儿童1型糖尿病（T1DM）血清代谢谱改变及候选代谢特征：一项探索性靶向代谢组学研究

《Metabolites》：Serum Metabolic Alterations in Children with Type 1 Diabetes Mellitus: Exploratory Targeted Metabolomics

　　

背景：1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus, T1DM）是一种日益常见的慢性疾病，由自身免疫性损伤胰腺β细胞所致。代谢组学分析可能有助于揭示与T1DM相关的代谢紊乱并识别候选生物标志物。方法：研究纳入29例T1DM儿童和11名对照。采用基于液相色谱-质谱联用（liquid chromatography–mass spectrometry, LC-MS）的AbsoluteIDQ? p180试剂盒进行靶向血清代谢组学分析。差异代谢物通过经错误发现率（false discovery rate, FDR）校正的统计分析识别。应用受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）分析评价所选代谢物的判别性能。结果：在T1DM儿童中观察到显著代谢改变，尤其涉及甘油磷脂（glycerophospholipids）、酰基肉碱（acylcarnitines）和部分氨基酸。甘油磷脂中，23种代谢物显著降低，而1种代谢物在T1DM组升高。4种酰基肉碱在组间差异显著，其中十八碳烯酰肉碱（octadecenoylcarnitine, C18:1）、乙酰肉碱（acetylcarnitine, C2）和丙二酰肉碱和/或羟基丁酰肉碱[malonylcarnitine and/or hydroxybutyrylcarnitine, C3-DC (C4-OH)]浓度较高，游离肉碱（free carnitine, C0）降低。此外，3种氨基酸[丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro）]在T1DM患者中显著降低，而牛磺酸（taurine）升高。ROC分析显示，在该探索性数据集中，C18:1[曲线下面积（area under the curve, AUC）=0.925]和二酰基磷脂酰胆碱（diacyl phosphatidylcholine, PC aa）C42:5（AUC=0.922）具有较高的表观判别性能。这些AUC值来自用于代谢物发现的同一数据集，因此代表表观样本内判别性能，而非外部验证的诊断性能。相关性分析显示，较高的糖化血红蛋白（glycated hemoglobin, HbA1c）水平与若干氨基酸和脂质浓度较低相关；体重指数z评分（BMI z-score）和病程主要与磷脂酰胆碱和氨基酸相关。然而，这些基于相关性的关联在FDR校正后均未保持显著，因此应视为假设生成。探索性多变量分析提示HbA1c、BMI z-score和病程与所选代谢物相关；但鉴于样本量有限和多重模型检验，这些发现应视为假设生成。结论：靶向代谢组学分析揭示T1DM儿童存在显著脂质和氨基酸代谢紊乱。特别是C18:1升高和PC aa C42:5降低可能代表用于区分T1DM患者与非糖尿病人群的候选代谢特征。由于研究为探索性且样本量有限，研究人员的这些结果应谨慎解释，并需在更大、独立队列中进一步研究以验证这些发现。

一、研究背景、问题与目的
T1DM是由免疫介导的胰腺β细胞破坏所致、以胰岛素缺乏和高血糖为特征的慢性自身免疫性疾病，全球患病人数持续增加，儿童和青少年构成重要人群。既往研究提示，代谢物可能有助于理解T1DM发病机制，并改善诊断（尤其临床前阶段）、治疗策略和疾病进展监测；已有代谢组学研究报道能量代谢分子、支链氨基酸、脂质和苯丙氨酸代谢物等改变。该研究的增量贡献在于使用标准化定量靶向代谢组学平台，对临床特征明确的儿童T1DM队列进行较详细的定量表征，而不是仅确认T1DM存在代谢紊乱。研究目的为：刻画儿童T1DM血清代谢组特征，包括氨基酸、酰基肉碱和脂质等营养状态相关代谢物组；探索T1DM患者与对照之间的差异代谢物；分析显著代谢物与临床参数的关联并评价其判别性能。

二、研究设计与关键技术方法（不超过250字）
研究采用横断面病例对照设计，样本来自波兰华沙儿童纪念健康研究所内分泌与糖尿病门诊2019—2022年招募的29例确诊T1DM儿童和11名非糖尿病对照。空腹血清采用AbsoluteIDQ? p180靶向代谢组学平台，基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和流动注射分析（FIA-MS）定量氨基酸、生物胺、酰基肉碱、甘油磷脂和鞘磷脂；统计分析包括Mann–Whitney U检验、Benjamini–Hochberg FDR校正、主成分分析（PCA）、置换多元方差分析（PERMANOVA）、层次聚类、ROC、通路富集、Spearman相关和多变量线性回归（MLR）。

三、主要研究结果
3.1 临床特征：T1DM组29例，中位年龄11岁[四分位距（IQR）8–14]，女20例、男9例；对照组11名，中位年龄7岁（IQR 5–12），女6名、男5名；年龄和性别分布无显著差异。T1DM诊断中位年龄8.6岁，中位病程3.0年，中位HbA1c 7.4%，中位BMI z-score 0.49。
3.2 靶向代谢物分析：188种待测代谢物中151种通过预过滤进入分析；PCA显示组间代谢偏移，PERMANOVA显示组别显著贡献总体代谢变异（R²=0.189，p=0.004），但组间存在部分重叠和T1DM组内异质性；对FDR校正后显著代谢物进行层次聚类，可见样本部分按疾病状态分组，但未完全分离。
3.2.1 氨基酸和生物胺水平：21种氨基酸中3种显著降低，即Pro（FDR校正p=0.0261，log₂FC=?0.34）、Arg（p=0.0261，log₂FC=?0.35）和Ala（p=0.0491，log₂FC=?0.43），以Ala相对降低最大；生物胺中牛磺酸显著升高（p=0.0261，log₂FC=0.64）。
3.2.2 脂质水平：40种酰基肉碱中4种差异显著，C18:1（p=0.0048，log₂FC=0.73）、C2（p=0.0261，log₂FC=0.46）和C3-DC (C4-OH)（p=0.0418，log₂FC=0.65）升高，C0降低（p=0.0261，log₂FC=?0.28）；88种甘油磷脂中24种差异显著，其中23种降低、PC ae C36:4升高；PC aa C42:5降低（p=0.0048，log₂FC=?0.52），降低最明显者为PC aa C40:1、PC ae C44:3和PC ae C40:3。
3.3 血清代谢物通路分析：探索性富集分析显示，支链脂肪酸氧化和极长链脂肪酸β-氧化（p=0.0004）、短链和长链饱和脂肪酸线粒体β-氧化（p=0.0021）、脂肪酸代谢（p=0.0021）、尿素循环（p=0.0057）、牛磺酸和亚牛磺酸代谢（p=0.0008）等通路富集；该分析基于未校正p值，应作描述性解释。
3.4 特定代谢物的ROC分析：C18:1的AUC为0.925（95%置信区间（CI）0.824–0.987），最佳截断值0.0885 μM时敏感性90%、特异性80%；PC aa C42:5的AUC为0.922（95% CI 0.807–0.987），最佳截断值0.36 μM时敏感性和特异性均90%；因使用同一发现数据集，结果为表观样本内判别性能，需外部验证。
3.5 T1DM组性别相关差异探索：仅C16:1-OH（p=0.0104）、lysoPC a C18:0（p=0.0156）和Glu（p=0.0255）呈性别差异；男性C16:1-OH较高，女性lysoPC a C18:0和Glu较高；未进行多重比较校正，应谨慎解释。
3.6 血清代谢物与T1DM临床参数的关联：3.6.1 与HbA1c的关联：较高HbA1c与ADMA、SDMA、Phe、Leu、His、Trp、Asn、PC aa C42:0和C16:1负相关，Cit正相关；但均未通过FDR校正，属假设生成。3.6.2 与BMI z-score的关联：较高BMI z-score与PC aa C36:4、PC aa C34:2、PC aa C34:1、PC aa C32:0、PC aa C38:6、C16-OH和C3-DC (C4-OH)负相关，与Ser、Phe和His正相关；未通过FDR校正。3.6.3 与T1DM病程的关联：病程与PC ae C30:0、Met、PC ae C34:1等正相关，与C4:1、C5:1-DC和PC aa C38:5负相关；未通过FDR校正。3.6.4 与诊断年龄的关联：诊断年龄与PC ae C40:6、PC ae C44:6、PC ae C38:5、SM (OH) C24:1和PC aa C38:0负相关，与PC ae C36:1和lysoPC a C26:1正相关；未通过FDR校正。上述关联均应视为假设生成。
3.7 协变量多变量分析：3.7.1 组别与代谢物浓度关联：32个FDR显著代谢物进入MLR，调整年龄和性别后仍与T1DM状态显著相关；30/32个代谢物整体模型显著，C3-DC (C4-OH)和PC ae C38:3模型未达显著；C18:1和PC aa C42:5调整后仍显著，调整R²分别最高为0.379和0.369；年龄和性别对多数代谢物无显著影响，但不能排除未测残余混杂。3.7.2 T1DM组内临床和人口学变量与代谢物浓度关联：HbA1c模型中，kynurenine和C16:1负关联最强，Cit正关联；年龄与Trp正相关、与Cit负相关；病程与SDMA、Trp和Asn正相关。BMI z-score模型中，Ser正相关，PC aa C36:4、PC aa C34:1和PC aa C38:6负相关，但仅PC aa C34:1整体模型显著。病程模型中，Met、Trp、C9、Ala、Asn、Gln、sarcosine、creatinine、Thr和lysoPC a C18:1等正相关，C5:1-DC负相关，部分整体模型显著。诊断年龄模型中，PC ae C40:6、PC ae C44:6、PC ae C38:5和SM (OH) C24:1负相关，lysoPC a C26:1正相关，但整体模型多未达显著。上述分析均为探索性，应视为假设生成。

四、讨论部分总结
讨论指出，该研究在儿童T1DM中观察到以甘油磷脂和酰基肉碱为主、并涉及氨基酸和生物胺的代谢改变；广泛甘油磷脂降低及游离肉碱/酰基肉碱谱改变提示膜脂重塑和线粒体脂肪酸处理、能量代谢相关改变，但代谢物浓度不能直接等同于代谢通量，不能据此推断β-氧化增强或受损。氨基酸代谢改变可能涉及糖代谢、胰岛素分泌和氧化应激调节；牛磺酸等改变需谨慎解释。C18:1升高和PC aa C42:5降低在本数据集中显示较高表观判别性能，但ROC分析使用发现数据集，截断值、敏感性和特异性均为表观样本内估计，不是经验证的诊断阈值。与HbA1c、BMI z-score、病程和诊断年龄的相关及MLR分析多属探索性，多数相关性未通过FDR校正，且存在选择后偏倚、模型不稳定和残余混杂可能。局限性包括样本量小且组间不平衡、单中心、横断面设计、无独立外部验证、靶向试剂盒仅覆盖有限代谢物，以及未评估青春期状态、膳食摄入、胰岛素方案、胰岛素剂量和体力活动等潜在影响因素，存在过拟合和假阳性风险。

五、研究结论翻译
这项探索性研究提示，代谢组学可能在未来有助于更好地理解T1DM的代谢改变。在该研究中，靶向代谢组学分析揭示T1DM儿童若干代谢通路紊乱，主要涉及甘油磷脂、酰基肉碱和氨基酸。特别是C18:1升高和PC aa C42:5降低可能代表用于区分T1DM患者与非糖尿病人群的候选代谢特征。然而，在大规模独立研究证实之前，这些观察结果应谨慎解释，因为观察到的高AUC值来自用于代谢物发现的同一小样本数据集，可能存在过拟合，并不代表经验证的预测模型。尽管代谢组学方法未来可能有助于改善T1DM表征，但当前发现尚不支持直接临床应用。未来整合代谢组学数据可能促进新的诊断方法、检测方法和疗法开发。未来将代谢组学数据与临床信息以及尽可能与膳食信息整合的研究，可能有助于进一步刻画与T1DM相关的代谢模式。然而，此类发现的潜在临床意义，包括诊断或治疗应用，仍需在更大、独立队列中验证。鉴于探索性设计、单中心小样本和缺乏外部验证，这些发现应被视为假设生成而非确证性结论。需要在更大、独立队列中进一步研究，以确定所识别的候选代谢特征是否可重复并具有潜在临床判别价值。