ssDNA结合蛋白MEIOB通过稳定男性减数分裂过程中的重组中间体来维持联会复合体的完整性

《iScience》：The ssDNA-binding protein MEIOB sustains synaptonemal complex integrity by stabilizing recombination intermediates during male meiosis

　　亮点
• 在小鼠中诱导Meiob基因敲除会导致pachynema阶段的染色质过早解体
• MEIOB与减数分裂染色体轴上的ZZS成分SPO16相互作用
• SPO16的缺失会模仿MeiobcKO敲除后的解联现象，并减少MEIOB–SPATA22复合体在染色体轴上的分布

摘要
减数连丝复合体（SC）对于同源染色体之间的减数重组和交叉形成至关重要。在酵母中，SC由ZZS复合体（Zip2-Zip4-Spo16）组装和维持。然而，ZZS成分是如何被招募并稳定在染色体上的，以及它们的哺乳动物同源物（SHOC1-TEX11-SPO16）是否发挥类似的作用，目前仍知之甚少。在这里，我们报道了在小鼠中特异性敲除减数分裂特异性的单链DNA结合蛋白MEIOB会导致早期pachytene阶段的染色体解联，从而导致这些细胞在中期pachytene之前被清除。从机制上看，MEIOB在体外与SPO16相互作用，而Spo16缺陷的pachytene样精子细胞表现出类似的过早解联现象，并且MEIOB复合体在染色体轴上的分布显著减少。此外，在Meiob敲除的pachytene精子细胞中，另一个ZZS成分TEX11的招募到重组中间体的过程也明显减弱。总的来说，我们的发现表明MEIOB-SPATA22复合体可能与SPO16共同作用，以支持哺乳动物减数分裂过程中的SC完整性和交叉形成。

图形摘要

引言
减数重组是减数分裂I前期的一个必要过程。这一过程依赖于减数连丝复合体（SC）的形成，这是一种连接同源染色体的类似拉链的聚合物结构，在不同物种中具有进化保守性。在小鼠中，SC的组装和维持依赖于ZZS复合体（Zip2-Zip4-Spo16）。然而，ZZS成分是如何被招募并稳定在染色体上的，以及它们的哺乳动物同源物（SHOC1-TEX11-SPO16）是否具有相似的功能，目前仍不甚清楚。本研究通过特异性敲除减数分裂特异性的单链DNA结合蛋白MEIOB，发现这会导致早期pachytene阶段的染色体解联，从而使得这些细胞在中期pachytene之前被清除。机制上，MEIOB在体外与SPO16相互作用，而Spo16缺陷的pachytene样精子细胞表现出类似的过早解联现象，并且MEIOB复合体在染色体轴上的分布显著减少。此外，在Meiob敲除的pachytene精子细胞中，另一个ZZS成分TEX11的招募到重组中间体的过程也明显减弱。这些发现表明，MEIOB-SPATA22复合体可能与SPO16合作，以支持哺乳动物减数分裂过程中的SC完整性和交叉形成。

引言（续）
减数重组是减数分裂I前期的一个必要过程。这一过程依赖于减数连丝复合体（SC）的形成，这是一种连接同源染色体的类似拉链的聚合物结构，在不同物种中具有进化保守性。在小鼠中，SC的组装和维持依赖于ZZS复合体（Zip2-Zip4-Spo16）。然而，ZZS成分是如何被招募并稳定在染色体上的，以及它们的哺乳动物同源物（SHOC1-TEX11-SPO16）是否具有相似的功能，目前仍不甚清楚。最近的研究表明，至少有八种ZMM蛋白（包括Zip1/2/3/4、Mer3、Msh4/5和Spo16）参与了这一过程。在出芽酵母中的研究显示，Holliday连接（HJs）的特异性切割和ZMM蛋白的条件性降解都会导致SC的快速解体，这强调了ZMM蛋白在SC聚合和维持中的关键作用。Zip2、Zip4和Spo16形成一个称为ZZS的功能性亚复合体，而在小鼠中敲除它们的哺乳动物同源物（SHOC1、TEX11和SPO16）会导致SC稳定性缺陷，从而导致男性不育。MEIOB是一种具有寡核苷酸结合（OB）结构域的减数分裂特异性蛋白，它与其结合伙伴SPATA22形成稳定的异二聚体复合体，并结合单链DNA（ssDNA）。先前的研究已经表明，MEIOB通过促进重组酶RAD51和DMC1在减数分裂早期阶段的招募来参与DSB修复。DSB修复有助于同源性搜索并促进SC和早期重组中间体的形成。此外，分析模仿一名无精症患者杂合突变的小鼠模型发现，MEIOB在减数重组中起剂量依赖性的调控作用。然而，MEIOB调控交叉的具体机制仍不清楚。

本研究创建了一个针对生殖细胞的条件性MEiob基因敲除小鼠模型（MeiobcKO）。通过研究这一模型，我们发现与之前报道的整体敲除模型不同，后者由于减数重组和同源联结缺陷而早期停止发育，我们的可诱导MeiobcKO模型揭示了MEIOB在后期阶段的新功能。尽管SC的初步组装已经完成，但MEIOB的缺失会导致pachynema阶段的染色体过早解联和SC的不稳定。这一功能可能是通过一种尚未被描述的MEIOB-SPO16相互作用来调节的，该相互作用在早期重组中间体中稳定了ZZS复合体。这些发现表明，MEIOB在维持pachytene精子细胞中SC的结构完整性方面起着关键作用。因此，我们的研究表明，MEIOB-SPATA22复合体可能在哺乳动物减数分裂过程中充当连接HJs和ZZS复合体的关键纽带。

结果
为了进一步研究MEIOB在男性减数分裂中的作用，我们创建了Meiobfl/fl; Ddx4-CreERT2小鼠模型，其中功能性MEIBO在tamoxifen诱导下会在生殖细胞中被消除（图1A和S1A）。我们首先在PD14和PD15时给这些小鼠注射两次tamoxifen（20 mg/kg），然后在处理后的不同天数收集睾丸样本（图1B），这些样本被称为Meiob条件性敲除（MeiobcKO）睾丸。Meiobfl/fl窝仔小鼠作为对照组。在7 dpt和10 dpt时，MeiobcKO小鼠的睾丸明显比对照组小鼠小（图1B）。基因分型和免疫荧光分析证实了Meiob基因的敲除以及6 dpt时MeiobcKO zygotene样和pachytene样精子细胞核中MEIOB蛋白的完全缺失（图1C和S1B）。同样，MEIOB的结合伙伴SPATA22也从MeiobcKO精子细胞中消失（图S1C）。这些结果表明我们成功获得了MeiobcKO精子细胞。

图1 MeiobcKO小鼠在pachytene精子细胞中表现出异常的凋亡现象
(A) Meiobfloxed等位基因的小鼠基因示意图，其中两个loxP位点被插入到第6和第10个内含子中。tamoxifen诱导的Ddx4-CreERT2策略用于敲除Meiob；蓝色箭头表示连续两天每天注射tamoxifen的时间点PD14和PD15。
(B) 不同时间点注射tamoxifen后小鼠睾丸形态的比较。比例尺，2 mm。
(C) 对照组和MeiobcKO小鼠精子细胞染色体涂片中的MEIOB（绿色）和SYCP3（红色）进行免疫染色。比例尺，5 μm。
(D) 注射tamoxifen后不同时间点小鼠睾丸的组织学分析。红色箭头表示凋亡的pachytene精子细胞；星号表示pachytene或diplotene精子细胞的缺失。L/Z表示Leptotene/Zygotene；P表示Pachytene；D表示Diplotene。比例尺，50 μm。
(E) 对照组和MeiobcKO小鼠睾丸切片中c-PARP（绿色，凋亡标志物）和γH2AX（红色，减数分裂分期标志物）的共免疫染色。DNA用DAPI（蓝色）染色。比例尺，50 μm。
(F) 每个管状结构的c-PARP阳性细胞数量。每个性别的平均值基于三个个体的数据计算。每个小鼠至少计数了30个管状结构。数据显示为平均值±标准差。**??p < 0.01，双因素ANOVA。
(G) 为了精确确定这些死亡细胞的减数分裂阶段，我们利用不同的γH2AX定位模式将生精小管分类为Leptotene/Zygotene（Lep/Zyg）和Pachytene/Diplotene（Pac/Dip）阶段。对具有不同γH2AX模式的管状结构中的c-PARP+细胞进行定量分析。数据代表每个性别的三个个体的平均值，每个小鼠至少分析了30个管状结构。数据显示为平均值±标准差。**???p < 0.001，双因素ANOVA。

敲除Meiob会导致小鼠pachytene精子细胞凋亡
对MeiobcKO睾丸的组织学分析显示，在5 dpt时，特征为粗大、粗糙染色质丝的pachytene精子细胞开始发生凋亡（图1D，红色箭头）。到7 dpt时，这些pachytene细胞显著减少，多个生精小管中的晚期精子细胞缺失（图1D，星号）。结果，在10 dpt时，多个生精小管中缺乏精子细胞或只含有zygotene精子细胞（图1D）。
对6 dpt睾丸切片进行γH2AX和c-PARP（cleaved poly ADP ribose polymerase，凋亡标志物）免疫染色后，发现MeiobcKO生精小管中的c-PARP阳性细胞显著增加，包括许多pachytene阶段的管状结构（图1E和1F）。定量分析进一步显示，尽管在Lep/Zyg阶段的管状结构中仅观察到轻微的凋亡增加，但在MeiobcKO小鼠的Pac/Dip阶段的管状结构中c-PARP阳性细胞显著积累（图1G）。这些发现表明，MEIOB可能在减数分裂I前期的后期阶段发挥重要作用。

MeiobcKO pachytene精子细胞表现出过早的SC解体
我们通过用SC横向纤维SYCP1和侧向元素SYCP3免疫染色来研究MeiobcKO精子细胞中的同源联结情况。如图2A所示，MeiobcKO睾丸的涂片中观察到两种类型的pachytene样精子细胞，而在对照睾丸中这两种细胞都不存在。Pachytene样1精子细胞在同源染色体的联结区域显示出强烈的SYCP1信号（图2A，箭头）。相比之下，Pachytene样2精子细胞在许多同源染色体上的SYCP1信号显著减少且不连续（图2A，箭头）。

图2 MeiobcKO pachytene精子细胞表现出联结缺陷
(A) 对照组和MeiobcKO小鼠精子细胞染色体涂片中的SYCP1（绿色）和SYCP3（红色）进行免疫染色。基于每个性别3只小鼠的892个对照和860个MeiobcKO精子细胞的定量分析，显示不同类型精子细胞的平均百分比（平均值±标准差），双因素ANOVA。
(B) 对照组和MeiobcKO小鼠精子细胞的代表性涂片，同时染色SIX6OS1（绿色）和SYCP3（红色）。比例尺，5 μm。下方显示了框选染色体的放大视图。
(C) 对照组和MeiobcKO小鼠精子细胞的代表性涂片，同时染色TEX12（绿色）和SYCP3（红色）。比例尺，5 μm。下方显示了框选染色体的放大视图。
(D) 对MeiobcKO D-pachytene精子细胞中联结缺陷的定量分析。图表显示了表现出联结、非联结或解体染色体的细胞百分比。总共分析了三只MeiobcKO小鼠的59个D-pachytene精子细胞。数据显示为平均值±标准差。

通过免疫染色SIX6OS1和TEX12（SC中心元素的两个关键成分），我们发现MeiobcKO pachytene样2精子细胞在染色体轴上的SIX6OS1和TEX12信号减弱（图2B和2C）。我们还注意到，一些常染色体二倍体在同源区域显示出不连续的SIX6OS1和TEX12信号（图2B和2C，箭头）。定量分析显示，在MeiobcKO pachytene样2精子细胞中，超过50%的常染色体二倍体出现这种联结缺陷（图2D）。通过根据染色体联结缺陷对MeiobcKO pachytene精子细胞进行分类，我们发现大多数（约60.8%）的MeiobcKO pachytene样精子细胞表现出性染色体分离（图S2A和S2B）。这些结果表明，MeiobcKO pachytene样2精子细胞的SC稳定性受损。在后续分析中，我们将这类pachytene样精子称为“D-pachytene”。

为了检查MeiobcKO后期观察到的严重异常二倍体是否曾经完成了正常的SC组装，我们评估了HORMAD1和BRCA1的定位动态，这两种蛋白是未联结染色体轴的已知标记物。HORMAD1在未联结的染色体轴上积累，并在同源联结发生时迅速被清除，而BRCA1特异性地定位在zygonema阶段的未联结染色体轴上。在MeiobcKO zygotene样和pachytene样1精子细胞中，HORMAD1和BRCA1均正常地定位在未联结的染色体轴上（图3A和3B）。此外，这两种蛋白在MeiobcKO pachytene样精子细胞的联结染色区域中也有效清除，与对照pachytene细胞类似。这些观察表明，在MeiobcKO精子细胞的早期阶段，SC组装可能正常进行。

图3 MeiobcKO小鼠在pachytene样II精子细胞中表现出过早的SC解体
(A) 对照组和MeiobcKO小鼠精子细胞中的BRCA1（绿色）和SYCP3（红色）进行免疫染色。比例尺，5 μm。
(B) 对照组和MeiobcKO小鼠精子细胞中的HORMAD1（绿色）和SYCP3（红色）进行免疫染色。框内区域的放大视图显示了常染色体。
(C) 对照组和MeiobcKO小鼠精子细胞中的γH2AX（绿色）和SYCP3（红色）进行免疫染色。框内区域的放大视图显示了右侧的常染色体。比例尺，5 μm。
(D) 对照组和MeiobcKO小鼠精子细胞同时染色H1T（绿色）和SYCP3（红色）的代表性涂片。框内区域的放大视图显示了常染色体。比例尺，5 μm。
我们发现，在MeiobcKO D-pachytene精子细胞中，HORMAD1信号不仅从联结的染色体上消失，也从表现出联结缺陷的异常二倍体上消失（图3B）。类似地，这些异常的MeiobcKO D-pachytene精子细胞在常染色体上缺乏BRCA1信号，类似于野生型pachytene精子细胞中观察到的完全联结的常染色体（图3A和3B）。这些发现表明，Meiob的敲除可能导致同源二倍体在pachytene阶段的过早解体，而不是SC组装缺陷。值得注意的是，这种过早解体可能会改变染色体状态，从而阻止HORMAD1重新加载到解体的染色体上，这通常发生在diplotene阶段。
通过免疫染色γH2AX（DNA损伤标志物），我们发现与野生型pachytene精子细胞相比，其中γH2AX信号仅聚集在性染色体区域，MeiobcKO D-pachytene精子细胞在常染色体上保留了异常的γH2AX信号，尤其是在那些SC过早解体的二倍体上（图3C）。为了进一步分析D-pachytene精子细胞的减数分裂进程，我们对染色体涂片进行了H1T（中期至晚期pachytene标志物）的免疫染色。研究结果表明，MeiobcKO D-粗线期精母细胞呈H1T阴性，这表明D-粗线期精母细胞可能无法通过粗线期中期检查点，从而导致凋亡（图3D）。MEIOB可能与SPO16相互作用，以防止粗线期精母细胞中的提前解联。SPO16与TEX11和SHOC1一起构成了哺乳动物的ZZS复合体。先前的研究表明，SPO16对小鼠的染色单体（SC）稳定性是必需的，这提示ZZS复合体可能在调节SC完整性方面发挥作用。鉴于MEIOB的缺失会导致提前解联，我们研究了MEIOB是否与ZZS复合体的成分相互作用。为此，我们在转染了pcDNA3.1(+)-3×HA-Meiob-GFP、pCAG-3×FLAG-Spo16-GFP、pcDNA3.1(+)-3×FLAG-Shoc1-GFP或pcDNA3.1(+)-3×FLAG-Tex11-GFP质粒的HEK293T细胞中进行了共免疫沉淀（Co-IP）实验。结果显示，在测试条件下，MEIOB与SPO16相关，但与SHOC1或TEX11无关（图4A–4C）。对细胞裂解物进行DN酶处理并没有破坏MEIOB-SPO16的结合（图S3），这表明这种结合不是由DNA介导的。由于SPO16对小鼠的SC稳定性是必需的，这些发现提示MEIOB可能在减数分裂过程中与SPO16合作，共同维持SC的完整性。

接下来，我们使用过表达FLAG-Spo16质粒的睾丸对HEK293T细胞进行电穿孔处理，然后检查了MEIOB与SPO16在精母细胞染色体 spreading中的空间关系。 triple免疫染色显示，在晚期合子体期精母细胞中，超过60%的MEIOB和SPO16焦点重叠（图4D）。从合子丝期到粗线期，尽管MEIOB焦点数量显著减少，但SPO16焦点数量保持稳定（图4E），而MEIOB焦点与SPO16焦点之间的重叠比例则从合子丝期到粗线期明显下降至45%（图4F）。这些观察结果表明，MEIOB和SPO16可能在减数分裂前期协同作用，其中MEIOB比SPO16更早从染色体位点解离。我们还观察到，Spo16敲除（Spo16?/?）睾丸中也含有D-粗线期精母细胞，这些细胞在许多常染色体双线体中表现出提前解联，并且HORMAD1的清除正常（图S4）。与我们的MeiobcKO模型类似，这些Spo16?/? D-粗线期精母细胞也呈H1T阴性，并且无法进展到早期粗线期（图S5）。由于Western blot和荧光分析表明MEIOB在精母细胞中与SPO16高度相关，我们推测MEIOB功能的缺失可能是导致Spo16?/? D-粗线期精母细胞提前解联的原因之一。因此，我们量化了Spo16?/?精母细胞中的MEIOB定位情况，发现其数量显著减少（图4G和4H）。同样，突变精母细胞在合子丝期和D-粗线期阶段的SPATA22也显著减少（图S6A和S6B）。这些发现表明，SPO16对于减数分裂前期MEIOB-SPATA22复合体的正确染色体积累是必需的。MEIOB的缺失可能会影响粗线期精母细胞中交叉形成的过程。

讨论
两项开创性研究揭示了单链DNA结合蛋白MEIOB在调节减数重组酶招募到染色体轴上以修复DSB和促进重组中的关键作用。后来，在MEIOB蛋白不稳定的小鼠品系中，发现了MEIOB对中期粗线期精母细胞中交叉形成的潜在影响。在这项研究中，我们创建了一个他莫昔芬诱导的Meiob条件性敲除（MeiobcKO）小鼠品系，并发现MEIOB在早期粗线期精母细胞中的缺失会导致SC过早解体，从而导致在粗线期中期之前的停滞。进一步分析证实了MEIOB与SPO16在体内外都具有关联。因此，MEIOB-SPO16相互作用可能在维持粗线期精母细胞中的SC结构完整性、促进交叉形成中起着关键作用。

在我们的MeiobcKO小鼠中，观察到染色单体连接缺陷，伴随TEX12信号分散和TEX11焦点显著减少。这种TEX11信号的减少比在常染色体敲除小鼠中报告的更为严重，这可能反映了抗体敏感性和敲除策略的差异。值得注意的是，这一观察结果与之前的一项研究一致，该研究报道了由Meiob错义突变引起的剂量敏感性重组缺陷。在酵母中，SC中心元件蛋白Ecm11与Zip4（哺乳动物TEX11的直系同源物）之间的相互作用充当了交叉形成与SC组装之间的物理连接，这种相互作用可能在哺乳动物中是进化保守的。我们的发现表明，MEIOB在维持减数分裂期间TEX11和TEX12的正确定位中起着重要作用，这可能有助于交叉形成和SC的完整性。在小鼠中，粗线期的提前解联通常会导致从前期中期到中期初期的过渡缺陷。MeiobcKO精母细胞在早期粗线期表现出提前解联，并且无法进展到中期粗线期，这可能是由于缺乏MEIOB导致重组功能受损。然而，来自Spo16?/?和MeiobcKO小鼠的精母细胞都表现出HORMAD1和BRCA1蛋白从常染色体轴上的类似消失，从而证实了本研究中观察到的现象确实是提前解联。尽管如此，我们不能完全排除SC组装的微小缺陷对观察到的表型的影响，因为SC组装和维持之间存在密切关系。需要进一步的研究，包括在同步小鼠模型中的详细时间过程分析，来区分这些可能性。

两个研究小组独立地报道，在出芽酵母中，dHJs与ZMM蛋白之间的物理相互作用对于维持SC稳定性、协调减数分裂进程和确保交叉形成至关重要。在这项研究中，我们发现了MEIOB在保持SC结构完整性中的关键作用，这可能是通过MEIOB与ZMM蛋白家族的关键成员SPO16之间的相互作用来实现的。这一发现意味着酵母中的dHJs与ZMM蛋白之间的相互作用机制可能在小鼠中也得以保留。尽管MEIOB不直接与TEX11相互作用，但我们的发现证实了MEIOB与SPO16之间的功能依赖性。我们提出，MEIOB与SPO16之间的功能关联支持TEX11的有效招募和随后的交叉形成（图6）。MEIOB-SPATA22复合体通过RPA与单链DNA结合，而MEIOB与SPO16相互作用促进TEX11招募到重组中间体，从而增强dHJs的形成。在早期粗线期精母细胞中，MEIOB的缺失会导致ZZS复合体稳定性降低，无法维持SC结构，最终导致SC过早解体和交叉显著减少。总之，我们的结果揭示了MEIOB在维持SC完整性和促进减数分裂交叉形成中的作用。这一功能可能是通过MEIOB与SPO16的直接相互作用来实现的。因此，我们提出MEIOB可能作为桥梁，介导HJs与ZZS复合体之间的关联，从而促进交叉形成并维持SC结构完整性。深入理解MEIOB与其他减数分裂蛋白的相互作用及其在特定分子机制中的功能将有助于进一步了解减数分裂重组的调节机制。

研究的局限性
虽然我们的发现强调了MEIOB在维持减数分裂期间SC稳定性中的重要作用，但由于缺乏高质量的特异性抗体，仍然无法精确描述内源性SPO16的体内定位和动态。此外，尽管通过体外和电穿孔方法验证了MEIOB-SPO16相互作用，但它们在生理条件下的确切分子机制和与其他减数分裂因子的相互作用细节仍需进一步研究。最终，本研究仅限于雄性减数分裂过程，Spo16是否在雌性减数分裂中同样与MEIOB合作以维持精子细胞的完整性仍有待验证。

**资源可用性**
如需进一步的信息或请求获取相关资源和试剂，请联系负责人Dongteng Liu（[e-mail]），他将为您提供帮助。

**材料可用性**
本研究生成的所有独特材料均可根据需求提供给负责人。

**数据和代码可用性**
- **数据**：本文报告的数据将由负责人根据请求提供。
- **代码**：本研究未包含新生成的代码。
- **其他信息**：如需重复本文中报告的数据所需的任何支持性文档，也可向负责人咨询。

**致谢**
本研究得到了深圳-香港-澳门C类项目（SGDX20230821091501011）、中国深圳市科学技术计划（项目编号KQTD20190929172749226）、深圳市医学三项工程（SZSM202211009）、上海市浦江计划（项目编号23PJ1410300）、湖北医科大学的师资发展资助（2025QDJZR01）以及深圳市基础研究计划（项目编号JCYJ20220530154805013）的支持。我们感谢香港大学深圳医院核心实验室在共聚焦显微镜技术方面提供的支持。

**作者贡献**
H.F.：概念设计、研究方法、实验实施、初稿撰写及修订；
B.J.：研究方法、实验实施、初稿撰写；
Y.G.：研究方法、实验实施、修订；
M.Z.：修订；
L.H.：实验实施；
H.W.：实验实施；
X.W.：实验实施；
M.L.：资金筹集；
M.L.：研究方法、资源准备；
J.S.：资金筹集、修订；
L.H.：监督、资金筹集、修订；
D.L.：概念设计、研究设计、监督、实验实施、初稿撰写及修订。

**利益声明**
作者声明不存在利益冲突。

**STAR?**
**关键资源表格**

| 类别 | 材料名称 | 来源 | 标识符 |
|---------|---------------------------|--------------|-------------|
| **抗体** | 抗-γH2AX（免疫荧光，1:500） | Millipore | Cat# 05–636; RRID: AB_309864 |
| | 抗-SYCP3（免疫荧光，1:200） | Abcam | Cat# ab97672; RRID: AB_10678841 |
| | 抗-SYCP3（免疫荧光，1:200） | Rat | N/A |
| | 抗-SYCP1（免疫荧光，1:200） | Abcam | Cat# ab15090; RRID: AB_301636 |
| | 抗-H1T（免疫荧光，1:400） | Liu et al. | N/A |
| | 抗-MEIOB（免疫荧光，1:200） | This paper | N/A |
| | 抗-SPATA22（免疫荧光，1:200） | Proteintech | Cat# 16989-1-AP; RRID: AB_2286640 |
| | 抗-TEX11（免疫荧光，1:200） | Mengcheng Luo | N/A |
| | 抗-RNF212（免疫荧光，1:100） | Mengcheng Luo | N/A |
| | 抗-MSH4（免疫荧光，1:50） | Mengcheng Luo | N/A |
| | 抗-HORMAD1（免疫荧光，1:400） | Proteintech | Cat# 13917-1-AP; RRID: AB_2120844 |
| | 抗-BRCA1（免疫荧光，1:100） | Santa Cruz | Cat# sc-135732; RRID: AB_2243740 |
| | 抗-TEX12（免疫荧光，1:200） | Proteintech | Cat# 17068-1-AP; RRID: AB_2201875 |
| | 抗-SIX6OS1（免疫荧光，1:300） | Liu et al. | N/A |
| | 抗-MLH1（免疫荧光，1:50） | BD Biosciences | Cat# 551092; RRID: AB_394041 |
| | 抗-Cleaved PARP (Asp214)（免疫荧光，1:150） | Cell Signaling Tech | Cat# 94885; RRID: AB_2800237 |
| | 抗-FLAG（免疫荧光，1:200） | Sigma | Cat# F3165; RRID: AB_259529 |
| | 抗-β-actin（Western Blot，1:5,000） | Abcam | Cat# ab179467; RRID: AB_273734 |
| | 抗-HA（Western Blot，1:2,000） | Proteintech | Cat# 51064-2-AP; RRID: AB_1104232 |
| | 抗-Rat IgG H&L（Alexa Fluor 488，免疫荧光，1:200） | Abcam | Cat# ab150165; RRID: AB_2650997 |
| | 抗-Rat IgG H&L（Alexa Fluor 594，免疫荧光，1:200） | Abcam | Cat# ab150160; RRID: AB_2756445 |
| | 抗-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor 488，免疫荧光，1:200） | Abcam | Cat# ab150113; RRID: AB_2576208 |
| | 抗-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor 594，免疫荧光，1:200） | Abcam | Cat# ab150120; RRID: AB_2631447 |
| | 抗-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor 488，免疫荧光，1:200） | Abcam | Cat# ab150081; RRID: AB_2734747 |
| | 抗-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor 594，免疫荧光，1:200） | Abcam | Cat# ab150084; RRID: AB_2734147 |
| | 抗-Rabbit IgG（H + L）-HRP缀合物（Western Blot，1:5,000） | Bio-Rad | Cat# 1706515; RRID: AB_2617112 |
| | 抗-Mouse IgG（H + L）-HRP缀合物（Western Blot，1:5,000） | Invitrogen | Cat# 31430; RRID: AB_228307 |

**化学品、肽和重组蛋白**
- **DNase I** | Applichem | Cat# A3778 |
- **完整蛋白酶抑制剂** | Roche | Cat# 04693159001 |
- **LipofectamineTM 3000转染试剂** | Invitrogen | Cat# L3000008 |
- **Triton X-100** | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
- **Bouin溶液** | Sigma-Aldrich | Cat# HT10132 |
- **胎牛血清** | Gibco | Cat# 16000044 |
- **青霉素-链霉素** | Gibco | Cat# 15140122 |
- **PMSF蛋白酶抑制剂** | Thermo Fisher Sci | Cat# 36978 |

**实验模型**
- **细胞系**：人类HEK293T细胞（ATCC，CRL-3216，RRID: CVCL_0063）
- **微生物/品系**：小鼠Spo16?/?（Liu et al.）

**寡核苷酸**
本研究使用的sgRNAs和引物列于表S1中。

**软件和算法**
- **GraphPad Prism** | GraphPad | RRID: SCR_002798 |

**实验模型和参与者详细信息**
Spo16敲除小鼠模型是使用CRISPR/Cas9基因编辑技术生成的。Meiob-floxed小鼠由Cyagen Biosciences（中国苏州）利用CRISPR/Cas9技术制备。为了生成5.6 kb的DNA缺失片段，设计了引导RNA，在第6和第10个内含子处插入loxP位点。Ddx4-CreERT2小鼠的生成方法已在前文中描述。本研究中使用的所有小鼠品系，包括Meiobfl/fl、Ddx4-CreERT2、Spo16?/?以及用于睾丸电穿孔的野生型小鼠，均维持在C57BL/6背景上，且仅分析雄性小鼠。

**试剂配制**
他莫昔芬（T5648；Sigma-Aldrich）溶于玉米油中，然后在55°C下摇床加热1小时直至完全溶解，最终浓度为20 mg/mL。在第14天（PD14）开始，将他莫昔芬（80 mg/kg体重）腹腔注射到Meiobfl/fl、Ddx4-CreERT2雄性小鼠以及Meiob+/+或Ddx4-CreERT2/Meiobfl/+幼鼠体内，连续4天每天注射一次。处理完成后在不同时间点采集睾丸样本以供后续分析。

**实验条件**
小鼠在特定无病原体（SPF）环境下饲养，温度控制在20°C–22°C，光照周期为12小时/黑暗12小时，相对湿度为50–70%。所有实验操作均获得香港大学深圳医院伦理委员会的批准（批准编号hkuszh2020031），并遵循委员会的指导原则。小鼠gRNAs的基因分型引物和序列见表S1。PCR程序如下：首先在94°C下变性3分钟，接着进行30个循环（每次30秒变性、20秒退火、30秒延伸），最后在72°C下延伸5分钟。

**细胞培养和转染**
HEK293T细胞（ATCC，CRL-3216，美国）经ATCC认证，检测结果显示无支原体污染。细胞培养于添加10%胎牛血清（FBS，GIBCO，16000044）的DMEM培养基中。细胞消化和传代时，将细胞在37°C下用0.25%胰蛋白酶-EDTA处理3分钟。终止胰蛋白酶反应后，加入等体积的含有10% FBS的DMEM培养基。细胞以300 × g离心5分钟并弃去上清液，再将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中并按适当比例传代。转染在细胞密度达到70–80%时进行。

**转染方法**
将5 μL Lipofectamine 3000试剂（Invitrogen，L3000008）稀释在125 μL Opti-MEM培养基中并充分混合。另取2.5 μg质粒DNA稀释在125 μL Opti-MEM中，再将质粒溶液与Lipofectamine 3000试剂混合，最后加入5 μL P3000试剂并充分混匀。将DNA-Lipofectamine复合物在室温下孵育10–15分钟，之后轻轻加入培养基中并轻轻摇晃以确保均匀分布。转染后48小时进行后续实验。

**组织学分析**
小鼠安乐死后立即切除睾丸并在室温下用Bouin溶液固定过夜。固定后，使用梯度乙醇系列脱水，最后将组织包埋在石蜡中。组织切片（厚度5 μm）通过显微切片机制备。脱蜡后用二甲苯脱脂并经过梯度乙醇系列重新水化，再用苏木精染色进行组织学检查。图像由Zeiss显微镜（Oberkochen，德国）拍摄。

**精子细胞表面核展开分析和免疫荧光**
精子细胞染色体展开的制备方法如前文所述。新鲜睾丸组织样品用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗去白膜，随后在HEB缓冲液[30 mM三盐酸、17 mM三钠柠檬酸二水合物、50 mM蔗糖、5 mM EDTA、0.5 mM DTT和1 mM PMSF]中处理30分钟。使用细镊子将生精小管机械分离。将约10 μL悬浮液加入预先涂有固定缓冲液[1%戊二醛和0.15% Triton X-100（pH 9.2）的载玻片上，以便进一步展开。样品在室温下风干1小时后进行免疫荧光染色或储存在-80°C。

**免疫荧光染色**
载玻片用PBST（含0.05% Triton X-100的PBS）洗5分钟。随后加入一抗和二抗，具体抗体的信息见关键资源表格。荧光信号由LSM 900共聚焦显微镜（Zeiss，Oberkochen，德国）捕获。

**免疫沉淀和免疫印迹**
全长cDNAs（编码减数分裂蛋白MEIOB、SPO16、SHOC1和TEX11）通过使用小鼠睾丸RNA作为模板进行RT-PCR扩增。表达构建体中，Shoc1和Tex11 cDNAs被克隆到pcDNA3.1中，生成N端3×FLAG标记和C端GFP融合蛋白；Spo16 cDNAs被克隆到pCAG中，生成N端3×FLAG标记和C端GFP融合蛋白；Meiob cDNAs被克隆到pcDNA3.1中，生成N端3×HA标记和C端GFP融合蛋白。向细胞沉淀中加入500 μL IP裂解缓冲液（含1 μM PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒：每10 mL裂解缓冲液加1片抑制剂），充分混合后置于冰上40分钟，每5分钟涡旋一次。将离心机预冷至4°C后，以12,000 g离心15分钟，弃去上清液。取20 μL HA/FLAG磁珠加入新管中，吸取液体后用稀释的预冷TBST洗涤三次，再重新悬浮在IP裂解缓冲液中。将磁珠（20 μL）加入每个样品管中，充分混合后室温下孵育过夜。最后吸取样品蛋白溶液，用稀释的预冷TBST洗涤磁珠三次，向每个样品中加入50 μL双色加载缓冲液，95°C加热5分钟后储存在-20°C至少一年或直接用于免疫印迹实验。

**样品处理**
样品在SDS-PAGE分析前先煮沸。SDS-PAGE在120电压下进行60分钟，然后转移到PVDF膜上，在冰箱中恒电流条件下转移（250 mA，2.5小时）。膜用5%脱脂牛奶-TBST在室温下封闭1小时，随后与一抗在4°C下孵育过夜。冲洗后，用HRP缀合的二抗在室温下孵育2小时。最后再用ECL溶液在暗室中显影。

**睾丸组织电穿孔**
如前文所述，在睾丸中外源表达Spo16 cDNA。简要地说，Spo16 cDNA被克隆到pCAG-GFP载体（Addgene #11150）中。将质粒DNA（5 μg/μL）与1 μL Fast Green和9 μL质粒溶液混合后注射到出生后20天（PD20）的小鼠睾丸中。电穿孔后两天，收集睾丸组织进行精子细胞染色体展开和免疫荧光分析以检测GFP信号。

**定量和统计分析**
所有统计分析和图形使用GraphPad Prism 9软件完成。数据以平均值±标准差（S.D.）表示。所有统计测试的详细信息见图例或STAR方法部分。本研究未使用任何人类受试者或样本。统计显著性表示如下：ns表示无显著性；?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001。

**补充信息（1）**
**PDF（4.09 MB）**
文件S1：图S1–S7、表S1和数据S1