下丘脑早期芳香化酶缺失与实验性阿尔茨海默病进展中神经元胰岛素抵抗信号的关联

《Biology》：Early Hypothalamic Aromatase Loss Is Associated with Neuronal Insulin-Resistance Signaling During Progression of Experimental Alzheimer’s Disease

　　

阿尔茨海默病（AD）日益被认为是一种以中枢胰岛素抵抗和脑低代谢为特征的神经退行性疾病。类固醇激素17β-雌二醇（E2）与胰岛素信号通路密切相互作用，并在脑内由芳香化酶局部合成。然而，脑内芳香化酶在AD进展过程中的时空动态变化及其与中枢胰岛素抵抗的关系仍知之甚少。研究人员采用5xFAD小鼠模型，检测了随疾病进展全脑、区域及神经元/星形胶质细胞特异性芳香化酶表达的改变。全脑芳香化酶表达在2月龄时未见变化，但在5和9月龄时逐渐下降，与淀粉样β斑块负荷呈负相关。对皮层、海马CA1区和下丘脑的区域分析显示，所有区域均出现进行性芳香化酶缺失；值得注意的是，下丘脑在所检测的最早疾病阶段即表现出显著下降，早于皮层和海马中的相应变化，但由于仅使用了单一年龄的野生型（WT）对照，年龄相关下降不能完全排除。细胞水平分析显示神经元芳香化酶表达进行性减少，而星形胶质细胞芳香化酶呈现双相反应，在疾病早期阶段升高，随后在晚期阶段下降。与此同时，神经元胰岛素抵抗信号随疾病进展进行性增强，并在所有检测区域与神经元芳香化酶表达呈负相关（r = ?0.82至?0.87）。总之，这些发现表明在淀粉样病理进展过程中脑芳香化酶存在进行性的区域及神经元/星形胶质细胞特异性改变，确定下丘脑早期易损性为AD相关胰岛素信号改变的一个特征。

阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆病因，以细胞外淀粉样β（Aβ）斑块、细胞内神经原纤维缠结、突触功能障碍和进行性认知下降为特征。越来越多证据表明代谢功能障碍是AD的早期特征，并可能促进疾病进展。值得注意的是，脑低代谢可在临床症状出现前数年即被检测到，提示脑代谢受损并非仅是已建立神经病理的下游后果。脑胰岛素抵抗日益被认为是AD病理生理学的关键组成部分，并促使将AD描述为一种"3型糖尿病"。在生理条件下，胰岛素信号通过激活胰岛素受体（IR）、胰岛素受体底物（IRS）及下游PI3K/AKT和MAPK通路调控葡萄糖转运和利用、线粒体功能及突触可塑性。这些信号通路的破坏损害神经元代谢，并与Aβ积累、tau过度磷酸化、氧化应激和神经炎症相关，所有这些均促进神经退行性过程。17β-雌二醇（E2）是一种神经活性类固醇，在包括AD在内的神经系统疾病的实验和临床研究中具有公认的神经保护特性。新出现的证据表明雌激素与胰岛素信号通路之间存在大量交叉对话。E2通过调节胰岛素受体信号、线粒体生物能量学和葡萄糖代谢增强胰岛素敏感性，而雌激素缺乏则与胰岛素反应性受损和脑葡萄糖利用降低相关。这些发现提示脑雌激素信号的改变可能促进AD进展中的代谢功能障碍。尽管E2传统上被认为是主要由卵巢产生的外周激素，但它也在脑内由芳香化酶局部合成。芳香化酶在男性和女性脑内均有表达，在生理条件下主要定位于多个区域的神经元，包括皮层、海马、下丘脑和杏仁核。局部合成的雌激素作为重要的神经调质，调控突触可塑性、认知过程和脑代谢。然而，脑损伤后芳香化酶在反应性星形胶质细胞中被强烈诱导，参与神经保护和修复反应。临床和实验研究进一步提示脑芳香化酶表达降低可能与神经元易损性和AD相关病理有关。尽管越来越多证据支持脑源性雌激素的神经保护作用，但AD进展过程中芳香化酶表达的时空动态仍不明确。特别是，尚不清楚芳香化酶的区域特异性和神经元特异性改变是否与神经元胰岛素抵抗的出现相关。因此，本研究采用5xFAD小鼠模型，表征淀粉样病理进展过程中全脑、区域及神经元/星形胶质细胞特异性芳香化酶表达变化，并检验其与神经元胰岛素抵抗信号的关系。研究人员使用雄性C57BL/6J和5xFAD转基因小鼠。5xFAD小鼠购自Jackson Laboratory，基因型通过基因分型方案确认。野生型（WT）对照为3月龄C57BL/6J小鼠。动物随机分为四组：WT对照组（3月龄）和2、5、9月龄5xFAD小鼠（n = 5）。脑组织经4%多聚甲醛（PFA）灌注固定后，于30%蔗糖中冷冻保护，以25 μm厚度冠状切片。感兴趣区域（皮层、海马和下丘脑）依据标准小鼠脑图谱使用一致的解剖标志选取。下丘脑评估图像特异性地取自腹内侧下丘脑核（VMH，Bregma后?1.70 mm至?1.90 mm）。免疫荧光染色使用以下一抗：抗芳香化酶、抗β-淀粉样蛋白、抗NeuN、抗GFAP、抗磷酸化IRS1（p-IRS1S616）和抗IRS1。荧光图像使用Leica STELLARIS共聚焦显微镜采集。定量分析测量积分密度（IntDen）值并以任意单位（A.U.）表示，荧光强度测量以无细胞背景荧光归一化。为避免5xFAD小鼠进行性神经元丢失对细胞特异性表达分析造成混杂，定量以每细胞为基础而非按总视野面积进行。在每个感兴趣区域内，每张切片随机选取5个形态完整的NeuN阳性（或GFAP阳性）细胞，在选定细胞边界内测量芳香化酶和p-IRS1S616的荧光强度，5个细胞的均值生成单张切片值，4–5张解剖匹配切片的均值生成每只动物的最终生物学重复值。采用Pearson相关分析评估Aβ斑块负荷与芳香化酶表达之间以及神经元芳香化酶表达与神经元胰岛素抵抗信号之间的关系。统计分析使用GraphPad Prism 11进行，多组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）继以Tukey多重比较检验。对于5xFAD小鼠脑芳香化酶、神经元芳香化酶和神经元p-IRS1变化的区域比较，强度归一化至WT小鼠相应脑区均值并以WT对照百分比表示（WT = 100%）。脑区、年龄及其交互作用的效应使用线性混合效应模型评估。为校正因运行多个独立ANOVA家族导致的I型错误膨胀，对所有主要ANOVA p值采用Benjamini–Hochberg程序进行全局错误发现率（FDR）校正。研究结果如下：3.1. 5xFAD小鼠脑内芳香化酶进行性减少并与淀粉样β病理负相关。对WT、2、5和9月龄5xFAD小鼠脑进行芳香化酶和Aβ双免疫染色，Aβ免疫反应性在WT小鼠中缺失，在5xFAD小鼠中随年龄进行性增加。全脑芳香化酶表达定量显示2月龄时与对照相比无显著变化，但在5和9月龄时下降。相关分析表明全脑芳香化酶表达与Aβ斑块负荷之间呈强负相关（r = ?0.92）。这些发现表明全脑芳香化酶表达在AD进展过程中进行性下降，并与增加的淀粉样病理呈负相关。3.2. 脑芳香化酶的区域特异性改变揭示下丘脑早期易损性。评估皮层、海马CA1区和下丘脑的芳香化酶免疫反应性。定量分析显示2月龄时皮层或海马CA1区芳香化酶表达与对照相比无显著变化，而下丘脑芳香化酶表达在该早期时间点即显著降低。在5和9月龄时，所有三个区域芳香化酶表达进行性下降。值得注意的是，下丘脑是所检测最早疾病阶段唯一表现出显著芳香化酶缺失的区域，而皮层和海马芳香化酶表达保持完好。这些发现确定了芳香化酶缺失时间模式的明显区域差异，提示下丘脑在AD早期进展中特别受影响。3.3. 下丘脑进行性神经元芳香化酶缺失发生更早。通过NeuN/芳香化酶共定位分析检测神经元芳香化酶表达。定量显示2月龄5xFAD小鼠皮层或海马CA1区神经元芳香化酶表达与对照相比无显著变化，而下丘脑神经元在该早期阶段即表现出芳香化酶表达显著降低。5和9月龄时皮层和海马神经元芳香化酶表达进行性下降，9月龄时观察到最低水平。尽管下丘脑神经元芳香化酶在5和9月龄时均降低，但这两个时间点之间未见进一步下降。总体而言，这些发现表明淀粉样病理进展过程中神经元芳香化酶进行性缺失，并确定下丘脑为最早表现出神经元芳香化酶缺陷的区域。3.4. 星形胶质细胞芳香化酶在AD进展中呈现双相反应。在皮层、海马CA1区和下丘脑进行GFAP/芳香化酶共免疫染色。与先前报道一致，对照小鼠星形胶质细胞中几乎检测不到芳香化酶表达。在5xFAD小鼠中，所有检测区域反应性星形胶质细胞芳香化酶表达与对照相比增加。定量分析显示2月龄时皮层和海马星形胶质细胞芳香化酶呈适度但显著的增加，而下丘脑观察到更大幅度的增加。5月龄时所有区域星形胶质细胞芳香化酶表达进一步增加，但有趣的是，9月龄时显著下降。这些发现表明星形胶质细胞芳香化酶在AD进展中呈现双相反应，特征为早期诱导随后晚期下降。3.5. 早期下丘脑胰岛素抵抗信号与芳香化酶缺失平行。进行NeuN和p-IRS1S616共免疫染色。IRS1在Ser616位点的磷酸化破坏正常胰岛素信号并与AD病理生理学相关，因此p-IRS1S616作为胰岛素抵抗信号的标志物。p-IRS1S616强度归一化至总IRS1。定量分析显示2月龄5xFAD小鼠皮层或海马CA1区神经元p-IRS1S616与对照相比无显著增加，而下丘脑神经元p-IRS1S616表达在该早期时间点即显著升高。随后在5和9月龄时所有检测区域均观察到神经元p-IRS1S616免疫反应性增加。值得注意的是，神经元胰岛素抵抗信号的时间模式与观察到的神经元芳香化酶缺失密切平行，下丘脑表现出最早的改变。这些发现表明AD进展过程中神经元胰岛素抵抗信号进行性发展，并确定下丘脑为胰岛素信号改变的早期部位。3.6. 神经元芳香化酶缺失与胰岛素抵抗信号强相关。对WT和5xFAD小鼠进行相关分析以确定各脑区神经元芳香化酶表达与神经元胰岛素抵抗信号的关系。在皮层，神经元芳香化酶水平与神经元p-IRS1S616表达呈强负相关（r = ?0.82）。在海马（r = ?0.86）和下丘脑（r = ?0.87）观察到类似的负相关。仅对5xFAD小鼠的相关分析也显示这些脑区类似的负相关（皮层r = ?0.75，海马r = ?0.81，下丘脑r = ?0.82）。这些发现表明多个脑区神经元芳香化酶表达减少与神经元胰岛素抵抗信号增加之间存在强关联，然而该关系的方向性和机制基础仍有待确定。讨论部分：本研究确定早期下丘脑芳香化酶缺失为5xFAD小鼠AD病理的一个先前未被充分认识的特征。三项主要发现：第一，芳香化酶表达在疾病进展过程中在全脑、区域和神经元水平进行性下降。第二，星形胶质细胞芳香化酶呈现双相反应，特征为早期诱导随后晚期下降。第三，下丘脑在皮层或海马检测到相应变化之前即表现出早期芳香化酶缺失和早期神经元胰岛素抵抗信号。总之，这些观察确定了AD进展过程中芳香化酶的区域及神经元/星形胶质细胞特异性改变，并强调下丘脑为AD相关代谢功能障碍的潜在早期易损部位。脑胰岛素抵抗日益被认为是AD的核心特征，并促成了AD作为"3型糖尿病"的概念。胰岛素信号受损破坏脑葡萄糖利用，并与淀粉样蛋白积累、tau病理、氧化应激和神经炎症相关。重要的是，胰岛素可维持高水平胰岛素降解酶（IDE），其在调节淀粉样β清除中起关键作用。脑胰岛素抵抗降低IDE水平，减少淀粉样β降解并加重胰岛素抵抗信号。与这些观察一致，研究人员发现所有检测脑区神经元p-IRS1S616免疫反应性进行性增加。值得注意的是，下丘脑神经元在所分析的最早疾病阶段即表现出p-IRS1S616升高，而皮层或海马直到后期阶段才观察到类似变化。这些发现提示代谢功能障碍在下丘脑可能比在AD影响的传统认知区域更早出现。越来越多证据表明雌激素调节胰岛素敏感性、促进葡萄糖利用并防止胰岛素抵抗的发展。除内分泌功能外，雌激素在脑内由芳香化酶局部合成，发挥重要的神经调质和神经保护作用。临床和实验研究日益将芳香化酶与AD发病机制联系起来。芳香化酶多态性与AD风险增加相关，死后AD脑组织中芳香化酶表达降低已有报道。此外，转基因AD小鼠中芳香化酶基因敲除导致更大的脑雌激素丢失、Aβ沉积增加和病理进展加速。与这些报道一致，研究人员观察到AD进展过程中芳香化酶表达进行性减少。重要的是，这种下降在下丘脑比在皮层或海马发生更早，确定了独特的区域易损性模式。本研究最显著的发现是确定了AD进展中的早期下丘脑芳香化酶缺失。下丘脑在能量平衡、葡萄糖稳态、内分泌调节和应激反应中起核心作用。尽管AD研究传统上聚焦于皮层和海马因其在学习记忆中的作用，但越来越多证据提示下丘脑功能障碍也可能促进疾病进展。在本研究中，芳香化酶缺失和神经元胰岛素抵抗信号均在下丘脑早于皮层或海马相应变化被检测到。这些结果通过这些脑区的时间变化和关键病理终点的直接区域比较得到验证。这些观察确定了AD进展中一个先前未被充分认识的区域差异，并提出下丘脑雌激素信号改变可能与疾病发展中的早期代谢异常相关的可能性。值得注意的是，芳香化酶缺失和神经元胰岛素抵抗信号均在下丘脑出现于皮层或海马可检测变化之前，提示下丘脑功能障碍可能代表AD相关代谢紊乱的早期组成部分。并非所有研究均报道AD中芳香化酶表达降低。例如，在AD患者海马CA4区观察到芳香化酶免疫反应性增加。这些明显差异的原因仍不清楚，但可能反映疾病阶段、分析脑区、患者人群或方法学方法的差异。有趣的是，该研究也报道了其他脑区包括下丘脑芳香化酶表达降低的证据，这与本研究发现一致。总之，这些观察提示芳香化酶改变具有区域特异性，并可能随疾病进展过程而变化。另一个发现是星形胶质细胞芳香化酶的双相调控。与先前急性脑损伤研究一致，研究人员观察到早期疾病阶段反应性星形胶质细胞芳香化酶表达增加。有趣的是，尽管星形胶质细胞激活明显，该反应在晚期阶段减弱。虽然这种下降的机制仍不清楚，但这些发现提示星形胶质细胞芳香化酶反应可能在疾病进展过程中发生变化。未来研究需要确定这种转变是否反映星形胶质细胞表型改变、局部炎症信号变化或其他适应过程。研究人员还观察到所有检测脑区神经元芳香化酶表达与神经元p-IRS1S616水平之间呈强负相关。这些发现与先前证明雌激素信号与胰岛素敏感性之间相互作用的证据一致。然而，本研究并非设计用于确立因果关系，几种解释仍然可能：芳香化酶表达减少可能导致胰岛素信号受损，胰岛素抵抗可能抑制芳香化酶表达，或两者均源于共同的下游病理过程。需要机制研究来区分这些可能性。应承认若干局限性。第一，发现产生于5xFAD模型，应在其他AD模型中验证。第二，研究为描述性，确立的是芳香化酶缺失与神经元胰岛素抵抗之间的关联而非因果关系。第三，芳香化酶表达主要通过免疫荧光评估，未来纳入转录组学、生物化学和功能学方法的研究对确定 underlying 机制将很重要。此外，WT对照小鼠仅在单一年龄评估，而非与5xFAD组年龄匹配（2、5、9月龄）。芳香化酶的年龄相关下降不能完全排除。最后，仅检测了雄性小鼠。此外，由于本研究严格聚焦于中枢神经系统病理，未评估全身代谢参数和循环激素水平（如睾酮）。鉴于雄性脑芳香化酶表达可受循环雄激素影响，未来纳入全身内分泌状态平行评估的研究对确定外周激素波动在多大程度上促成观察到的局部脑芳香化酶下降将是必要的。先前一项啮齿类动物研究提示雄性在几个下丘脑区域显示比雌性更高的基线芳香化酶活性，而人类尤其是AD脑中的类似证据仍然有限。然而，由于女性承担不成比例更高的AD临床负担，一个有趣的预测是女性下丘脑芳香化酶可能与生殖衰老和雌激素状态更强耦合，并可能在AD进展中失去代偿能力。因此，鉴于雌激素信号与AD风险之间已确立的相互作用，需要额外研究来确定女性中是否发生类似模式。结论部分翻译：研究人员使用5xFAD小鼠模型，确定了疾病进展过程中脑芳香化酶表达进行性的区域及神经元/星形胶质细胞特异性改变。芳香化酶水平在全脑和神经元水平下降，而星形胶质细胞芳香化酶呈现早期上调随后晚期下降。重要的是，下丘脑在比皮层或海马更早的疾病阶段表现出显著芳香化酶缺失和神经元胰岛素抵抗信号增加，确定了独特的区域易损性模式。神经元芳香化酶表达在所有检测区域与神经元p-IRS1S616水平呈强负相关。总之，这些发现强调早期下丘脑功能障碍为AD进展的一个特征，并支持未来研究检验脑源性雌激素信号与AD代谢受损之间的关系。