抗MDA5皮肌炎的空间转录组学图谱显示I型干扰素反应及免疫活化的血管周围富集现象

《iScience》：Spatial transcriptomic mapping of anti-MDA5 dermatomyositis reveals perivascular enrichment of type I interferon responses and immune activation

　　• 空间转录组学绘制了MDA5+皮肌炎中肌肉微环境的图谱
• IFN-I特征在MDA5+肌肉的血管周围微环境中高度富集
• 内皮微环境显示出TGF-β、NF-κB和TNF-α信号的升高
• 巨噬细胞浸润与MDA5+肌肉中的体液免疫反应相关

**摘要**
抗MDA5自身抗体阳性的皮肌炎（MDA5+ DM）是一种罕见的自身免疫性肌病，伴有快速进展的间质性肺病和较高的死亡率，但其潜在的分子机制仍不明确。为此，我们分析了健康对照组、MDA5+患者和MDA5-患者的肌肉组织的空间转录组。研究发现，MDA5+肌肉表现出由显著微环境重塑驱动的独特空间转录组结构，并伴有局部免疫浸润。关键的是，空间微环境分析显示I型干扰素（IFN-I）特征在内皮细胞（EC）微环境中高度富集。该血管周围微环境还显示出TGF-β、NF-κB和TNF-α信号的升高，以及表明炎症加剧和氧气运输受损的转录组特征。总体而言，我们的结果表征了MDA5+ DM肌肉的独特血管病理，并为针对这些血管周围炎症途径提供了空间机制上的解释。

**图形摘要**

**引言**
特发性炎症性肌病（IIMs），也称为肌炎，是一组罕见且异质性的自身免疫性疾病，其特征是免疫介导的肌肉损伤。除了肌肉外，其他器官也常受到影响，如皮肤、肺、关节和胃肠道，导致发病率甚至死亡率。肌炎特异性自身抗体（MSAs）的发现改善了患者的诊断和分类，有助于治疗策略的制定以及对分子机制的理解。抗MDA5（黑色素瘤分化相关基因5）自身抗体阳性的皮肌炎（DM）是肌炎的一种特殊亚型，其特征是皮肤溃疡和快速进展的间质性肺病（RP-ILD），其死亡率约为50%。值得注意的是，MDA5+肌炎在东亚的发病率显著较高，且与间质性肺病（ILD）和RP-ILD的发生率密切相关。目前使用传统的糖皮质激素和免疫抑制剂治疗MDA5+肌炎的疗效有限，导致整体预后较差。这突显了研究MDA5+肌炎潜在分子机制并探索创新治疗策略的迫切需求。

MDA5+肌炎的精确病因和发病机制尚未完全明了。该疾病被认为是由遗传易感性和环境触发因素之间的复杂相互作用引起的，这些因素打破了免疫耐受并导致抗MDA5自身抗体的产生。多种因素，包括抗MDA5自身抗体、免疫细胞和促炎介质，参与了MDA5+肌炎的免疫病理过程。MDA5+ DM等不同类型的DM的一个显著特征是I型干扰素（IFN-I）诱导基因的上调，这已在这些患者的皮肤、肺、肌肉和外周血液中观察到。有趣的是，MDA5+患者的肌肉受累程度较轻，表现为炎症轻微、局部肌膜周围巨噬细胞浸润、MHC-I表达缺失或局部缺失，以及补体沉积罕见。

最近的单细胞（sc）分析技术进步使得对肌炎的细胞/分子特征进行深入研究成为可能。对MDA5+患者的外周血单核细胞（PBMCs）进行的scRNA-seq研究显示，免疫细胞比例增加，同时IFN-I反应过度激活。然而，免疫功能障碍和免疫细胞如何介导炎症并影响MDA5+患者的肌肉仍大部分未知。在这项研究中，我们对肌炎患者和健康对照组的肌肉活检样本进行了空间转录组分析，旨在阐明MDA5+ DM的特异性分子、细胞和微环境特征。

**结果**
**空间转录组学揭示MDA5+肌肉中的独特基因表达谱**
我们对3例MDA5+ DM患者、8例MDA5- IIM患者（包括2例抗Ro52、1例抗TIF1、1例抗Mi2、1例抗HMGCR、1例抗Ku和2例血清阴性样本）以及3例健康对照组（Ctrl）的肌肉活检样本进行了空间转录组测序（图1A和S1A及表S1）。表型上，11例IIM患者包括4例临床表现为肌炎的DM（CADM）、3例重叠性肌炎（OM）、2例DM、1例多发性肌炎（PM）和1例免疫介导的坏死性肌病（IMNM）（表S1）。使用Space Ranger流程，从所有样本中检测到9,112个位点。数据质量很高，每个位点的UMI计数为15,614，平均检测到3,774个基因（图S1B和表S2）。所有样本的空间均匀流形逼近和投影（UMAP）分析显示两个不同的组（图1B）。组1包括3个Ctrl样本，组2包括3个MDA5+样本（CADM42、CADM63、CADM76），证实MDA5+与Ctrl之间存在明显分离（图1C）。UMAP评估确认了全局分离是由生物学状态而非技术差异引起的（图S1C）。在同一捕获区域共处理的样本清晰地按组分开，排除了载玻片特异性偏差，任何残留的批次效应均通过Harmony计算消除。然而，OM（OM49、OM60、OM64）和DM（DM70、DM81）样本分布在两个组中（图1D），表明存在显著异质性。伪批量分析用于识别MDA5+与Ctrl之间的差异表达基因（DEGs）。尽管没有临床 weakness（表S1），我们发现MDA5+肌肉中与免疫相关的基因如ISG15、IFI6、MX1、CMPK2、OAS1、RSAD2等高度富集（表S2）。对MDA5+样本中上调的DEGs进行的基因本体论（GO）富集分析显示，这些基因与“对病毒的防御反应”、“对病毒过程的负调控”、“细胞对IFN-I的反应”等GO术语相关（图1E和表S2）。所有肌炎样本中上调的DEGs也与免疫反应相关的GO术语富集（图1F和表S2）。同样，将每种亚型与Ctrl比较时，所有亚型都富集了与免疫相关的通路（图S1D–S1F和表S2）。具体而言，之前报道的DM中常见的前10个上调IFN相关基因（ISG15、IFI6、MX1、RSAD2、MX2、OAS1、IRF9、IFITM1、CMPK2、OAS3）在3个MDA5+样本（用红色突出显示）和DM81样本中显著上调（图1G）。例如，观察到ISG15的显著上调（图1H）。

**图1 空间转录组学揭示MDA5+肌肉中的独特基因表达谱**
**图注**
（A）研究设计示意图。从11例肌炎患者（包括3例MDA5+、8例MDA5- IIM患者和3例健康对照组）中收集肌肉活检样本。使用Visium对新鲜冷冻样本进行空间转录组分析，CytAssist（10× Genomics）用于细胞类型去卷积分析。采用了一个公开可用的snRNA-seq数据集进行细胞类型反卷积分析。进行了综合数据分析，包括微环境识别、微环境富集DEG分析、信号通路互作、通路活性和免疫细胞点分析。
（B）UMAP可视化显示每个样本的Visium点。
（C）UMAP可视化显示每个血清型的Visium点。
（D）UMAP可视化显示每个亚型的Visium点。（对于B–D，手动添加了虚线以突出两组之间的整体转录组差异。）
（E）使用前200个上调基因，比较MDA5+组（n = 3）和Ctrl组（n = 3）中富集的生物学过程术语的GO图。x轴显示-log10调整后的p值。
（F）使用前200个上调基因，比较肌炎组（IIM）（n = 11）和Ctrl组中富集的生物学过程（BP）术语的GO图。x轴显示-log10调整后的p值。
（G）热图显示每个样本中DM标记基因的平均表达水平。选择的标记基因基于先前的研究进行整理。平均表达水平转换为Z分数以便可视化。
（H）所有样本中ISG15的空间基因表达；原始计数经过对数转换和标准化。

**细胞类型分析显示MDA5+肌肉中免疫细胞浸润增加**
为了进一步阐明MDA5+肌肉的病理改变，我们使用cell2location进行了去卷积分析以解析空间点的细胞类型组成。使用来自IMNM、IBM和健康肌肉的公开可用单核RNA-seq数据集进行细胞类型注释。数据分析流程和特定细胞类型注释完全复制自原始研究。共识别出22种细胞类型（图S1G–S1I），包括主要类型如1型和2型肌核（type 1/2 MN）、应激肌核（sMN）、反应性肌核（rMN）、内皮细胞（ECs）、成纤维脂肪生成前体（FAPs）、骨骼肌干细胞（MuSCs）和免疫细胞。估算细胞类型丰度，发现肌炎样本之间的细胞组成存在高度异质性（图2A和表S3）。例如，sMN的丰度（从20%到56%）和免疫细胞（从1.3%到13%）在不同肌炎样本和同一亚型内存在差异（CADM63中sMN为20% vs CADM76中为45%，OM49中为32% vs OM64中为56%）（图2A）。定量分析显示，尽管MDA5-肌肉中的sMN比例显著高于对照组，但MDA5+肌肉的表型较轻（图S2A），这与MDA5+患者的正常肌肉力量和CK水平一致（表S1）。有趣的是，尽管肌纤维损伤较轻，MDA5+肌肉仍保留了大量免疫细胞（平均10% vs MDA5-中的4%）（图2B和S2A）。在临床亚型中，OM和DM肌肉的sMN丰度呈数值上升趋势（图2C和S2B）。

**图2 细胞类型分析显示MDA5+肌肉中免疫细胞浸润增加**
**图注**
（A）通过去卷积计算每个样本中的细胞类型组成。
（B）Ctrl、MDA5+和MDA5-组之间的细胞类型组成比较。
（C）肌炎亚型之间的细胞类型组成比较。
（D）每个样本中免疫细胞类型的丰度。
（E）Ctrl、MDA5+和MDA5-组之间免疫细胞丰度的比较。
（F）4个代表性样本中1型肌纤维核（type 1 MN）、2型肌纤维核（type 2 MN）、应激肌核（sMN）、细胞毒性T细胞（CTLs）、B细胞、浆细胞和内皮细胞的细胞类型组成比较。
（H）代表性样本中CD44（红色）的免疫荧光染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色，血管用α-SMA（绿色）染色。刻度尺，200 μm。
（I）热图显示细胞类型的空间位置相关性（?皮尔逊相关系数> 0.25）。
（J–L）空间图显示Ctrl73和CADM63样本中sMN和1型MN（J）、rMN和MuSC（K）、CTL和Th细胞（L）的丰度和共定位。

然后我们详细研究了免疫细胞类型；共鉴定出11种免疫细胞类型，包括1型和2型巨噬细胞（MΦ1、MΦ2）、典型1型树突状细胞（cDC1细胞）、LAMP3+树突状细胞（LAMP3+ DC细胞）、细胞毒性T细胞（CTLs）、辅助T细胞（Th细胞）、调节性T细胞（Treg细胞）、自然杀伤细胞（NK细胞）、B细胞、浆细胞和循环免疫细胞（Cyc细胞）（图2D和S3A）。尽管样本间存在显著异质性（图S2A），去卷积分析显示MDA5+组相对于MDA5-肌肉中特定免疫细胞（包括LAMP3+ DCs、Tregs和NK细胞）的富集（图2E、S2A和S3B）。同样，CADM亚型显示出LAMP3+ DCs的比例高于DM和OM（图2F、S2B和S3C）。例如，如图2G所示，MDA5+ CADM76肌肉中的B细胞、浆细胞和CTLs丰度增加，而sMN丰度降低。为了验证上述发现，我们对CD44（免疫细胞和浸润的标志物）进行了染色，并在两例MDA5+肌肉（CADM63和CADM42）和OM60肌肉的血管区域发现了信号增强（图2H和S3D）。还使用特定的免疫细胞标记物（CD68、CD20、CD163和CD11c）以及内皮标记物CD31进行了共染色（图S3E–S3H），确认这些免疫细胞在MDA5+肌肉中的数量显著增加，且大多位于血管附近（200 μm范围内）。

此外，我们分析了所有样本中细胞类型的空间共定位（图2I），发现sMN和1型MN经常占据相同的空间位置，表明1型肌纤维可能对压力特别敏感（图2I和2J）。肌肉干细胞（MuSCs）经常与rMN共定位，这突显了它们在修复肌纤维中的作用（图2I和2K）。Th细胞被发现与CTLs共定位，可能促进了CTL的激活（图2I和2L）。B细胞与CTLs以及Th细胞和cDC1细胞显著共定位（图2I和S3I）。正如预期的那样，内皮细胞（ECs）和周细胞（pericytes）在血管周围共定位（图S3J）。1型（type 1 MN）和2型（type 2 MN）肌肉细胞显示出负相关性，并且分布分离（图S3K）。微环境分析显示MDA5+肌肉中存在独特的细胞微环境。

为了进一步研究肌炎肌肉中的复杂微环境，我们通过细胞类型组成来识别不同的细胞微生态位。基于每个微点的去卷积细胞类型，进行了非负矩阵分解（NMF）分析（图3A）。结果发现了6种类型的微生态位：“EC微生态位”（主要由ECs和pericytes组成）、“FAP微生态位”（主要由FAPs组成）、“rMN微生态位”（包含rMN、MuSCs和免疫细胞）、“1型MN微生态位”（主要由1型MN组成）、“2型MN微生态位”（主要由2型MN组成）以及“sMN微生态位”（包含sMN和B细胞、浆细胞以及Treg细胞等免疫细胞）（图3B和3C）。例如，对sMN微生态位的细胞组成进行量化分析显示出sMNs占主导地位（图3D和3E）。此外，差异表达基因（DEG）分析显示每种微生态位的表达谱不同，排名靠前的DEGs与其细胞类型组成一致（图3F和表S4）。例如，EC标志物VWF、CDH5和PECAM1，在EC微生态位中高表达；平滑肌细胞标志物MYH11、ACTA2和TAGLN在FAP微生态位中高表达；与肌肉再生相关的基因MYOG和MYH3在rMN微生态位中高表达；与自噬相关的基因SQSTM1，以及应激反应基因MKNK2、MTLN、SELENOM和NFE2L1在sMN微生态位中上调；与快速骨骼肌纤维相关的基因MYH1、MYH2、TNNT3和TNNI2在2型MN微生态位中富集，而与慢收缩纤维相关的基因MYH7B、MYH7和ATP2A2在1型MN微生态位中富集（图3F）。预期地，在3个对照（Ctrl）肌肉中检测到的sMN微生态位数量较少，但在肌炎肌肉中数量显著增加（图3G和3H）。MDA5+肌肉中的sMN微生态位比例也低于MDA5-肌肉（33%对比41%）（图3I）。在比较不同亚型时，DM（58%）和OM（50%）中的sMN微生态位比例较高，而CADM中仅为31%（图3J）。此外，在不同亚型内部也观察到了微生态位的异质性。例如，CADM47中的25%的sMN微生态位与CADM63中的4%相比有所差异，DM81中的31%与DM70中的86%相比也有差异（图3G和3H）。

微环境分析揭示了MDA5+肌肉中独特的细胞微环境。

为了进一步研究肌炎肌肉中的复杂微环境，我们根据空间点的细胞类型组成来识别细胞微生态位。基于每个点的去卷积细胞类型，进行了非负矩阵分解（NMF）分析（图3A）。结果发现了6种类型的微生态位：“EC微生态位”（以ECs和pericytes为主）、“FAP微生态位”（以FAPs为主）、“rMN微生态位”（包含rMN、MuSCs和免疫细胞）、“1型MN微生态位”（以1型MN为主）、“2型MN微生态位”（以2型MN为主）以及“sMN微生态位”（包含sMN和B细胞、浆细胞及Treg细胞等免疫细胞）（图3B和3C）。例如，sMN微生态位的细胞组成量化分析显示sMNs占主导地位（图3D和3E）。进一步地，差异表达基因（DEG）分析揭示了每种微生态位的独特表达谱，排名靠前的DEGs与其细胞类型组成一致（图3F和表S4）。例如，EC标志物VWF、CDH5和PECAM1，平滑肌细胞标志物MYH11、ACTA2和TAGLN在EC微生态位中高表达；FAP标志物DCN、FBN1、MFAP5和PCOLCE在FAP微生态位中高表达；与肌肉再生相关的基因MYOG和MYH3在rMN微生态位中高表达；与自噬相关的基因SQSTM1，以及应激反应基因MKNK2、MTLN、SELENOM和CRYAB和NFE2L1在sMN微生态位中上调；与快速骨骼肌纤维相关的基因MYH1、MYH2、TNNT3和TNNI2在2型MN微生态位中富集，而与慢收缩纤维相关的基因MYH7B、MYH7和ATP2A2在1型MN微生态位中富集（图3F）。预期地，在3个对照肌肉中检测到的sMN微生态位数量较少，但在肌炎肌肉中数量显著增加（图3G和3H）。MDA5+肌肉中sMN微生态位的比例低于MDA5-肌肉（33%对比41%）（图3I）。在比较不同亚型时，DM和OM中的sMN微生态位比例较高（分别为58%和50%），而CADM中仅为31%（图3J）。此外，在不同亚型内部也观察到了微生态位的异质性。例如，CADM47中的25%的sMN微生态位与CADM63中的4%相比有所差异，DM81中的31%与DM70中的86%相比也有差异（图3G和3H）。

图3 显示MDA5+肌肉中独特的细胞微环境。

（A）基于细胞类型组成的微生态位识别的示意图，采用非负矩阵分解（NMF）分析方法。
（B）细胞类型（行）在不同微生态位（列）中的估计NMF权重点图。
（C）热图显示了不同微生态位中细胞类型丰度的百分比分布。
（D）四个代表性样本中以sMNs为主的“sMN微生态位”示意图。
（E）饼图显示了“sMN微生态位”的细胞类型组成。
（F）热图显示了每种微生态位中排名靠前的50个DEGs（|log2FC| > 1.3，校正p < 0.05）。
（G）条形图显示了所有样本中的微生态位组成。
（H）空间图显示了所有样本中六种类型微生态位的分布。
（I）条形图比较了对照组（Ctrl）、MDA5+和MDA5-组之间的微生态位组成。

为了评估MDA5+肌肉的分子变化，我们分析了上述定义的微生态位中的差异表达基因（DEGs）（表S5）。在比较MDA5+与MDA5-肌肉中的1型及2型MN微生态位时，上调的DEGs主要集中在与“细胞对IFN-I的反应”、“IFN-I介导的信号通路”、“对病毒的防御反应”等相关的GO术语上，而下调的DEGs则主要集中在“神经肌肉接头发育”、“肌动蛋白-肌球蛋白组织”等相关术语上（图4A和4B）。在比较MDA5+与MDA5- sMN微生态位时，上调的DEGs也主要集中在类似的IFN相关GO术语上（图4A）。例如，IFN刺激基因OASL在MDA5+肌肉的1型MN、2型MN和sMN微生态位中上调（图4C）。NUPR1是一个关键的抗铁死亡（ferroptosis）抑制基因，在所有肌炎样本中均上调，但在MDA5+肌肉中表达量更高（图S4A）。在比较MDA5+与MDA5-肌肉的rMN微生态位时，上调的DEGs主要集中在“细胞外基质组织”、“胶原纤维组织”等相关术语上（图S4B）。FAP微生态位中的上调DEGs主要集中在“ECM通路”上，而“肌节组织”和“肌原纤维组装”相关通路则下调（图S4C）。

图4 显示MDA5+肌肉中EC微生态位的独特基因表达。

（A）热图显示了sMN微生态位中上调基因的前10个富集GO术语，按–log10校正后的p值着色。
（B）热图显示了sMN微生态位和1/2型MN微生态位中下调基因的前10个富集GO术语，按–log10校正后的p值着色。
（C）所有样本中OASL的标准化空间表达。
（D）热图显示了对照组（Ctrl）、MDA5+和MDA5-组中前100个DEGs（|log2FC| > 1.3，校正p < 0.05）。
（E）MDA5+与MDA5-肌肉中上调和下调基因的前10个富集GO术语。x轴显示了–log10校正后的p值。
（F）空间图显示了对照组（Ctrl）、MDA5+和MDA5-肌肉中EC微生态位的分布（黄色点）以及IFI27的表达情况。
（G）条形图显示了MDA5+肌肉中EC微生态位中富集基因的表达情况。数据表示为平均值±标准差。圆点代表每个患者的平均表达水平。
（H）代表性肌炎肌肉中IFITM3（红色）和α-SMA（绿色）的免疫荧光染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺为200 μm。

值得注意的是，在比较MDA5+与MDA5- EC微生态位时，上调的DEGs主要集中在抗病毒反应和IFN-I相关通路相关术语上，而“氧运输”、“气体运输”、“一氧化氮介导的信号传导”和“二氧化碳运输”通路在下调的DEGs中占主导地位，表明MDA5+肌肉的血管具有增强的免疫反应和减弱的氧/气体交换功能（图4D和4E）。例如，IFI27基因在MDA5+与MDA5- EC微生态位中的表达上调（图4D和4F）。此外，IFI27的表达在MDA5+肌肉的EC微生态位中也比其他肌核微生态位类型更丰富（图4F和4G）。同样，MDA5+ EC微生态位中的一组上调DEGs，包括IFN-I刺激基因（IFITM3、OAS2、OAS3、LY6E和BST2）、抗病毒免疫相关基因（LGALS3BP和SAMHD1）、补体系统相关基因（SERPING1、C1S和C1R）以及自噬相关基因DEPP1，在MDA5+肌肉的EC微生态位中也更为丰富（图4G）。这一点通过IFITM3、SAMHD1和BST2的免疫荧光染色进一步验证，通过共染α-SMA标记血管；在MDA5+肌肉的血管区域发现了更强的染色（图4H和S4D–S4F）。然后我们研究了在MDA5+肌肉中激活这些IFN-I诱导基因的IFN来源。令人惊讶的是，在对照组或肌炎肌肉中几乎检测不到I型、II型和III型IFN的转录本，但几种IFN受体（如IFNAR1/2和IFNGR1/2）上调（图S4G）。总体而言，这些分析发现MDA5+肌肉的EC微生态位中富集了一组促炎性和IFN-I诱导基因，突显了MDA5+肌肉的显著IFN-I特征和血管病变。

还分析了不同亚型（OM和DM）中每种微生态位的转录组差异。OM肌肉在sMN、EC、1型和rMN微生态位中对IFN-I的反应较弱，而DM肌肉在EC、1型和2型微生态位中表现出已知的IFN-I特征（图S5）。

接下来，为了分析不同微生态位之间的细胞间通讯，我们使用COMMOT方法分析了细胞间的相互作用信号。共检测到42条信号通路，其中大多数在肌炎肌肉中增强（图5A和S6A及表S6）。例如，已有报道指出在肌炎中一些信号通路上调，包括CCL、CSF、galectin-9-CD44、MIF、COMPLEMENT、CXCL、granulin（GRN）、PDGF、VEGF和Visfatin。在这些通路中，我们的分析显示TGF-β通路在肌炎肌肉中的表达高于健康对照组（图5B和5C）。此外，我们发现sMN微生态位分泌的TGF-β信号分子量最多（图5D），这与TGF-β可以从“炎症性肌核”分泌的报道一致。我们还使用CellChat分析了已发布的scRNA-seq数据，一致显示了由TGF-β、MIF、COMPLEMENT信号等介导的广泛的细胞间相互作用（图S7）。

图5 显示MDA5+肌肉中EC微生态位中丰富的信号通路活动。

（A）热图显示了所有样本中通过COMMOT计算的标准化信号通信用强度。
（B）显示每个样本中TGF-β通路的信号方向（上）和标准化信号通信用强度（下）。
（C）对照组（Ctrl）、MDA5+和MDA5-组中TGF-β通路的标准化信号通信用强度比较。圆点代表个别MDA5+患者的平均强度。数据表示为平均值±标准差。统计显著性使用Student’s t检验确定。
（D）Sankey图显示了TGF-β信号的分泌和接收微生态位。
（E）热图显示了所有样本中PROGENY计算的标准化通路活性得分。
（F）代表性样本中JAK-STAT通路的标准化活性得分（左）。小提琴图显示了对照组（n = 3）、MDA5+（n = 3）和MDA5-组（n = 8）中JAK-STAT活性得分的比较（右上）。小提琴图显示了MDA5+肌肉中每种微生态位类型的JAK-STAT活性得分（右下）。
（G–J）之前的分析分别针对TGF-β（G）、NF-κB（H）、TNF-α（I）和缺氧（J）通路（?p <0.05；??p <0.01；???p <0.001）。统计显著性使用Mann-Whitney U检验确定。

为了加强上述结果，我们通过PROGENY分析研究了这些信号通路的下游基因表达（图5E和表S6）。结果显示，在3个MDA5+肌肉和CADM47、DM81肌肉中JAK-STAT通路活性上调（图5E和S6B），并且MDA5+肌肉的活性明显高于MDA5-肌肉（图5F和S6C）。此外，MDA5+肌肉中TGF-β通路的活性以及NF-κB、TNF-α、缺氧、PI3K、VEGF和p53通路的活性也上调（图5G–5J和S6D）。进一步地，我们分析了每种微生态位中的通路活性。值得注意的是，MDA5+肌肉的EC微生态位中TGF-β、缺氧、NF-κB和TNF-α通路的活性高于其他肌核微生态位类型（图5G–5J），这与EC微生态位中免疫反应增强和氧/气体运输功能减弱的结果一致（图4E）。为了解决样本间的差异，我们还进行了样本级别的伪批量分析。在这项全局分析中，包括JAK-STAT、PI3K和VEGF在内的广泛上调通路在MDA5+组中保持统计显著性（图S6C和S6E），与对照组和MDA5-组相比。此外，与我们的点级别观察结果一致，TGF-β、NF-κB、TNF-α和缺氧通路在MDA5+组中保持上升趋势。虽然这些通路在样本级别未达到统计显著性——可能是由于周围未受影响的组织稀释了高度局部化的血管周围信号——但在MDA5+肌肉的个体样本级别中，这些通路在EC微生态位中的富集仍然得到维持（图S6C）。

在MDA5+肌肉中，与体液反应相关的巨噬细胞浸润已被充分记录，但细胞如何促进炎症和肌肉萎缩/损伤仍不清楚。为了阐明免疫细胞在特定肌肉微环境中的功能作用，我们首先对所有Visium样本中的细胞类型丰度进行了排序，并根据免疫细胞类型丰度最高的（前5%）定义了“免疫细胞点”（图6A）。例如，MΦ1丰度最高的5%的样本被归类为“MΦ1点”。我们还量化了每个样本中这些点的比例，并描述了它们相关的微环境类型（图6B和表S7）。尽管样本间存在显著异质性，但MDA5+和CADM肌肉中这些高丰度免疫点的比例普遍高于其他肌炎亚型（图6C、6D、S8A和S8B）。

图6 MDA5+肌肉中与体液反应相关的巨噬细胞

完整标题

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(A) 左侧：所有样本中MΦ1丰度的分布；前5%被定义为“MΦ1点”。
右侧：每个样本中MΦ1点的分布。
(B) 按微环境类型分层的MΦ1点的比例。
(C) Ctrl、MDA5+和MDA5-组中MΦ1点的比例。数据以平均值±标准差表示，每个点代表一名患者。统计显著性使用Mann-Whitney U检验确定。
(D) 每种肌炎亚型中MΦ1点的比例。数据以平均值±标准差表示，每个点代表一名患者。统计显著性使用Mann-Whitney U检验确定。
(E) 热图显示了EC、rMN和sMN微环境中MΦ1点上调基因的GO术语，按–log10调整后的p值着色。
(F) 热图显示了EC、rMN和1型MN微环境中MΦ2点上调基因的GO术语，按–log10调整后的p值着色。
(G) 热图显示了rMN、1型和2型MN微环境中浆细胞点上调基因的GO术语，按–log10调整后的p值着色。
(H) 概图总结了研究结果。MDA5+肌肉的EC微环境中对IFN-I的反应被上调，可能是由血液中的系统性IFN-I激活的。TNF-α、NF-κB、缺氧和TGF-β的通路活性也在EC微环境中富集。免疫细胞（如巨噬细胞和浆细胞）通过血管浸润到肌肉中。

为了阐明免疫细胞的功能影响，我们比较了MDA5+肌肉中每种微环境类型中免疫细胞点与非免疫细胞点的基因表达。例如，我们比较了MDA5+肌肉的sMN微环境中MΦ1点与非MΦ1点的基因表达，发现MΦ1点中上调的通路包括“由循环IgG介导的体液免疫反应”和“非经典NF-κB信号转导的调节”，这表明MΦ1与MDA5+肌肉中的体液反应和免疫细胞激活有关（图6E和表S7）。EC微环境和rMN微环境中的MΦ2点也显示了“由循环IgG介导的体液免疫反应”等上调通路（图6F）。此外，在浆细胞点中发现了抗病毒反应、免疫球蛋白生产和内质网应激相关的通路上调（图6G）。此外，我们在1型MN微环境中发现了与免疫反应负调节相关的Treg细胞点，在2型MN微环境中发现了与IFN-I和抗病毒反应相关的LAMP3+ DC细胞点（图S8C和S8D）。总体而言，上述发现阐明了空间定位免疫细胞的功能影响，突显了MDA5+肌肉中巨噬细胞与体液免疫反应的独特免疫病理学关联。

讨论
MDA5+肌炎是一种独特的肌炎亚型，其特征是肌肉受累较少或没有，而皮肤和肺部受累明显。为了加深对这种疾病分子机制的理解，我们分析了来自具有不同表型和血清型的IIM患者队列的肌肉活检的空间转录组，其中包括3个来自MDA5+ CADM患者的罕见样本。UMAP降维很好地区分了MDA5+肌肉和健康肌肉，表明MDA5+肌肉具有独特的空间转录组特征。接下来，我们分析了细胞类型组成，发现MDA5+肌肉中的免疫细胞数量增加，而受压的MN数量减少。这种免疫细胞的增加可以通过免疫反应和血管损伤来解释，导致局部炎症和免疫细胞通过血管壁渗入周围组织。与此一致的是，我们在血管区域发现了CD44的染色增强，CD44是免疫细胞的标志物，同时也具有细胞迁移和粘附分子的功能，同时免疫细胞亚群也有所增加。与IBM或IMNM不同，在IBM或IMNM中CD8+细胞毒性T细胞直接靶向肌纤维，而在MDA5+肌肉中，增加的免疫细胞集中在血管区域，可能不直接针对肌纤维，这解释了为什么在MDA5+肌肉中检测到的受压MN较少。此外，我们发现受压的MN与对缺氧更敏感的有氧1型纤维共定位，这可能是由于EC损伤造成的，而与厌氧2型纤维相比。

空间转录组学通过解决特定组织区域/微环境中的基因表达问题，克服了批量测序的局限性。在MDA5+肌肉中，我们的数据提供了六个特征性微环境的转录组视图，特别关注EC微环境（周围血管区域）。在这个区域内，我们发现了一组由IFN-I诱导的基因上调，与肌纤维区域相比（图4），提供了空间上明确的证据，表明众所周知的IFN特征并非均匀分布，而是在周围血管微环境中显著富集。同时，我们发现与氧气运输相关的基因下调，指向血管功能障碍。更有趣的是，我们在肌炎肌肉中几乎检测不到IFN mRNA的表达，这表明IFN可能来自血液，血管首先对循环中的IFN作出反应，然后肌纤维对从血管扩散的IFN作出反应。这种循环驱动的机制模型与Kaewin等人的最新体外研究结果高度一致，他们证明DM患者血清中的系统性因素可以激活骨骼肌中的IFN信号通路。与此假设一致，我们发现EC微环境中识别出的IFN-I刺激基因的表达程度高于肌核微环境。有趣的是，DM患者皮肤活检中的EC显示出强烈的IFN-I诱导的MX1和ISG15染色，表明这种EC对IFN-I的反应是一个系统性现象。

此外，我们分析了细胞间通讯和通路活性，发现缺氧、NF-κB、TNF-α和TGF-β通路活性在MDA5+肌肉的EC微环境中富集。与我们的发现一致，在DM患者的血管内皮中发现了磷酸化p65亚单位的阳性染色。在DM肌肉的肌纤维周围部位也检测到了免疫反应性的TNF-α颗粒。据报道，在伴有ILD的DM/PM患者的血清以及DM和IBM患者的肌肉活检中，TGF-β上调。我们推测，这种缺氧且富含TGF-β的微环境驱动了最近一项单细胞研究中发现的组织驻留记忆T（Trm）细胞中的CD103表达，使它们重编程为慢性病态。有趣的是，一项在小鼠研究中持续激活EC中的TGF-β会导致严重的皮肤、肺部和微血管纤维化以及由于EndoMT导致的EC丢失，模仿了MDA5+ DM的表现，表明TGF-β通路在促进MDA5+疾病中的作用。

最后，我们分析了免疫细胞在MDA5+肌炎发病机制中的重要作用。在MDA5+肌肉中，巨噬细胞点与对循环IgG的体液反应上调、免疫细胞激活/增殖相关，表明巨噬细胞可能在应对自身抗体和促进疾病炎症中起重要作用。然而，正如我们的空间距离分析（图2I）所显示的，巨噬细胞与浆细胞并不邻近，因此这种对IgG的反应是由局部分泌的抗体驱动还是由系统性循环IgG沉积驱动还需要进一步研究。为了进一步验证不同免疫细胞浸润的具体功能作用，使用肌母细胞/EC的体外共培养系统将非常有用。这些模型——类似于之前用于研究树突状细胞和细胞毒性CD28null T细胞的模型——允许直接评估细胞介导的损伤以及免疫细胞与肌肉或EC之间的相互作用。此外，这些系统对于评估MDA5+ DM的靶向治疗效果至关重要，例如JAK抑制剂已被证明可以减少EC死亡。我们的结果还提示了几种潜在的MDA5+ DM治疗靶点，包括在周细胞-EC微环境中上调的IFN-I诱导基因程序、NF-κB、TNF-α和TGF-β通路，以及浸润的巨噬细胞和浆细胞。它们为针对相关通路的有希望的新疗法提供了机制支持：JAK抑制（托法替尼）在难治性MDA5+ DM中，抗TGF-β（吡非尼酮）在MDA5相关ILD中，B细胞耗竭（利妥昔单抗或CD19 CAR-T）在MDA5+ RP-ILD中，以及静脉注射免疫球蛋白（IVIG）在MDA5+ ILD中。虽然在其他肌炎亚型中抑制TNF-α的效果不一，NF-κB阻断正在其他自身免疫和肌肉疾病中进行探索，但我们的空间数据表明这些通路在MDA5+周围血管微环境中特别活跃，为它们的针对性评估提供了依据。应进行适当设计的临床试验来专门评估这些策略在MDA5+疾病中的效果。

总之，我们的发现表明，尽管没有临床无力症状，MDA5+肌肉表现出独特的空间结构，其特征是在周围血管区域富集IFN-I特征和免疫激活（图6H）。虽然受压肌核的数量较少，但MDA5+肌肉在周围血管区域显示出明显的免疫浸润。在肌炎肌肉中识别出六种不同的微环境类型，而MDA5+肌肉中的EC微环境独特地表现出炎症和IFN-I反应的上调，以及氧气运输通路的下调。细胞间通讯分析进一步表明缺氧、TGF-β、TNF-α和NF-κB信号增强，这些在MDA5+ EC微环境中特别富集。此外，免疫细胞的功能分析表明巨噬细胞在驱动局部体液免疫反应中起作用。总的来说，这些发现描绘了MDA5+肌肉中独特的空间免疫病理学，并揭示了潜在的治疗靶点。

研究的局限性
我们必须指出，由于IIM的罕见性，我们的研究仅限于11名患者，这限制了我们在组间严格匹配患者性别的能力。此外，由于不同的临床采集途径，特定的肌肉活检位置并不完全匹配；健康对照样本是在骨科手术期间收集的，而患者样本是通过标准锥形活检获得的。考虑到基线细胞组成（例如纤维类型和脂肪细胞）自然因解剖部位而异，我们关注的点是病理免疫细胞的浸润而不是常驻细胞的比例。通过利用我们的数据的空间分辨率进行微环境间的比较，减轻了整体组成的差异。此外，小样本量可能不足以研究IMNM或PM表型的发病机制，或区分MDA5+以外的血清型。此外，由于我们队列中的所有MDA5+患者都表现出CADM表型，很难严格区分与抗MDA5相关的特征和CADM表型本身相关的特征。需要更大规模队列的未来研究来分离这些变量并研究不同的肌炎亚型。此外，本研究中用于空间反卷积的snRNA-seq参考数据集主要来自IMNM、IBM和健康肌肉。虽然这不是我们队列中所有亚型的完美病理匹配，但基本的细胞谱系在炎症性肌病中是共享的，这使得可以绘制基本的细胞组成。

基于我们的发现，未来研究有几个关键方向。首先，应用单细胞分辨率的空间转录组学将精确描绘我们确定的关键血管和纤维微环境中的细胞变化和信号通路。其次，尽管有强烈的IFN-I特征，但我们未能在肌肉组织中检测到IFN mRNA，这表明其来源可能在肌肉之外。因此，确定在MDA5+患者中系统性干扰素（IFN）的主要来源是循环白细胞（PBMCs）还是其他受影响的组织（如皮肤和肺部）至关重要。此外，为了全面了解这种系统性自身免疫疾病，对MDA5+患者的肺部和皮肤病变进行空间转录组分析是必不可少的。这样的研究将直接揭示共同的和特定于组织的通路，特别是血管病理学方面的系统变化。这些机制性的见解将直接为治疗方案的开发提供信息。

资源可用性
主要联系人
如需进一步的信息和资源，请联系主要联系人Huating Wang博士（[e-mail]），她将予以提供帮助。

材料可用性
本研究没有生成新的独特试剂。

数据和代码可用性
支持本研究的数据可根据合理请求从相应作者处获得。本文报告的原始序列和处理后的空间转录组数据已存放在基因表达组（GEO）数据库中（GEO: GSE317538），并在本研究发表后公开。方法中描述的自定义脚本可根据请求提供。

致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（项目编号：2022YFA0806003）、中国非传染性疾病-国家重点科技重大项目（项目编号：2024ZD0530400）、香港特别行政区创新科技署的InnoHK计划、香港卫生局的卫生和医学研究基金（项目编号：10210906和23242241）、香港特别行政区研究资助委员会的通用研究基金（项目编号：14108225、14103526、14105123、14103522和14105823）以及中国国家自然科学基金（NSFC）（项目编号：82172436）的支持。此外，还得到了1+1+1 CUHK-CUHK(SZ)-GDST联合合作基金（项目编号：524002645）和香港特别行政区研究资助委员会的战略主题基金（STG）（项目编号：STG1/E-403/20）的资助。示意图（图1A和6H以及图形摘要）是用BioRender.com制作的。

作者贡献
Y.Q.进行了所有实验；G.L.分析了所有高通量测序数据；M.O.协助采购了健康的人类肌肉样本；H. Sun监督了计算分析；H. So负责获取肌炎肌肉活检及相关临床数据。H.W.监督了实验和数据分析；H.W.、H. So和Y.Q.共同构思了这个项目。Y.Q.、G.L.、H. So和H.W.共同撰写了手稿，所有作者都提供了意见。

利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。

手稿准备过程中生成AI和AI辅助技术的声明
在准备手稿的过程中，Yulong Qiao使用了“DeepSeek”和“Gemini”来提高语言的可读性。使用这些工具后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

STAR★
方法
关键资源表

试剂或资源
来源
标识符

抗体
驴多克隆抗鼠IgG（H + L）
Thermo Fisher Scientific
Cat# A-21202；RRID: AB_141607
驴多克隆抗兔IgG（H + L）
Thermo Fisher Scientific
Cat# A-21207；RRID: AB_141637
兔多克隆抗CD44
abcam
Cat# ab316123；RRID: AB_3665134
兔单克隆抗IFI27
Abclonal
Cat# A24337；RRID: AB_3755777
兔单克隆抗SAMHD1
Abclonal
Cat# A4607；RRID: AB_3756321
兔单克隆抗BST2
Abclonal
Cat# A23445
兔多克隆抗IFI27
abcam
Cat# ab171919
鼠单克隆抗α-平滑肌肌动蛋白
Thermo Fisher Scientific
Cat# 14-9760-82；RRID: AB_2572996
兔单克隆抗CD20
MedChemExpress
Cat# HY-P86444；RRID: AB_3719158
兔单克隆抗CD11c
MedChemExpress
Cat# HY-P83653；RRID: AB_3105755
兔多克隆抗CD68
abcam
Cat# ab303565；RRID: AB_3075482
兔多克隆抗CD163
MedChemExpress
Cat# HY-P81177；RRID: AB_3103089
鼠单克隆抗CD31
BioLegend
Cat# 303110；RRID: AB_493074

生物样本
人类肌肉活检
本研究
IRB #2022.366

关键商业试剂
Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE，Human Transcriptome，6.5 mm，4次重复
10× Genomics
PN-1000520
Dual Index Kit TS Set A，96次重复
10× Genomics
PN-1000251

存档数据
公共snRNA-seq数据
欧洲基因组-表型档案（EGA）
EGA: EGAS50000000310

软件和算法
Leica Las X office
Leica Microsystems
https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Fiji
ImageJ
https://imagej.net/
Space Ranger (v3.0.0)
10× Genomics
https://www.10xgenomics.com
Python (v3.9.19)
https://www.python.org/
https://www.python.org/
Scanpy (v1.10.3)
Wolf等人
https://github.com/scverse/scanpy
Harmony (v0.1.8)
Korsunsky等人
https://github.com/immunogenomics/harmony
Cell2location (0.1.4)
Kleshchevnikov等人
https://github.com/BayraktarLab/cell2location
Scipy-1.13.1
Virtanen等人
https://docs.scipy.org/doc/scipy-1.13.1/
GSEAPY
Fang等人
https://github.com/zqfang/GSEApy/
COMMOT (v.0.0.3)
Cang等人
https://github.com/zcang/commot
PROGENy
Badia-i-Mompel等人
https://github.com/scverse/decoupler
Cell Ranger (v8.0.1)
10× Genomics
https://www.10xgenomics.com
Seurat (v5.0.2)
Satija Lab
https://satijalab.org/seurat
CellChat2
Jin等人
https://github.com/SiYangming/CellChat2
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实验模型和研究参与者详情
该研究获得了香港中文大学-新界东集群临床研究伦理委员会的批准（参考编号：2022.366）。所有程序均按照标准操作程序和赫尔辛基宣言及ICH良好临床实践原则执行。所有研究参与者均获得了知情同意。入选者为2023年5月1日至2024年6月30日期间入住香港威尔士亲王医院风湿病科的IIM患者，且符合2017年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟（ACR/EULAR）的分类标准。共招募了11名患者，包括4例临床性肌炎（CADM）、2例肌炎（DM）、3例重叠性肌炎（OM）、1例多发性肌炎（PM）和1例免疫介导的坏死性肌病（IMNM），年龄在42至81岁之间（中位数为63岁），其中10名为女性，1名为男性。从患者的下肢肌肉中采集了Conchotome肌肉活检样本。患者的 demographics 信息、临床特征和MSA状态被记录下来（图S1A和表S1）。在三位70至74岁的女性受试者的骨科手术过程中收集了健康的对照组腘绳肌样本。

我们承认由于样本数量有限，不同组之间的性别并不完全匹配。然而，这不太可能影响我们的主要结论：核心研究组中的三名MDA5+ DM患者均为女性，而MDA5?对照组（n = 8）中仅有一名男性，从而最小化了MDA5+与MDA5?转录组比较中的潜在性别相关混淆。

方法详情
免疫荧光
免疫荧光实验按照我们之前的出版物进行。切片在室温下用4% PFA固定20分钟，然后在?20°C的冰冻甲醇中渗透10分钟。经过4% BSA封闭1小时后，切片与一级抗体孵育过夜。作为二级抗体使用了驴抗鼠IgG（H + L）高交叉吸附的二级抗体Alexa Fluor 488（Invitrogen, A-21202）和驴抗兔IgG（H + L）高交叉吸附的二级抗体Alexa Fluor 594（Invitrogen, A-21207）。一级抗体及其稀释比例如下：CD44（Abcam, ab316123，1:100）、IFIITM3兔mAb 1:150（Abclonal, A24337）、BST2兔mAb 1:150（Abclonal, A23445）、SAMHD1兔mAb（Abclonal, A4607, 1:100）、IFI27 1:100（Abcam, ab171919）、α-SMA（Invitrogen, Catalog #14–9760–82, 1:150）。成像使用Leica DM2500显微系统进行。使用Leica Las X office软件对所有实验组的亮度和对比度进行了全局线性调整。对于免疫细胞染色，切片用冷丙酮固定以保存表面蛋白质。一级抗体及其稀释比例如下：CD20（MCE, HY-P86444, 1:150）、CD11c（MCE, HY-P83653, 1:150）、CD68（Abcam, ab303565, 1:150）、CD163（MCE, HY-P81177, 1:150）、CD31（BioLegend, 303110, 1:150）。使用Leica Las X office软件测量免疫细胞与血管的距离。总体组织面积使用Fiji/ImageJ软件（版本1.54p）进行量化。

空间转录组
新鲜肌肉组织嵌入Optimal Cutting Temperature（OCT）中，冷冻在干冰上，并储存在?80°C。样品在10 μm的厚度下进行冷冻切片，放置在空白的Fisherbrand Superfrost Plus显微镜载玻片上。为了优化实验过程并减少技术批次差异，将来自不同个体的样品相邻放置在同一载玻片的6.5 mm × 6.5 mm捕获区域内（每个载玻片/批次的特定配对详见表S2）。在?20°C的 chilled MeOH中固定30分钟后，按照Visium CytAssist Spatial Gene Expression for Fresh Frozen – Methanol Fixation, H&E Staining, Imaging & Destaining协议（10× genomics, CG000614-Rev A）进行Hematoxyn & Eosin（H&E）染色。在显微镜下观察组织切片，选择质量最好的切片（无气泡、H&E染色均匀、无折叠/重叠的组织）进行0.1N HCl的脱色处理。库的制备遵循Visium CytAssist Spatial Gene Expression Reagent Kits（10× genomics, CG000495, Rev E）的用户指南。简而言之，脱色后，组织切片与Human WT Probes v2孵育过夜（20小时）进行杂交。连接后，使用Visium CytAssist机器将转录组探针从标准玻璃切片转移到Visium捕获切片上（两个6.5 mm × 6.5 mm捕获区域）。扩增后，从Visium切片中洗脱探针，并进行10个PCR循环的预扩增。最终库的循环数通过定量PCR确定。库在Illumina NovaSeq-6000系统平台上进行测序，每个捕获区域获得了25 GB的数据。

空间转录组数据处理
测序完成后，使用10× Genomics Space Ranger（v3.0.0）的count函数将原始fastq文件与人类参考转录组（GRCh38-2020-A）对齐，进行组织检测、基准检测和条形码/UMI计数。后续分析使用Python（v3.9.19）进行。使用scanpy（v1.10.3）加载过滤后的计数结果，排除了计数少于1000、特征少于200或线粒体基因占比超过20%的点。合并样本后，使用内置函数sc.pp.normalize_total()进行每百万计数（CPM）标准化，并使用sc.pp.log1p()进行对数转换。然后使用sc.pp.highly_variable_genes()函数选择高度变异的基因，参数设置如下：min_mean = 0.0125，max_mean = 3，min_disp = 0.5。选择高度变异基因后，使用sc.pp.scale()函数将数据缩放到零均值和单位方差。接下来，使用sc.tl.pca()函数对合并的对象进行主成分分析（PCA），设置50个组分，并使用Harmony（v0.1.8）消除批次效应。

细胞类型去卷积
使用Cell2location（0.1.4）进行空间数据去卷积，每位置10个细胞，检测α为20。未标准化的单细胞数据及其簇信息被用作参考，q05丰度计数用于后续分析。使用scipy（v1.13.1）的Pearson相关系数计算细胞类型丰度之间的相关性。通过Cell2location提供的built-in plot_spatial()函数在统一面板中可视化多种细胞类型的空间分布。

生态位鉴定
使用Cell2location包的非负矩阵分解（NMF）函数对细胞类型丰度的q05估计进行细胞生态位的鉴定。计算了2到30个因子，发现6个因子最好地代表了细胞生态位。根据每个生态位中独特的细胞类型组成为其分配了描述性名称。

差异表达基因（DEG）和GO分析
对合并的空间对象应用差异表达基因（DEG）分析，将其标准化为每百万计数（CPM），并使用sc.tl.rank_gene_groups()函数进行对数转换。除非另有说明，差异表达基因（DEG）的定义如下：绝对log2倍数变化（logFC）> 1.3，调整后的p值（padj）< 0.05，以及目标组中表达该基因的细胞比例（pts）> 0.1。对于图1及其相关图S1中的分析，采用了更严格的logFC截止值>2。使用GSEAPY（v 1.1.4）提供的内建函数enrichr()对每组中上调和下调的DEG进行GO富集分析，基因集为‘GO_Biological_Process_2025.gmt’，如Xie等人所述。

通过COMMOT进行细胞间通信分析
对于空间数据，使用COMMOT（v0.0.3）基于配体-受体相互作用和空间邻近性推断细胞-细胞通信网络。从CellChat数据库（物种=人类）获取配体-受体对，仅保留至少有5%的点表达配体和受体的配对（min_cellpct = 0.05）。然后使用内置函数ct.tl.spatial_communication()进行空间通信推断，距离阈值为500 μm（dis_thr = 500），并启用异源受体复合物（heteromeric = True）。将LR对聚类为信号通路（pathway_sum = True），仅保留至少包含一个通过上述过滤的有效LR对的通路，从而得到数据集中具有可检测细胞间通信活性的42条信号通路。

通过PROGENy进行通路活性推断
使用PROGENy方法从空间分辨的转录组数据推断通路活性，通过decoupler包（v2.1.1）实现。分析使用函数dc.op.progeny(organism = “human”)生成通路模型，然后对预处理的空间数据应用多变量线性模型dc.mt.ulm()。每个位置的通路活动分数随后使用`dc.pp.get_obsm`（键 = “score_ulm”）提取。在空间数据中，对于给定的免疫细胞类型，在所有样本中丰度最高的5%的位点被定义为该类型的高丰度位点，统称为“免疫位点”。例如，MΦ1中排名前5%的位点被称为“MΦ1位点”。其他细胞类型也采用相同的命名法（例如，“T细胞位点”、“B细胞位点”）。在“免疫位点”注释之后，进行了差异表达基因（DEG）分析，以比较每个生态位类型内的免疫位点（如上所定义）和非免疫位点之间的转录组。满足以下阈值的基因被识别为DEGs：logFC > 1.3、调整后的p值（padj）< 0.05以及pts > 0.1。这些DEGs随后被分为上调和下调两组，以便进行后续的GO富集分析。

snRNA-seq数据分析使用了来自已发表论文的snRNA-seq数据集，该数据集来源于IMNM、IBM和健康肌肉。核fastq文件经过修剪，并使用10× Genomics Cell Ranger（v8.0.1）计数功能与人类GRCh38-2024-A转录组对齐。然后使用R包Seurat（v5.0.2）对每个样本进行质量控制、标准化、降维和聚类。计数少于1,000个或超过20,000个、特征少于800个或线粒体基因占比超过5%的核被视为低质量核，并从后续分析中排除。数据使用Seurat实现的SCTransform进行标准化。接下来，使用Seurat中的内置函数进行可视化和聚类，包括RunUMAP()、FindNeighbors()和FindClusters()。随后，使用内置函数FindAllMarkers()识别低质量簇，这些簇的特点是缺乏标记基因以及存在线粒体基因或核糖体基因，然后将其移除。在排除所有低质量核后，使用SoupX（v1.6.2）消除背景mRNA污染。在排除所有低质量核和背景mRNA污染之后，使用DoubletFinder（v2.0.4）检测并移除每个样本中的假双态体。之后，将所有样本整合在一起，并使用Seurat CCA算法校正批量效应。最后，对整合后的对象进行标准化、降维和聚类，并使用内置函数FindAllMarkers()识别每个簇的标记基因，从而实现了细胞类型的鉴定。重要的是，细胞类型注释完全复制自原始参考研究。从这项复制分析生成的标记基因完整列表用于确认簇注释，见表S2。例如，反应性肌核（rMN）簇是通过COL19A1的高表达识别的，而应激性肌核（sMN）簇——在原始参考研究中称为“受损肌核”——则是通过应激反应基因GADD45A的表达定义的。同样，T辅助（Th）细胞是根据LEF1、IL7R和THEMIS的高表达进行注释的，而细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）则是通过KLRK1、CCL5和THEMIS识别的。有关所有注释的细胞类型及其相应标记基因的完整列表，请参阅原始研究。

snRNA-seq数据的细胞间通信分析使用了CellChat2数据库（仅限于分泌信号）和R包及其默认参数，使用内置函数aggregateNet()来分别识别同一生态位中不同细胞类型之间的生物相互作用。在这一步中，同一生态位中的所有细胞类型都被视为来源（配体）和目标（受体）。

非组学数据的统计分析使用GraphPad Prism版本10进行。组学数据的统计分析使用Python（版本3.9.19）和SciPy（版本1.13.1）进行。每个实验的统计细节，包括使用的统计测试、确切样本大小（n）、中心和离散度的定义以及显著性水平，都在相应的图表和图例中提供。除非另有说明，差异表达基因（DEGs）的定义如下：绝对log2倍数变化（logFC）> 1.3、调整后的p值（padj）< 0.05以及在目标组中表达该基因的细胞（位点）的比例（pts）> 0.1。

本研究没有生成任何额外资源。

补充信息（8）
下载所有文件：
- PDF（7.90 MB）：文档S1. 图表S1–S8
-电子表格（10.48 KB）：表S1. 肌炎患者的临床信息
- 电子表格（907.74 KB）：表S2. 空间转录组的数据质量、DEG和GO分析
- 电子表格（1.42 MB）：表S3. 细胞类型比例的量化
- 电子表格（343.28 KB）：表S4. 六种生态位类型的DEGs及其在所有样本中的比例
- 电子表格（2.50 MB）：表S5. 每个生态位亚型和血清型之间的DEGs和GO术语分析
- 电子表格（19.15 KB）：表S6. 细胞间相互作用和通路活动分析
- 电子表格（651.08 KB）：表S7. MDA5+肌肉不同生态位中免疫细胞位的DEG和GO分析