《Biology》：Functional Characterization of Purinergic Signaling in HOG Human Oligodendroglioma Cell Line: Tumor-Suppressive Role of the P2Y1 Receptor
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少突胶质细胞瘤（oligodendrogliomas）是成人中枢神经系统弥漫性低级别胶质瘤，以高复发率和有限治疗选择为特征。细胞外核苷酸信号通过嘌呤能受体（P2X和P2Y）调控多种脑肿瘤的病理生理过程；然而，其在少突胶质细胞瘤中的具体作用尚未被探索。本研究表征
少突胶质细胞瘤（oligodendrogliomas）是成人中枢神经系统弥漫性低级别胶质瘤，以高复发率和有限治疗选择为特征。细胞外核苷酸信号通过嘌呤能受体（P2X和P2Y）调控多种脑肿瘤的病理生理过程；然而，其在少突胶质细胞瘤中的具体作用尚未被探索。本研究表征了人少突胶质细胞瘤细胞系HOG中嘌呤能受体的表达谱，并评估了P2Y1受体激活对肿瘤细胞动力学的特异性影响。单细胞钙成像实验表明，细胞外ATP通过细胞外流入和内部储存动员两条途径增加细胞内钙浓度。转录和蛋白质水平的表达分析鉴定出离子型P2X4和P2X5受体，以及代谢型P2Y1、P2Y2和P2Y4受体。此外，选择性P2Y激动剂诱导的钙反应证实了P2Y1和P2Y2/P2Y4受体的功能性反应。最后，长期延时视频显微镜结合单细胞谱系追踪揭示，P2Y1激活降低了细胞增殖、延长了细胞周期持续时间、倾向于降低迁移速度并触发了细胞死亡。用选择性P2Y1拮抗剂MRS2179预孵育完全消除了这些效应。综上，研究人员的发现首次提供了HOG人少突胶质细胞瘤细胞系中存在功能性嘌呤能网络的证据，并突出P2Y1受体作为肿瘤抑制候选靶点和少突胶质细胞瘤管理的潜在治疗靶点。
**研究背景**
胶质瘤是起源于胶质前体细胞的中枢神经系统最常见的原发性恶性实体肿瘤，具有高发病率、不良预后和频繁复发的特点。根据世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类第五版（WHO 2021），成人型弥漫性胶质瘤根据特定的组织学和分子特征分为四个等级。其中，少突胶质细胞瘤（WHO 2级和3级）约占所有原发性中枢神经系统肿瘤的5%，主要影响20至40岁的年轻成人。尽管与胶质母细胞瘤相比，这些肿瘤早期临床进程较为惰性，但低级别少突胶质细胞瘤不可避免地发生恶性转化，进展为更高级别、更具侵袭性的组织学分级。目前少突胶质细胞瘤的标准治疗通常包括最大安全手术切除后辅以术后放疗。然而，少突胶质细胞瘤偏好定位于额叶，这极大限制了切除范围，因为损伤大脑关键功能区可能导致永久性神经功能缺损。这一限制增加了术后功能缺损的可能性，并对患者的神经功能和生活质量产生负面影响。在肿瘤复发的情况下，再次手术和化疗仍是主要治疗策略，但其临床有效性往往有限，长期预后不佳。这些挑战导致治疗效果和总体生存率降低，凸显了识别这些肿瘤生物学中新型分子靶点和信号通路的紧迫必要性。
近年来，由细胞外核苷酸介导的嘌呤能信号已成为中枢神经系统生理和各种病理状态的关键调节因子，包括创伤、缺血、癫痫、神经精神和情绪障碍、神经退行性疾病以及包括胶质瘤在内的癌症。在肿瘤微环境中，细胞外核苷酸通过囊泡胞吐和非囊泡途径（如连接蛋白和泛连接蛋白半通道、ABC转运蛋白和电压依赖性阴离子通道）释放。释放后，核苷酸被一系列膜结合外核苷酸酶快速降解，为各种嘌呤能受体生成动态的生理配体池。胶质瘤细胞膜上外核苷酸酶的存在早已被认识，后续研究已证明其参与肿瘤进展。这些细胞外核苷酸激活两个不同的嘌呤能P2受体家族：离子型P2X受体（钙通透性离子通道）和代谢型P2Y受体（属于G蛋白偶联受体超家族）。迄今为止，基于激动剂敏感性、序列同源性和信号转导机制，已在人类中克隆并表征了七种P2X亚基（P2X1-7）和八种P2Y受体（P2Y1,2,4,6,11-14）。所有P2X受体由P2X亚基三聚体组装而成，在ATP激活后介导钙流入，尽管亲和力、脱敏和恢复特性因亚型而异。关于P2Y受体，四种亚型由腺嘌呤核苷酸激活（P2Y1,11-13），两种仅对尿嘧啶衍生物响应（P2Y6,14），两种由腺嘌呤和尿嘧啶核苷酸共同激活（P2Y2,4）。P2Y12-14偶联Gi蛋白，而P2Y1,2,4,6,11偶联Gq/11蛋白，介导细胞内储存的钙释放和二酰甘油产生。
嘌呤能系统的失调已在星形细胞瘤和胶质母细胞瘤模型中被广泛记录。大鼠C6胶质瘤细胞系已被广泛用于研究胶质瘤生物学，据报道其释放ATP并表达多种P2Y受体亚型，如P2Y1、P2Y2和P2Y12，被认为影响其增殖和分化。此外，P2X4和P2X7受体也在该细胞系中表达，可能参与细胞死亡机制。而且，ATP已被证明可诱导C6胶质瘤细胞产生趋化因子，可能增强细胞运动性并促进小胶质细胞募集至肿瘤微环境，这些过程可能支持肿瘤进展。值得注意的是，替莫唑胺（一种用于治疗原发性和复发性高级别胶质瘤的DNA烷化剂）已被报道可在U251胶质瘤细胞中触发与自噬相关的ATP激增，这种反应似乎赋予细胞保护作用，可能构成治疗耐药的基础机制。此外，肌肽已被证明可抑制人恶性胶质瘤来源细胞的增殖，最新发现表明其可抑制患者来源胶质瘤样本和T98G人胶质瘤细胞系中的ATP产生。
尽管胶质瘤中描述的许多机制可能广泛适用于少突胶质细胞瘤或可作为推断性假设，但目前尚无专门且独家针对少突胶质细胞瘤与嘌呤能系统关系的实验研究。为填补这一关键知识空白，本研究旨在系统表征人少突胶质细胞瘤（HOG）细胞系中功能性P2X和P2Y嘌呤能受体的表达谱。
**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：使用Fura-2 AM钙指示剂进行单细胞钙成像实验，检测ATP及选择性嘌呤能激动剂诱导的细胞内钙浓度变化；通过逆转录结合定量实时PCR（qPCR）分析嘌呤能受体亚型的mRNA表达水平；采用Western blotting检测受体蛋白表达；利用免疫细胞化学结合共聚焦显微镜观察受体的亚细胞定位；使用长期延时视频显微镜结合单细胞谱系追踪技术（tTt软件）监测细胞增殖、迁移和死亡动态；通过Ki-67免疫荧光染色评估细胞增殖；采用LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒检测细胞存活率。研究使用的人少突胶质细胞瘤HOG细胞系购自Sigma-Aldrich（cat. no. SCC163），来源于手术切除的人少突胶质细胞瘤建立的单细胞克隆。
**研究结果**
**3.1 HOG细胞中功能性嘌呤能受体的表征**
通过分析ATP诱导的细胞内游离钙浓度（[Ca2+]i）变化，研究人员对HOG细胞中嘌呤能受体进行了功能表征。HOG细胞在盖玻片上培养24小时后加载Fura-2 AM，置于灌流室中在倒置显微镜下进行单细胞水平监测。结果显示，1 μM ATP即足以引发稳健的钙反应，10 μM ATP达到最大反应，因此选择该浓度用于后续所有实验。为确定细胞内钙升高的来源，研究人员使用10 μM 2-APB（肌醇三磷酸（IP3）受体抑制剂，介导内质网钙释放）处理HOG细胞。结果显示，2-APB显著减弱但未完全消除10 μM ATP诱导的钙反应，表明ATP诱导的[Ca2+]i升高既依赖细胞外钙流入，也依赖细胞内储存的动员。这些发现提示离子型P2X和代谢型P2Y受体均参与HOG细胞中ATP介导的钙反应。
**3.2 HOG细胞中嘌呤能P2X受体的鉴定**
为表征HOG细胞中离子型P2X受体的表达谱，研究人员分析了所有已知P2X亚基的mRNA和蛋白质水平。逆转录结合qPCR显示，P2X4和P2X5转录本表达最丰富，而P2X1、P2X2、P2X3、P2X6和P2X7的mRNA几乎检测不到。Western blot分析使用亚基特异性抗体证实了P2X4和P2X5蛋白在HOG细胞中的稳健表达。根据UniProtKB预测，非糖基化和糖基化P2X4蛋白的预期分子量分别为40-45 kDa和43-55 kDa，P2X5分别为44-47 kDa和49-54 kDa。在本研究中，P2X4迁移至约44 kDa，P2X5迁移至约47-49 kDa，与其非糖基化经典形式一致。值得注意的是，P2X7受体（约69 kDa）在mRNA和蛋白质水平均检测不到。免疫细胞化学进一步证实了P2X4和P2X5受体的存在，免疫染色主要定位于细胞质（特别是核周区域）和质膜。由于缺乏P2X4和P2X5的选择性激动剂，其功能贡献通过2-APB存在下记录的ATP诱导钙反应间接推断。
**3.3 HOG细胞中嘌呤能P2Y受体的鉴定**
为鉴定HOG细胞中表达的代谢型嘌呤能受体，研究人员首先通过qPCR评估了P2Y受体亚型的转录水平。发现HOG细胞主要表达P2Y1和P2Y2受体转录本，二者均编码Gq/11偶联受体，激活后动员细胞内钙。还检测到少量P2Y4和P2Y12转录本，而P2Y6、P2Y10、P2Y11、P2Y13和P2Y14转录本未检测到。Western blot分析证实了P2Y1和P2Y2蛋白在HOG细胞中的表达。根据UniProtKB预测，这些受体的非糖基化形式预期迁移至约41 kDa，糖基化变体在42-47 kDa之间。与这些值一致，Western blot分析显示P2Y1和P2Y2条带在约41 kDa处，以及一个额外的显著P2Y1条带在约44 kDa处，可能对应糖基化状态。尽管转录信号较弱，P2Y4蛋白也通过Western blot检测到，出现在预期的约41 kDa条带处。值得注意的是，尽管P2Y12受体在高级别胶质瘤中被广泛认为促进细胞增殖和小胶质细胞募集，但在HOG少突胶质细胞瘤细胞系中仅检测到低水平的P2Y12 mRNA，而P2Y12蛋白（约39 kDa）未检测到。免疫细胞化学证实了P2Y1、P2Y2和P2Y4受体在HOG细胞中的存在，显示其亚细胞分布跨越细胞质和质膜。为评估受体功能性，研究人员在加载Fura-2 AM的HOG细胞中进行钙成像。细胞暴露于10 μM 2MeSADP（一种强效选择性P2Y1受体激动剂）。结果显示，2MeSADP刺激诱导了[Ca2+]i的稳健升高，尽管该瞬变小于10 μM ATP触发的反应（后者兼有离子型和代谢型成分贡献）。此外，用10 μM Up4U或UTP（均为P2Y2/P2Y4受体激动剂）刺激的细胞也表现出[Ca2+]i升高，幅度低于2MeSADP诱导的反应。这些结果证实了HOG细胞中功能性P2Y1、P2Y2和P2Y4受体的表达，其中P2Y1亚型作为代谢型钙反应的主要介导者。
**3.4 P2Y1受体调控HOG细胞的增殖能力、迁移行为和存活**
通过P2Y1受体的嘌呤能信号主要被表征为肿瘤进展、侵袭性表型和微环境重塑的驱动因素，尤其在星形细胞瘤和胶质母细胞瘤模型中。为研究P2Y1受体激活对调控HOG细胞动力学的作用，研究人员进行了延时视频显微镜和单细胞追踪，监测72小时内增殖、迁移和细胞死亡的变化。HOG细胞在补充2% FBS的完全DMEM中培养，分为未处理组或暴露于P2Y1选择性激动剂2MeSADP（10 μM），联合或不联合选择性拮抗剂MRS2179（10 μM）。每5分钟采集图像，通过单细胞追踪生成展示HOG细胞及其子代动态的谱系树。对HOG细胞谱系进展的定量分析显示，使用选择性P2Y1受体激动剂2MeSADP处理后，增殖能力（以每个分析谱系树内的平均细胞分裂次数衡量）显著降低。此外，当HOG细胞用选择性P2Y1受体拮抗剂MRS2179预孵育时，这种降低被完全逆转，MRS2179显著增加了增殖至对照水平以上。这些药理学效应通过Ki-67免疫染色（一种公认的细胞增殖标志物）进一步验证。此外，这种抗增殖机制似乎依赖于P2Y1介导的细胞内钙动员，因为用IP3受体拮抗剂2-APB预处理完全阻断了2MeSADP的抗增殖效应。与这些发现一致，细胞周期长度分析显示2MeSADP处理增加了细胞周期持续时间，尽管该效应未达到统计学显著性。这一趋势被MRS2179预处理显著逆转，进一步支持P2Y1受体信号在调控HOG细胞增殖中的作用。接下来，评估了P2Y1受体激活对HOG细胞迁移能力的影响，因为增强的迁移行为与增加的肿瘤侵袭性广泛相关。2MeSADP处理降低了HOG细胞的迁移速度，而MRS2179部分抵消了这一降低。然而，两种效应均未达到统计学显著性。最后，研究人员通过量化活细胞成像期间的细胞死亡百分比来研究P2Y1受体激活对HOG细胞活力的影响。结果显示，在对照培养条件下细胞死亡是罕见事件。相反，用2MeSADP激活P2Y1受体显著增加了整个活细胞成像实验中发生细胞死亡的HOG细胞比例。这一效应被MRS2179预处理完全逆转，进一步支持P2Y1受体介导反应的特异性。为验证这一观察，研究人员使用calcein-AM和乙锭均二聚体-1（EthD-1）进行LIVE/DEAD实验，量化2MeSADP处理后HOG死细胞的百分比。结果显示，P2Y1激动剂处理显著增加了EthD-1阳性细胞的百分比，证实P2Y1受体激活损害了培养HOG细胞的活力。与活细胞成像结果一致，MRS2179预处理成功挽救了2MeSADP诱导的细胞毒性。然而，当试图阻断细胞内钙释放时，2-APB预处理单独即诱导了与对照细胞相比显著的基线下细胞死亡增加。由于这种内在毒性，后续应用2MeSADP未能进一步加剧细胞毒性，妨碍了在该特定活力实验中清晰评估钙信号参与。综上，这些发现表明P2Y1受体激活对HOG细胞体外发挥多种抗肿瘤效应，包括降低增殖能力、倾向于减少迁移行为和降低细胞活力，支持P2Y1受体信号作为人少突胶质细胞瘤细胞治疗靶点的潜力。
**讨论与结论**
嘌呤能信号系统已成为脑肿瘤病理生理学的关键调节因子，调控神经细胞增殖、分化、细胞死亡和肿瘤微环境重塑。尽管大量文献涉及胶质母细胞瘤和星形细胞模型中的ATP介导信号，但其在少突胶质细胞瘤中的作用迄今尚未被探索。据研究人员所知，本研究首次系统表征了人少突胶质细胞瘤体外模型中的功能性嘌呤能受体，证明选择性激活P2Y1受体通过抑制细胞增殖、减缓迁移和诱导细胞死亡发挥强效抗肿瘤效应。
研究人员的发现表明，HOG人少突胶质细胞瘤细胞系表达一个独特的嘌呤能受体子集，包括离子型P2X4和P2X5，以及代谢型P2Y1、P2Y2和P2Y4受体。钙成像实验揭示，细胞外ATP通过双重机制引发细胞内钙浓度的瞬态升高：通过离子型P2X通道的细胞外Ca2+流入和通过G蛋白偶联P2Y受体的细胞内储存Ca2+动员，后者由对IP3受体拮抗剂2-APB的部分敏感性所证实。与高级别星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中P2X7表达经常升高并与侵袭性表型、神经炎症和凋亡抵抗相关不同，HOG细胞在mRNA和蛋白质水平均未检测到P2X7表达。值得注意的是，P2X7与P2X4受体具有最高程度的相似性，是氨基酸序列、染色体定位和组织分布重叠方面最密切相关的两个P2X亚基。来自肺泡细胞系的证据表明，P2X4和P2X7受体经历相互交叉调控，其中P2X7敲低上调P2X4表达，而P2X4耗竭反过来增加P2X7水平。鉴于P2X4对ATP的亲和力显著高于P2X7，HOG细胞中P2X4受体的显著表达可能反映了少突胶质细胞瘤中的有利功能适应。
另一方面，P2Y12受体在HOG细胞中未表达，尽管其在高级别胶质瘤中经常涉及胶质瘤细胞增殖和小胶质细胞募集。因此，P2Y1和P2Y2受体的高丰度很可能使这些代谢型亚型成为少突胶质细胞瘤细胞中腺嘌呤和尿嘧啶核苷酸反应的主要介导者。P2Y1受体在胶质瘤中的作用历史上产生了复杂且背景依赖性的结果。在星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中，P2Y1依赖性信号主要与促肿瘤效应相关，包括刺激细胞增殖、诱导趋化因子分泌导致小胶质细胞趋化以及促进细胞运动。相反，研究人员的研究表明，人少突胶质细胞瘤细胞中P2Y1受体激活介导了显著有益的肿瘤抑制表型。用选择性P2Y1激动剂2MeSADP刺激显著降低了追踪细胞谱系中的平均细胞分裂次数，并诱导了细胞周期延长的趋势。此外，P2Y1激活增加了细胞死亡并倾向于降低平均迁移速度，表明弥漫性胶质瘤进展通常相关的侵袭潜能减弱。关键的是，2MeSADP的所有观察到的抑制性作用均被MRS2179预处理完全挽救。
尽管有这些有希望的发现，本研究存在某些值得考虑的局限性。主要的是，研究人员的实验方法依赖于HOG细胞系体外模型。虽然这为这些受体的初步功能表征提供了稳健且明确的系统，但其本质上缺乏体内发现的复杂细胞异质性和完整肿瘤微环境。因此，未来研究必须旨在验证这种独特的嘌呤能表达谱，特别是P2X7的缺失和P2Y1的治疗脆弱性，在不同少突胶质细胞瘤细胞系、原代患者来源少突胶质细胞瘤培养物和体内原位异种移植模型中。此外，虽然研究人员已确定P2Y1激活的功能表型后果，但介导观察到的细胞增殖减少、迁移减弱和细胞死亡诱导的精确下游细胞内信号级联仍有待完全阐明。未来研究详述这些特定分子通路，以及探索P2Y1靶向治疗与标准化放疗方案联合的潜在协同效应，将是将这些基础性见解转化为少突胶质细胞瘤患者可行临床策略的关键步骤。
**结论翻译**
总之，研究人员的发现确立了HOG人少突胶质细胞瘤细胞系具有功能性嘌呤能受体机制，并突出P2Y1受体作为少突胶质细胞瘤中有吸引力的药物治疗靶点。与经典高级别胶质瘤（其中P2Y1抑制可能是限制迁移的期望策略）不同，HOG细胞似乎对P2Y1激活敏感，后者直接发挥作用限制扩增并触发细胞死亡。
