《Biology》：Characterization of Clonixeril as a Positive Modulator of DMXAA-Induced Murine STING Signaling
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干扰素基因刺激因子（STING）是天然免疫信号传导的核心介质，也是炎症性疾病的治疗靶点。此前，研究人员鉴定出Clonixeril（CXL）作为人源STING（hSTING）信号的浓度依赖性抑制性调节剂。尽管结构保守，小鼠STING（mSTING）与hSTING
干扰素基因刺激因子（STING）是天然免疫信号传导的核心介质，也是炎症性疾病的治疗靶点。此前，研究人员鉴定出Clonixeril（CXL）作为人源STING（hSTING）信号的浓度依赖性抑制性调节剂。尽管结构保守，小鼠STING（mSTING）与hSTING在配体识别和激活方面存在差异。研究人员假设CXL在小鼠系统中可能表现出不同的活性。小鼠因其与人类的遗传相似性以及用于评估治疗化合物的全身活性和安全性而被广泛应用于生物医学研究。研究人员采用计算建模以及体外和体内研究评估了CXL对mSTING的影响。分子动力学模拟和诱导契合对接预测CXL与mSTING具有良好的结合。在3T3-L1细胞中，CXL增强了DMXAA诱导的STING、TBK1和IRF3磷酸化以及IFN-β mRNA表达，显示STING通路激活。在C57BL/6小鼠体内评估了CXL的急性药效。CXL增加了DMXAA给药后的IFN-β水平。组织病理学显示无治疗相关异常。HPLC在血清和肝脏中检测到CXL。该研究鉴定了种属特异性反应，提示小鼠模型可能无法准确反映CXL对hSTING信号的影响。急性CXL治疗耐受性良好，CXL是体内DMXAA诱导的mSTING信号的正向调节剂。
研究背景方面，干扰素基因刺激因子（STING）通路是天然免疫应答的关键介质，将胞质DNA感知与I型干扰素（IFN-I）的转录激活相连接。STING信号失调可通过促进异常免疫应答扰乱细胞和全身稳态，参与多种疾病的发生发展。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）催化生成内源性第二信使2′,3′-环鸟苷酸-腺苷酸（2,3-cGAMP），后者结合STING触发构象变化，促进其二聚化、寡聚化并从内质网转运至高尔基体，进而招募并激活TANK结合激酶1（TBK1），磷酸化STING和干扰素调节因子3（IRF3），磷酸化IRF3核转位后启动IFN-I转录。研究人员此前通过分子动力学（MD）引导的虚拟筛选鉴定了CXL作为hSTING的非核苷酸调节剂，其通过稳定部分闭合的自抑制寡聚状态干扰STING寡聚化，在低浓度下抑制hSTING激活。尽管mSTING与hSTING高度保守，但在配体特异性、敏感性和受体容许性方面存在显著差异，mSTING对更广泛的内源性和合成配体（包括DMXAA）有响应。DMXAA最初作为血管 disrupting 剂开发，后续研究证明其生物活性主要源于直接激活mSTING，而hSTING对DMXAA完全无响应，这一种属差异在临床试验中导致DMXAA未能显示治疗获益。鉴于小鼠模型在临床前研究中的广泛使用，理解种属特异性差异对于评估新型化合物的全身活性、治疗潜力和初步安全性至关重要，因此研究人员开展了CXL在mSTING模型中的活性研究。
研究人员采用的关键技术方法包括：分子动力学模拟（MD）和诱导契合对接（IFD）进行计算建模预测CXL与mSTING的结合模式和亲和力；使用小鼠3T3-L1成纤维细胞进行体外实验，通过Western blot检测STING、TBK1、IRF3磷酸化水平，通过终点PCR检测IFN-β mRNA表达；采用雄性C57BL/6J小鼠（6–8周龄，购自Jackson Laboratory）进行体内研究，实施两步腹腔注射方案；通过ELISA定量血清IFN-β；采用苏木精-伊红（H&E）染色进行组织病理学分析；通过高效液相色谱（HPLC）检测CXL在血清、肝脏、肾脏和脾脏中的分布；使用GraphPad Prism进行统计分析。
研究结果方面，第一，mSTING与DMXAA和CXL结合的计算预测：研究人员通过定点限制性IFD预测CXL对mSTING的KD为290 nM，DMXAA为240 nM，2,3-cGAMP为160 nM，与实验报道的DMXAA和2,3-cGAMP结合mSTING的KD值（分别为490 nM和300 nM）一致，CXL对hSTING的计算KD为630 nM、实验KD为430 nM，验证了模型性能。结合姿势叠加显示CXL与DMXAA结合特征相似，但CXL与STING LID区域的相互作用多于DMXAA，提示CXL可能诱导不同的受体构象。第二，CXL进一步增强DMXAA诱导的3T3-L1细胞IFN-β mRNA表达：浓度筛选显示500 pM CXL预处理后IFN-β mRNA水平相对DMXAA组显著增加（p < 0.0001），效应最为显著，因此选用500 pM进行后续实验，CXL预处理后IFN-β mRNA水平较单用DMXAA组进一步升高。第三，CXL增强DMXAA诱导的3T3-L1细胞STING、TBK1和IRF3磷酸化：DMXAA处理较未处理对照组增加p-STING、p-TBK1和p-IRF3水平，CXL+DMXAA组较DMXAA组进一步增强STING、TBK1和IRF3磷酸化。第四，CXL进一步增强C57BL/6小鼠中DMXAA诱导的IFN-β产生：未处理和载体处理组血清IFN-β低于定量下限（31.2 pg/mL），DMXAA组可定量（112.5 ± 25.8 pg/mL），1 mg/kg CXL+DMXAA组较单用DMXAA增加3.05倍（343.0 ± 21.9 pg/mL；p < 0.0001），5 mg/kg组增加1.95倍（219.6 ± 17.2 pg/mL；p = 0.0090），10 mg/kg组（140.4 ± 15.2 pg/mL）与单用DMXAA无显著差异，呈现非单调剂量响应。第五，组织病理学分析未显示治疗相关变化：最高剂量10 mg/kg CXL+20 mg/kg DMXAA组与对照组相比，脾、肾、肝脏组织结构保存完好，无结构破坏、炎症或病理改变迹象，治疗期间未观察到体重、摄食或行为变化。第六，肾脏组织分析未检测到CXL：HPLC分析显示CXL给药6小时后肾脏组织在CXL保留时间处无 detectable 峰，而体外加标阳性对照在29分钟处显示明显峰。第七，脾脏组织未检测到CXL：CXL给药后6小时脾脏组织在相应保留时间无 detectable 峰。第八，血清中CXL仍可检测：CXL给药后6小时血清在29分钟处检测到明显峰，证实CXL存在于体循环中。第九，肝脏组织中CXL可检测：CXL给药后6小时肝脏组织在29分钟处检测到峰，表明CXL在实验条件下仍存在于肝组织中。
讨论部分总结：STING通路在天然免疫中介导IFN-I产生，是癌症、感染性疾病和炎症性疾病治疗开发的重要靶点。尽管mSTING与hSTING高度结构保守，但配体识别、激活和下游信号传导存在显著差异，导致种属特异性药理反应，对临床前药物开发具有重要意义。本研究旨在确定CXL在mSTING通路中是否表现出可比药理行为。计算研究建立了评估CXL在mSTING中活性的结构框架，预测CXL在环二核苷酸结合口袋中良好结合，与DMXAA和2,3-cGAMP的实验结合亲和力一致。CXL和DMXAA占据相似结合位点，但与STING lid区域相互作用的细微差异提示CXL可能诱导不同的受体构象。体外研究支持计算预测，CXL预处理增强DMXAA诱导的STING、TBK1和IRF3磷酸化及IFN-β mRNA表达，表明CXL不干扰mSTING信号而是增强通路激活，与hSTING中观察到的抑制活性相反。体内发现与体外观察密切平行，CXL以非单调方式增强DMXAA诱导的IFN-β产生，最大增强在1 mg/kg，5和10 mg/kg效应递减，与CXL在hSTING中报道的浓度依赖性行为一致。基于计算建模，研究人员推测低浓度CXL促进初始受体寡聚化并增强DMXAA诱导信号，而高浓度CXL可能与DMXAA竞争结合口袋，调节联合反应。HPLC证实CXL给药6小时后存在于血清和肝脏中，而在肾脏或脾脏中未检测到。组织病理学检查显示肝脏、肾脏和脾脏组织结构保存完好，无治疗相关异常，表明治疗方案耐受性良好。总之，计算建模、细胞实验和体内研究的一致性支持CXL作为DMXAA诱导的mSTING信号正向调节剂的结论，与先前报道的hSTING抑制活性相反，提示传统小鼠模型可能无法准确预测CXL对人STING信号的影响。
研究结论翻译：本研究表明CXL在mSTING中与hSTING相比表现出不同的药理特征。计算建模预测CXL与mSTING良好结合，体外和体内研究证明CXL联合DMXAA处理后STING通路信号增强。此外，CXL在全身给药后可在血清和肝脏中检测到，肝脏、肾脏和脾脏组织无治疗相关组织学变化。总之，这些发现确立CXL在所检查条件下耐受性良好、保持全身可用性，并在体内作为DMXAA诱导的小鼠STING信号的正向调节剂。该研究强调了在评估STING靶向化合物向人类研究转化时纳入种属特异性药理学和方法学的重要性。
