物对ITS1/ITS4、EF1-983F/EF1-2218R和LROR/LR05分别扩增ITS、TEF1-α和LSU基因片段，琼脂糖凝胶电泳显示目标扩增片段分别约为600 bp、1089 bp和876 bp。BLASTn分析表明，LSU序列与A. rolfsii参考序列高度一致（99.54–99.77%），查询覆盖度100%，强烈支持其归属该种；ITS序列一致性相对较低（91.17–92.67%），TEF1-α一致性为93.38–93.90%，但最高BLAST命中均为A. rolfsii，ITS和TEF1-α一致性的变异与A. rolfsii种复合体内已知的高种内遗传多态性相符。将获得序列与GenBank相关参考序列比对，采用ML法构建系统发育树，bootstrap 1000次评估分支可靠性。ITS系统发育树中，菌株ZYBJ与多个A. rolfsii参考菌株形成独立分支，bootstrap值为100%；LSU基因系统发育树将ZYBJ置于A. rolfsii分支内；TEF1-α树中ZYBJ与A. rolfsii参考序列紧密聚类，bootstrap支持率为99%。

杀菌剂毒力测定方面，菌株ZYBJ菌丝生长抑制随杀菌剂浓度升高而增强。5种原药及其对应5种商品制剂均对A. rolfsii表现出抑制活性。噻呋酰胺、咯菌腈和吡唑醚菌酯表现出强抑制作用，其中240 g/L噻呋酰胺悬浮剂EC₅₀最低，为0.031 mg/L，对辣椒白绢病病原菌的抑菌活性最强；15%三唑酮可湿性粉剂EC₅₀最高，为18.593 mg/L，抑制活性最弱。比较原药与商品制剂活性发现，吡唑醚菌酯、咯菌腈和噻呋酰胺EC₅₀较低、抑制强；三唑酮和噻呋酰胺的原药与商品制剂间存在显著活性差异，而咪鲜胺无显著差异。

讨论部分总结如下：本研究从辣椒植株上分离致病真菌，经形态学鉴定、致病性测定和分子生物学鉴定，确认中国遵义辣椒种植基地辣椒白绢病病原为A. rolfsii，与黄等报道的益阳辣椒白绢病病原一致。A. rolfsii为担子菌门半知菌亚门无孢目真菌，不产生分生孢子，通过菌丝和菌核繁殖，致病性强。本研究中菌株ZYBJ接种菌丝后3 d辣椒植株出现根部病斑并开始萎蔫，接种后3–4 d内出现典型症状，5 d植株萎蔫死亡，与田间自然病程相似，进一步验证了A. rolfsii的高致病力。菌株ZYBJ满足柯赫氏法则：27株接种幼苗在接种后3 d出现典型A. rolfsii症状（发病率90%），而无菌琼脂块处理的创伤对照7 d内无症状（发病率0%）；从10株症状植株回收病原菌，重新分离菌落形态与ZYBJ一致，并经ITS、LSU、TEF1-α测序确认；3株对照植株未回收到目标病原菌。基于ITS、LSU和TEF1-α的系统发育分析结果一致：菌株ZYBJ与A. rolfsii亲缘关系最近，与近缘种存在明显遗传分化。尽管TEF1-α树因近缘种参考序列有限需谨慎解读，但其始终将ZYBJ置于A. rolfsii内，与ITS和LSU结果一致。BLASTn显示LSU与A. rolfsii参考序列高度一致（99.54–99.77%）；ITS（91.17–92.67%）和TEF1-α（93.38–93.90%）一致性相对较低是A. rolfsii种复合体的固有特征：作为双核真菌，A. rolfsii每个分离株携带两个不同的ITS单倍型，单倍型间比对大幅降低BLAST一致性，而TEF1-α中富含插入缺失的内含子降低整体相似度，尽管编码区保守。中国西南地区辣椒来源A. rolfsii形成与国外菌株分化的地方性分支，多数国内分离株与海外参考序列ITS相似性为97–98.5%、TEF1-α为95–98%，而ZYBJ表现出更大分化，反映当地高多样性，因此简单相似性阈值不适用于A. rolfsii物种界定。系统发育聚类一致、形态典型及对辣椒的致病性共同确认ZYBJ为A. rolfsii。不同寄主和地区A. rolfsii分离株的杀菌剂敏感性存在差异，草莓来源A. rolfsii对嘧菌酯、氟啶胺和吡唑醚菌酯抑制强，而对魔芋来源菌株效果弱。据此，研究人员对5种原药及其商品制剂进行了室内毒力测定。根据已发表标准（EC₅₀ < 1 mg/L为强抑制），噻呋酰胺、咯菌腈和吡唑醚菌酯表现出强活性（EC₅₀ = 0.031–0.358 mg/L），三唑酮和咪鲜胺表现出弱活性（EC₅₀ > 10 mg/L）。三唑酮、咯菌腈和噻呋酰胺的原药与商品制剂间EC₅₀存在显著差异，咪鲜胺和吡唑醚菌酯无此差异。三唑酮WP的EC₅₀（18.593 mg/L）显著高于其原药（10.508 mg/L）。研究人员推测三唑酮WP中的助剂可能刺激菌丝生长，而咯菌腈和噻呋酰胺制剂中的助剂产生拮抗效应，降低其抑菌活性，该推测有待助剂对照试验和制剂成分分析进一步验证。以往研究也表明噻呋酰胺、咯菌腈和吡唑醚菌酯对侵染橡皮树、半夏、甘薯等寄主的A. rolfsii具有强抑制作用，与本研究结果一致。综上，噻呋酰胺、咯菌腈和吡唑醚菌酯被确定为对辣椒白绢病病原菌最敏感的杀菌剂。然而，咯菌腈为非内吸性广谱杀菌剂，更适合作为保护性杀菌剂用于辣椒白绢病防控。该发现为中国华南遵义辣椒白绢病的有效防控提供了重要参考。不过，噻呋酰胺、咯菌腈和吡唑醚菌酯的实际田间防效仍有待进一步研究。

结论部分翻译：本研究确认A. rolfsii为贵州省遵义种植区辣椒白绢病的主要病原菌。通过形态学观察、致病性测定及基于ITS、LSU和TEF1-α基因序列的系统发育分析对病原菌进行了鉴定。分离的ZYBJ菌株对辣椒具有高致病性，人工接种观察到的症状和侵染进程与田间自然感染高度一致。柯赫氏法则得到满足，进一步确认了该菌株的致病作用。在供试杀菌剂中，噻呋酰胺、咯菌腈和吡唑醚菌酯对A. rolfsii表现出强抑制活性。这些发现阐明了当地A. rolfsii菌株的生物学特性，为中国华南遵义辣椒白绢病的化学防控提供了实践参考。然而，由于本研究仅限于室内试验，仍需田间试验验证三种杀菌剂在生产实践中的实际防效和最佳施用条件。本研究为辣椒种植区该土传病害的化学防控提供了基础数据。