致癌基因CLDN1通过TAp63介导的糖酵解转换促进甲状腺癌进展

《iScience》：Oncogenic CLDN1 promotes thyroid cancer progression through TAp63-mediated glycolytic switching

　　

甲状腺癌（thyroid cancer, TC）的发病率在全球范围内持续上升，晚期病例的治疗选择有限且预后较差。Claudin-1（CLDN1）作为一种紧密连接蛋白，在癌症中具有依赖背景的双重作用，但其在TC中的功能尚不明确。通过整合分析TCGA和GEO数据集，研究人员发现CLDN1是TC中上调的关键枢纽基因，并与不良生存相关。功能实验表明，敲低CLDN1可抑制TC细胞增殖、迁移及糖酵解代谢，而其过表达则促进这些效应。机制上，CLDN1激活TAp63通路，上调糖酵解酶（HK2、PKM2和GLUT1），并增强葡萄糖摄取、乳酸生成及NADPH/NADP⁺比值。糖酵解抑制剂2-DG在体外和体内均可逆转CLDN1驱动的致癌表型。在异种移植模型中，CLDN1过表达加速肿瘤生长，而2-DG处理可缓解该效应。综上，CLDN1通过TAp63通路重编程糖酵解代谢驱动TC进展，提示CLDN1-糖酵解轴可作为TC的潜在治疗靶点。

**研究背景与问题**
甲状腺癌（thyroid cancer, TC）是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，近年来发病率在全球显著上升。多数TC（尤其分化良好亚型）经手术、放射性碘消融及促甲状腺激素抑制等标准治疗后预后较好，但部分患者仍会出现侵袭、复发或转移，且治疗选择有限、预后差。因此，亟需鉴定驱动TC进展的新型分子及潜在治疗靶点。Claudin-1（CLDN1）是紧密连接的关键组分，除维持细胞极性和旁细胞通透性外，其异常表达在多种肿瘤中被报道，但作用具有癌症类型依赖性，既可作为抑癌基因也可作为致癌基因。在TC中，CLDN1的表达模式及功能意义尚不明确且存在争议。代谢重编程是癌症（包括TC）的标志之一，即瓦伯格效应（Warburg effect）——癌细胞即使在有氧条件下也优先利用糖酵解供能。此代谢转换不仅提供生物大分子和能量支持快速增殖，还促进侵袭表型、治疗抵抗和免疫逃逸。已证实多个关键糖酵解酶和转运体（如HK2、PKM2、GLUT1）参与TC进展，但调控TC糖酵解转换的上游因子尚未完全阐明。为此，研究人员整合公共数据库多组学数据，并开展系列体外和体内实验，探究CLDN1在TC中的临床意义、生物学功能及分子机制，明确CLDN1是否通过重编程葡萄糖代谢驱动TC恶性进展，从而将CLDN1-糖酵解轴定位为潜在治疗靶点。

**研究内容与结论**
研究人员利用TCGA和GEO（GSE29265）数据库进行差异表达分析，获得443个交集差异表达基因；通过STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并经Cytoscape核心模块分析鉴定出10个候选基因，最终选定CLDN1作为主要研究靶点。临床样本（58例TC及癌旁组织芯片）验证显示CLDN1在TC组织中显著高表达，且高表达与总生存期缩短独立相关，并与T分期正相关。细胞实验表明，敲低CLDN1显著抑制甲状腺乳头状癌（B-CPAP）和滤泡状甲状腺癌（FTC-133）细胞的增殖、克隆形成和迁移；过表达CLDN1则相反。机制研究揭示，CLDN1通过激活TAp63信号通路上调糖酵解酶HK2、PKM2和GLUT1，增强葡萄糖摄取、ATP和乳酸生成，提高NADPH/NADP⁺比值，并升高细胞外酸化率（extracellular acidification rate, ECAR）、降低耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）。糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose, 2-DG）能有效逆转CLDN1过表达所致的代谢增强及促增殖、促迁移效应。体内异种移植模型进一步证实，CLDN1过表达显著加速肿瘤生长，而2-DG处理明显抑制该促瘤作用，并下调Ki67及糖酵解相关蛋白表达。研究结论为：CLDN1通过TAp63介导的糖酵解重编程驱动TC进展，CLDN1-糖酵解轴有望成为TC的新型治疗靶点。

**关键技术与方法**
研究采用的主要技术方法包括：①多组学生物信息学分析（TCGA和GEO数据差异表达、PPI网络构建、Cytoscape-MCODE核心模块鉴定、生存分析及时间依赖ROC曲线）；②慢病毒介导的基因敲低和过表达技术（shRNA靶向CLDN1及全长CLDN1 cDNA克隆，包装慢病毒感染B-CPAP和FTC-133细胞，嘌呤霉素筛选稳定株）；③体外功能实验（CCK-8增殖、克隆形成、划痕愈合和Transwell迁移实验）；④代谢检测（葡萄糖摄取、ATP、乳酸、NADPH/NADP⁺比值测定，Seahorse XF96分析ECAR和OCR）；⑤蛋白质印迹和实时定量PCR检测相关分子表达；⑥体内异种移植模型（BALB/c裸鼠皮下接种稳定过表达CLDN1的B-CPAP细胞，2-DG腹腔注射干预，评估肿瘤体积、重量及免疫组化标志物）。样本队列来源包括TCGA-THCA数据、GEO GSE29265数据集以及含58例TC和癌旁组织的商业组织芯片。

**研究结果**
- **CLDN1是与TC不良预后相关的关键分子**：通过TCGA和GEO数据差异分析、PPI网络及核心模块鉴定，发现CLDN1在TC组织和细胞系中显著高表达。生存分析显示，CLDN1高表达组总生存期显著短于低表达组（p=0.03），且5年时间点ROC曲线提示CLDN1具有较好的预后预测效能。Cox回归森林图证明CLDN1表达独立影响患者生存时间（p=0.027）。组织芯片免疫组化验证结果与数据库分析一致，且CLDN1表达水平与TC的T分期显著正相关。
- **CLDN1促进TC细胞增殖和迁移**：在人正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3–1及多种TC细胞系中，B-CPAP和FTC-133细胞的CLDN1 mRNA和蛋白水平显著升高。敲低CLDN1后，CCK-8增殖曲线明显下降，克隆形成数减少，划痕愈合率和Transwell迁移细胞数均显著降低，证明CLDN1缺失抑制TC细胞增殖和迁移能力。
- **CLDN1经TAp63通路影响TC细胞葡萄糖代谢**：基于TCGA转录组进行PID通路富集分析，发现TAp63信号通路显著富集。敲低CLDN1下调TAp63通路相关基因（ITGA3、FAS、ITGB4、PERP和TAp63）的mRNA水平，并降低TAp63、FAS、ITGA3蛋白表达。同时，糖酵解关键蛋白HK2、PKM2、GLUT1表达下降，葡萄糖摄取、ATP含量、乳酸生成和NADPH/NADP⁺比值均降低，ECAR减少而OCR升高，说明CLDN1缺失通过抑制TAp63通路削弱糖酵解和磷酸戊糖途径代谢功能。
- **CLDN1通过激活糖酵解促进TC进展**：在CLDN1过表达的TC细胞中，糖酵解酶表达、葡萄糖摄取、ATP、乳酸和NADPH水平均升高，ECAR上升而OCR下降；2-DG共处理可逆转上述代谢改变。功能上，CLDN1过表达促进细胞增殖和迁移，而2-DG有效抑制这些促癌效应。表明CLDN1通过激活糖酵解途径驱动TC恶性表型，且该效应可被2-DG阻断。
- **CLDN1在体内经糖酵解促进TC生长**：异种移植模型显示，CLDN1过表达组肿瘤体积和重量显著增加，小鼠体重无明显变化；2-DG治疗显著抑制CLDN1诱导的肿瘤生长。免疫组化显示CLDN1过表达组Ki67表达上调，2-DG处理后逆转；同时，糖酵解相关标志物（HK2、PKM2、GLUT1）在CLDN1过表达组中升高，2-DG处理后降低。

**总结与讨论**
该研究证实CLDN1在TC中高表达并与不良预后相关，功能上促进TC细胞增殖、迁移及体内肿瘤生长，机制上通过激活TAp63信号通路上调糖酵解酶，增强糖酵解代谢，而糖酵解抑制剂2-DG可在体内外逆转其促癌效应。讨论部分指出，代谢重编程是TC进展中的关键因素，糖酵解相关基因可作为TC预后生物标志物。TAp63作为p53家族转录因子通常被视为抑癌基因，但本研究观察到其在TC中高表达并与糖酵解激活和肿瘤进展正相关，提示CLDN1驱动的信号可能将TAp63从抑癌因子转变为代谢重编程驱动因子，这可能涉及转录共调节因子改变或特定翻译后修饰。研究局限性包括：CLDN1作为膜蛋白启动TAp63通路激活的精确分子机制尚未完全阐明；体内验证使用免疫缺陷小鼠模型，无法分析转移及CLDN1通过代谢效应调控肿瘤免疫微环境的作用；研究聚焦TAp63轴，但CLDN1可能还调控其他致癌信号通路；临床相关性数据来自回顾性分析，需前瞻性大队列验证。未来应深入解析CLDN1上下游信号机制，并在晚期TC临床前模型中评估特异性糖酵解抑制剂的疗效。