《Biology》：Genome-Wide Identification and Expression Profiling of Brassinosteroid-Responsive WRKY Transcription Factors Potentially Involved in Natural Rubber Biosynthesis in Hevea brasiliensis
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天然橡胶在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）的乳汁管中合成，但调控乳汁相关过程的转录网络仍知之甚少，尤其是WRKY转录因子是否参与油菜素内酯（BR）响应型调控尚不清楚。研究人员利用巴西橡胶树单倍型A端粒到端粒参考基因组鉴定了HbWRKY家族，并
天然橡胶在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）的乳汁管中合成，但调控乳汁相关过程的转录网络仍知之甚少，尤其是WRKY转录因子是否参与油菜素内酯（BR）响应型调控尚不清楚。研究人员利用巴西橡胶树单倍型A端粒到端粒参考基因组鉴定了HbWRKY家族，并整合了系统发育、基因结构、复制类型、共线性、Ka/Ks、启动子顺式元件、组织表达及BR处理转录组数据。109个HbWRKY蛋白包括21个Group I、72个Group II和14个Group III成员，另有1个非典型蛋白和1个Group I样蛋白。全基因组或片段性复制解释了102个基因（93.6%），全部111个重复HbWRKY对的Ka/Ks均小于1，符合纯化选择。84个启动子（77.1%）中存在G-box元件。89个基因在树皮中表达，37个在乳胶中表达，其中9个基因在乳胶中表达量最高。BR处理后7个HbWRKY基因差异表达，且均下调。HbWRKY7（HbAchr10M0003572）和HbWRKY28（HbAchr15M0012484）被优先筛选，因其同时具备BR处理后的差异表达、在七个组织中树皮表达量最高以及预测的启动子G-box。该更新的家族资源缩小了用于检验橡胶树中BR-WRKY调控模块的候选基因范围。
天然橡胶（NR）主要由顺式-1,4-聚异戊二烯组成，其弹性、耐磨性和低温性能无法被合成替代品完全复现。虽然多种植物可合成橡胶，但巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）仍是主要商业来源。NR在次生韧皮部的乳汁管中合成并储存于乳胶的橡胶粒上。割胶后，乳汁管需重新分配碳、能量、蛋白质合成和运输能力以再生乳胶，因此产量取决于乳汁管系统状态和橡胶再合成效率。异戊烯基二磷酸主要由橡胶树乳胶中的胞质甲羟戊酸途径提供，在橡胶粒表面由烯丙基二磷酸引发剂聚合而成。顺式-异戊烯基转移酶（CPT/HRT）、CPT样蛋白、橡胶延伸因子、小橡胶粒蛋白和HRT1-REF桥接蛋白参与橡胶生物合成机器的组装。基因组和转录组研究进一步表明，乳汁管中橡胶合成、前体代谢、能量供应、激素信号和蛋白质稳态发生协同变化。然而，控制这些过程时序和组织特异性的上游转录网络仍不如酶促机器本身那样清晰。
油菜素内酯（BRs）通过BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1及其共受体BAK1启动信号传导。该途径抑制GSK3样激酶BIN2，促进BES1/BZR1转录因子的去磷酸化和核积累，从而改变参与生长、维管分化和胁迫响应的基因。在转录水平上，BES1和BZR1通过识别特定顺式调控元件调控下游基因表达，包括BR响应元件（BRREs）和E-box相关基序如G-box，通常与其他转录因子协同作用。BR信号还与生长素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸和乙烯途径交叉，其转录输出取决于组织和环境背景。橡胶树BRI1和BAK1家族成员已被鉴定，其中若干成员对外源激素产生转录响应。HbBIN2也表现出蛋白激酶和转录调控活性。因此，橡胶树保留了核心BR感知和信号传导组件，但其在乳汁管和乳胶代谢中的下游转录效应仍不清楚。
WRKY蛋白是植物特有的转录因子，具有多样的调控功能。典型的WRKY蛋白包含约60个氨基酸的WRKY结构域，其N端有WRKYGQK核心，C端有C2H2型或C2HC型锌指基序。该家族通常根据WRKY结构域数量和锌指类型分为Group I、II和III，其中Group II进一步分为IIa–IIe亚组。WRKY蛋白通常识别W-box元件，并可与VQ蛋白、丝裂原活化蛋白激酶及其他调控因子协同作用。家族成员参与发育、衰老、初级和次级代谢、生物与非生物胁迫以及激素响应。WRKY蛋白还与BR信号交叉。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，WRKY46、WRKY54和WRKY70参与BR调控的生长响应；WRKY54与BES1互作并受BIN2介导的磷酸化和蛋白稳定性调控。水稻OsWRKY53参与BR信号和株型调控。这些发现表明WRKY蛋白可构成BR响应转录网络的一部分。
早期的橡胶树基因组分析鉴定了81个HbWRKY基因，其中若干对茉莉酸和乙烯产生响应；HbWRKY3、HbWRKY14和HbWRKY55在酵母中结合并激活HbSRPP启动子。随后发现乳胶富集的HbWRKY27结合HbFPS1启动子并增强其转录活性。这些研究支持WRKY蛋白作为橡胶生物合成相关基因的合理调控因子，但现有家族清单基于较早的基因组版本，且侧重于组织、茉莉酸和乙烯响应。在单倍型A端粒到端粒参考基因组中重新鉴定，结合复制历史、进化约束、组织表达、BR响应性和启动子组成分析，可为候选基因筛选提供更严谨的基础。
本研究利用单倍型A端粒到端粒参考基因组对HbWRKY家族进行了全基因组分析。研究人员检查了蛋白特征、系统发育关系、基因结构、保守基序、复制类型、种内和种间共线性以及选择压力。随后整合组织表达谱、BR处理转录组数据和启动子G-box分布，以优先筛选具有树皮或乳胶相关表达的BR响应型HbWRKY基因。该研究旨在产生可检验的候选基因，而非建立对NR生物合成的直接调控。
材料与方法方面，研究使用巴西橡胶树品种CATAS73397的单倍型A端粒到端粒参考基因组（版本1，Figshare DOI: 10.6084/m9.figshare.26644396.v1；NGDC BioProject PRJCA022207）作为参考。通过结合基于Pfam条目PF03106的profile隐马尔可夫模型搜索与以AtWRKY蛋白为查询的独立BLASTP搜索鉴定候选蛋白，合并候选集并去除重复蛋白标识符，保留的蛋白通过NCBI Batch Conserved Domain Search重新检查，并使用SMART进一步检查保守结构域。蛋白长度、预测分子量和理论等电点通过ExPASy-ProtParam获取。基因结构和保守结构域位置用TBtools-II 2025可视化。亚细胞定位用Plant-mPLoc预测。保守蛋白基序用MEME Suite v5.0.5鉴定。全长HbWRKY和AtWRKY蛋白序列用MUSCLE比对，最大似然系统发育推断用IQ-TREE 2.4.0进行，ModelFinder根据贝叶斯信息准则选择JTTDCMut+I+G4，分支支持用5000次超快自助法评估。染色体坐标从CATAS73397注释中提取并映射到18条组装染色体。基因复制和共线性用MCScanX分析。种间共线性在巴西橡胶树与拟南芥之间以及巴西橡胶树与木薯（Manihot esculenta）之间检查。Ka、Ks和Ka/Ks用Simple Ka/Ks Calculator计算。转录组数据使用先前生成的树皮、雌花、乳胶、叶、雄花、根和种子的表达矩阵，公共数据集SRA登录号为SRR3136158、SRR3136165、SRR3136162、SRR3136159、SRR3136166、SRR3136156和SRR3136168。BR处理乳胶转录组数据由作者实验室生成，尚未发表。用刷子将5 μmol/L油菜素内酯溶液施于割口，对照（CK）以相同程序施水，处理后12 h收集乳胶样品，每种条件分析三个RNA-seq文库，差异表达用DESeq2分析，以|log2 fold change| ≥ 1且校正p值 < 0.01为差异表达基因标准。对于每个HbWRKY基因，将注释5′基因边界上游2000 bp序列操作性地用作启动子，启动子序列提交至PlantCARE分析。候选基因通过交叉BR响应差异表达、以树皮和乳胶为重点的七组织表达谱以及启动子G-box出现进行优先筛选。
结果方面，研究在巴西橡胶树中鉴定出109个非冗余HbWRKY蛋白。根据WRKY结构域数量和锌指特征初步分配，随后根据与拟南芥WRKY蛋白的系统发育关系评估和细化。最终分类包括1个非典型WRKY蛋白、21个Group I蛋白、72个Group II蛋白、14个Group III蛋白和1个Group I样蛋白。蛋白长度范围为145至743个氨基酸，中位数为343个氨基酸。预测分子量范围为16.83至82.19 kDa，理论等电点为4.80至9.84。所有HbWRKY蛋白均预测定位于细胞核。全部21个Group I蛋白包含两个检测到的WRKY结构域，而其余88个蛋白各含一个。大多数蛋白保留了典型WRKYGQK七肽：82个单结构域蛋白含一个拷贝，全部21个Group I蛋白含两个。6个蛋白携带变异核心。Group I和Group II蛋白主要显示C2H2型锌指，而Group III蛋白具有预期的C2HC构型。非典型蛋白HbAchr5M0028015保留了WRKYGQK但缺乏可识别的典型C2H2或C2HC模式。HbAchr10M0002181含一个完整WRKY-C2H2结构域和一个高度退化的WRKY样区域，被指定为Group I样。HbWRKY基因在外显子-内含子组织和基因组长度上表现出变异。系统发育相关基因通常具有可比的外显子-内含子组织。MEME回收了六个保守基序。基因结构、基序组成和结构域架构与家族分类广泛一致。
HbWRKY复制链接分布在全部18条橡胶树染色体上。109个基因中，102个（93.6%）被分配到全基因组或片段性复制，5个（4.6%）为分散复制，2个（1.8%）为近端复制。种间分析检测到巴西橡胶树与拟南芥之间130个共线对，涉及81个HbWRKY和53个拟南芥基因；巴西橡胶树与木薯之间302个共线对，涉及107个HbWRKY和99个木薯基因。对111个重复HbWRKY对计算了Ka/Ks。Ka范围为0.0384至0.5909，Ks为0.1589至4.8014，Ka/Ks为0.0478至0.5839。全部111个重复HbWRKY基因对的Ka/Ks比值低于1，符合纯化选择。在橡胶树-木薯对中，涉及106个HbWRKY和99个木薯基因的290对产生了保留的Ka/Ks估计；所有比值均低于1。联合的橡胶树-拟南芥系统发育解析了Group I、Group III和五个Group II亚组IIa–IIe。HbWRKY蛋白与AtWRKY蛋白交错分布，而非形成橡胶树特异性聚类。
组织表达热图显示树皮、雌花、乳胶、叶、雄花、根和种子中广泛且具有组织偏向性的模式。30个HbWRKY基因在全部七个组织中具有非零值。树皮中检测到89个基因的表达，乳胶中检测到37个。在七种分析样品类型中，9个HbWRKY基因在乳胶样品中表现出最高的记录转录丰度。19个基因在树皮中显示最高值。差异表达分析鉴定出7个HbWRKY基因在BR处理后12 h收集的乳胶样品中较CK显著下调：HbAchr1M0001311、HbAchr10M0003572、HbAchr15M0012484、HbAchr13M0008823、HbAchr9M0035863、HbAchr16M0016494和HbAchr9M0037941。全部7个基因在BR处理下转录丰度低于CK。
在精确重复坐标合并后，109个HbWRKY启动子中84个（77.1%）含有G-box元件，产生255个独特区间。含G-box启动子出现在21个Group I中的17个、72个Group II中的57个和14个Group III中的10个；非典型或Group I样基因未记录到。五个BR响应基因属于Group II，两个属于Group III。全部7个被分配到全基因组或片段性复制。六个启动子含有至少一个G-box。HbAchr10M0003572和HbAchr15M0012484提供了树皮相关响应的最强组合证据：在七个分析组织中，HbWRKY7和HbWRKY28在树皮中表现出最高的记录转录丰度，表达值分别为140.06和74.16。两个基因的启动子区域均含有G-box元件。Swiss-Prot同源注释将HbAchr10M0003572和HbAchr15M0012484分别指定为HbWRKY7和HbWRKY28。这些基于注释的别名并不建立与拟南芥蛋白的一对一正交关系。
讨论部分指出，单倍型A端粒到端粒参考基因组产生109个HbWRKY成员，比早期组装的81个多28个。扩展的成员保留了已建立的被子植物WRKY框架。基因结构、基序组成和系统发育分组之间的一致性表明主要HbWRKY亚家族在结构上保持约束。然而，变异的WRKYGQK核心、非典型蛋白和Group I样成员指向可能影响DNA结合偏好、稳定性或蛋白互作的局部氨基酸替换或结构域退化。全基因组或片段性复制占102个基因（93.6%），使其成为主要的保留复制类别。植物基因组复制可通过剂量平衡、亚功能化或新功能化保留转录因子和其他网络组件。 euphorb共同祖先中的古老多倍化和橡胶树谱系中广泛保留的复制为HbWRKY模式提供了适当的基因组背景。全部111个重复HbWRKY基因对的Ka/Ks比值低于1，表明纯化选择有助于这些重复基因的进化保守。尽管同义替换率（Ks）已被广泛用于基于分子钟假设估计重复基因对的分化时间，但此类估计需要适当的替换率和仔细考虑同义替换饱和。鉴于重复HbWRKY基因对之间Ks值的广泛变异，本研究未估计绝对分化时间以避免可能不可靠的进化解释。此外，巴西橡胶树与木薯之间所有290个具有有效Ka/Ks估计的WRKY基因对均表现出低于1的比值，表明纯化选择有助于这两个物种间WRKY蛋白编码序列的保守。与拟南芥相比，与木薯更密集的WRKY共线性也与两个euphorb更近的关系和共享复制历史一致。这些观察描述了进化保守和保留；它们本身并不建立功能等价或复制后特化。
G-box在HbWRKY家族中广泛存在：84个启动子含有255个非冗余位点。在拟南芥中，激活的BZR1和BES1识别BRRE和E-box相关元件，包括G-box，BES1可与bHLH因子如BIM1协同作用。BES1还控制众多转录因子基因，从而产生分层转录响应。因此，HbWRKY启动子中G-box的存在与某些家族成员作用于BR响应转录网络下游或与其协同作用相容。Group II含有219个位点中的155个，但它也是最大的组。含G-box启动子的比例在Group I（81.0%）、Group II（79.2%）和Group III（71.4%）之间相似，这反对仅从原始位点计数推断亚组富集。BZR1还可与G-box结合因子PIF4协同整合BR、光和温度信号，强调G-box并非BR特异性。仅启动子预测不能证明BES1/BZR1在体内的占据。需要ChIP-qPCR、EMSA、双荧光素酶 assay和靶向G-box诱变来测试直接结合和调控活性。
HbWRKY7和HbWRKY28结合了三个独立观察：BR处理后下调、在七个采样组织中树皮表达量最高以及一个或多个预测的启动子G-box。HbWRKY7属于IId亚组，与AtWRKY21、AtWRKY39和AtWRKY74系统发育接近。AtWRKY21与OBERON蛋白和其他IId WRKY成员协同平衡生长和胁迫响应转录，而AtWRKY39有助于耐热性。这些关系提出了HbWRKY7参与平衡树皮中激素响应生长和胁迫适应的可检验可能性，但并未指定保守功能。HbWRKY28属于IIc亚组，位于AtWRKY8、AtWRKY23、AtWRKY28、AtWRKY68和AtWRKY71附近。这些拟南芥蛋白涵盖多样功能：AtWRKY23影响根中局部黄酮醇合成和生长素分布；AtWRKY71改变生长素稳态和地上部分枝；AtWRKY8有助于耐盐性；AtWRKY28限制异位雌性生殖细胞 specification；AtWRKY68响应生长素和高温。其功能广度警告不要将单一角色转移给HbWRKY28。一个合理的工作假设是HbWRKY28参与树皮中的激素和环境响应网络，可能包括BR-生长素交叉，但这仍有待检验。HbAchr1M0001311（IIa）与ABA相关的AtWRKY18/40/60分支聚在一起，HbAchr13M0008823（IIc）位于磷酸盐响应性AtWRKY45附近。Group III基因HbAchr16M0016494和HbAchr9M0037941表现出低树皮表达且在乳胶中未检测到；它们与分别调控种子休眠和叶片衰老的AtWRKY41和AtWRKY53聚在一起。这些比较产生假设而非功能分配。由于相应的生物材料和样品信息不可用，未进行独立的qRT-PCR验证。12 h转录谱可能包括次级效应和更广泛的转录调整；它们不识别直接或早期BR靶标。因此，低表达候选基因包括HbWRKY28需要特别谨慎和独立验证。证明BR-WRKY对乳胶相关生物学的贡献将需要在适当的橡胶树系统中进行启动子结合和转录 assay、下游靶标分析以及基因敲低或过表达。
结论部分，本研究将橡胶树WRKY家族更新为109个成员，并表明全基因组或片段性复制加上普遍存在的纯化选择塑造了其大部分保留的 repertoire。整合组织表达、BR响应转录谱和启动子G-box出现，优先筛选HbWRKY7和HbWRKY28作为核心树皮相关候选基因。该分析缩小了用于机制研究的基因集，但并未建立BR信号组件的直接调控或对天然橡胶生物合成的因果贡献。
