《Biology》：Exploratory Single-Nucleus Transcriptomic and Chromatin Accessibility Profiling Indicates Microglial Remodeling in Tuberous Sclerosis Complex-Associated Epilepsy
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背景：结节性硬化症（Tuberous sclerosis complex，TSC）常引发癫痫，但脑损伤灶内细胞类型特异的分子改变尚不清楚。方法：研究人员对来自同一队列的六例手术供体皮层组织进行单核RNA测序（single-nucleus RNA sequenc
背景：结节性硬化症（Tuberous sclerosis complex，TSC）常引发癫痫，但脑损伤灶内细胞类型特异的分子改变尚不清楚。方法：研究人员对来自同一队列的六例手术供体皮层组织进行单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq），其中TSC与对照各三例；并对其中四例供体（每组两例）进行单核转座酶可及染色质测序（single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin using sequencing，snATAC-seq）。在排除具有边界相关巨噬细胞样特征的核后，研究人员采用供体水平伪批量差异分析，并结合功能富集、推断细胞互作与基序分析。结果：在主要比较的六种细胞类型中，小胶质细胞差异表达基因最多（872个；282上调、590下调）。下调基因富集于溶酶体与脂质储存过程。推断的APP-CD74向小胶质细胞输入在多数来源细胞中更高，而APP-SORL1变化因来源而异。染色质分析鉴定出9283个差异可及区域；预测与ABCA1、ATP6V0A1和GPNMB相关的区域可及性降低，与RNA低表达一致。供体平均的TFEB与TFE3相关染色质变异区域评分在TSC中更低。结论：这些探索性发现提示小胶质细胞发生涉及脂质转运与细胞内物质处理（溶酶体/脂质储存）的重塑，为进一步研究小胶质细胞在癫痫发生中的作用提供了分子基础。
研究背景与立项依据
结节性硬化症（Tuberous sclerosis complex，TSC）是一种由TSC1或TSC2致病性变异引起的常染色体显性多系统疾病，其编码的hamartin与tuberin共同负调控机械靶标雷帕霉素复合物1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）。癫痫是TSC的主要临床表现，且药物抵抗率高，现有依维莫司（everolimus）等治疗仅对部分患者有效。皮层结节作为特征性病变，具有紊乱的皮层架构、异形神经元、巨细胞与胶质异常；由于病变细胞高度异质，传统批量测序难以解析特定细胞群的改变。既往小鼠与人体研究提示星形胶质细胞、少突胶质细胞及小胶质细胞均可能参与致痫过程，但人类病灶中细胞类型分辨的分子重塑仍不完整。尤其值得关注的是，mTOR信号同时偶联合成与分解代谢，脂质滴聚集的小胶质细胞在衰老脑中已被关联于功能障碍，但TSC病灶内是否出现脂质处理与内体-溶酶体加工异常，以及是否伴随染色质可及性改变，尚属未知。为此，研究人员开展单核水平多组学探索，以期在无伪复制的前提下识别小胶质细胞特异的可验证候选。
研究人员通过开展上述研究，得出以下核心结论：TSC相关癫痫皮层灶内小胶质细胞发生显著转录组与染色质重塑，以下调的脂质转运与溶酶体/内体加工基因为主；ABCA1、ATP6V0A1、GPNMB等候选基因在RNA与远端调控区域呈协同低表达、低可及性；TFEB/TFE3相关基序可及性偏移提示溶酶体程序可能受转录调控影响。该研究意义在于首次在人类TSC手术标本中以单核分辨率联合RNA与染色质可及性证据，将小胶质细胞功能偏向定位于“吞噬后清除能力不足”而非单纯激活，为后续机制研究与干预靶点筛选提供分子地图。
主要关键技术方法
研究人员纳入三名儿童TSC相关癫痫手术供体与三名儿科手术对照（含外伤后癫痫与无症状海绵状血管畸形），构建独立供体队列；对六例供体做snRNA-seq，对同队列四例供体做snATAC-seq。分析流程包括：以供体水平伪批量策略避免核水平伪重复，用DESeq2做负二项差异表达、edgeR做差异可及性检验；通过双finder与scrublet排除双核，剔除边界相关巨噬细胞样核；利用Seurat与Signac完成聚类注释与RNA辅助ATAC标注；采用CellChat推断配体-受体互作，rGREAT做区域-基因关联，chromVAR与足迹分析评估TFEB、TFE3等基序相关可及性；并以留一供体敏感性分析校验候选方向稳定性。
研究结果
3.1 供体特征：RNA队列为三例TSC与三例对照，ATAC子集取同队列四例，均为未成年人，伦理合规。
3.2 单核转录组质控：质控去双核后保留50148个RNA核，进一步排除109个支持或可疑边界相关巨噬细胞样候选，最终50039核进入图谱，其中小胶质核6520个。
3.3 细胞类型鉴定：聚类注释出兴奋性神经元、抑制性神经元、星形胶质细胞、内皮细胞、小胶质细胞、少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）、少突胶质细胞、周细胞及未知群，经典标记支持注释。
3.4 细胞组成与差异表达：群体占比仅为测序回收比例而非绝对丰度；在六个可比较细胞类型中，小胶质细胞差异表达基因数最多，282上调、590下调。
3.5 小胶质下调基因涉及脂质转运与内体-溶酶体过程：ABCA1、LIPA、ATP6V0A1、GPNMB、PPARG在TSC中均显著低表达；定向富集与预排序GSEA一致显示脂质运输、溶酶体组织、脂质储存与KEGG溶酶体通路（hsa04142）负向富集，且候选方向在留一供体分析中稳定。
3.6 推断的小胶质细胞互作改变：CellChat显示APP-CD74输入至小胶质细胞在多数来源中权重升高，APP-SORL1随来源不同而变化，反映 cargo 处理相关通信重排，但仅为推断而非直接通量测量。
3.7 互补的snATAC-seq细胞图谱：四供体质控后保留25314个ATAC核，RNA辅助注释得到小胶质等类型；微胶质差异可及区域共9283个，其中3443增益、5840丧失可及性。
3.8 差异可及性关联脂质与溶酶体过程：GREAT将丧失可及区域关联至脂质转运、溶酶体组织与定位；ABCA1、ATP6V0A1、GPNMB各关联远端区域且可及性降低，与RNA方向一致；edgeR与DESeq2模型间高度吻合，证明同队列内方法稳健。
3.9 跨组学方向一致性与基序可及性：RNA差异基因与DAR交叉得458个唯一基因，318个呈“RNA与可及性同降”；chromVAR显示TFEB、TFE3供体平均分降低，足迹分析示其基序周围Tn5插入模式改变，SPI1反向；以上为描述性调控线索。
讨论部分总结
研究人员强调，剔除边界相关巨噬细胞样核后，小胶质细胞以下调脂质处理与溶酶体注释为主，候选基因方向经留一分析稳健；ABCA1、ATP6V0A1、GPNMB的低转录与远端低可及性构成跨组学线索，但未必等同蛋白缺失或胆固醇蓄积。APP-CD74通信增强仅提示 cargo 分选可能异常。TFEB/TFE3基序变化受相似基序家族与局部背景影响，不能直接推定因子占用或因果。核心局限为供体数少（RNA每组3、ATAC每组2），对照为手术患儿而非健康脑，且横断面切除组织不能判断改变先于癫痫。后续需在独立队列验证候选，并结合溶酶体脂酶活性、胆固醇外流、吞噬体成熟与神经元网络记录确认功能与致痫关联。
结论译文
供体水平单核RNA测序分析提示，TSC相关致痫病灶中存在涉及脂质转运与内体-溶酶体过程的小胶质细胞重塑。与ABCA1、ATP6V0A1和GPNMB相关的预测区域可及性降低，以及TFEB/TFE3相关基序改变，提供了互补的调控线索。这些发现为进一步研究小胶质细胞与癫痫发生的关系提供了分子基础，但其仍属探索性结果，需独立重复与功能验证后方可推导因果或治疗结论。
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