《iScience》：Deciphering early tau pathology events using an Alzheimer’s disease-seeded organotypic hippocampal slice culture model
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阿尔茨海默病（AD）中tau病理在脑内的播散被认为依赖于充当种子的病理性tau种类。为深入理解其潜在机制，需要能够在类脑环境中研究tau种子活动的模型。研究人员建立了一种基于器官型海马切片培养（OHSC）的离体（ex vivo）模型，该培养物取自表达人促聚集突
阿尔茨海默病（AD）中tau病理在脑内的播散被认为依赖于充当种子的病理性tau种类。为深入理解其潜在机制，需要能够在类脑环境中研究tau种子活动的模型。研究人员建立了一种基于器官型海马切片培养（OHSC）的离体（ex vivo）模型，该培养物取自表达人促聚集突变型tau的转基因小鼠幼崽。研究人员首次证实，人脑来源的tau种子能够增强此类培养物中的tau病理。此外，tau种子可在离体条件下生成，从而完善了该模型的验证。随后，研究人员阐明了tau种子活动的初始事件：tau病理呈顺序性出现，先见于神经突，后见于胞体，且错误折叠（MC1+）先于病理性磷酸化（pS422、pT217）。总之，这使该模型成为一种极具价值的生物测定方法，用于解析导致tau病理发展的分子与细胞机制。
研究背景方面，tau蛋白病是一组约25种神经退行性疾病，均以tau蛋白异常沉积于细胞内纤维状结构并导致神经元与突触进行性丢失为特征。阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病，属tau蛋白病，其特征为脑内淀粉样β肽（Aβ）聚集形成细胞外淀粉样斑块，以及异常过度磷酸化tau蛋白聚集形成细胞内神经原纤维缠结（NFT）。尽管Aβ病理出现更早，但tau病理与神经元丢失及认知衰退的相关性更强。人脑中tau蛋白存在多种异构体，由MAPT基因转录本经可变剪接产生，并伴有大量翻译后修饰（PTM），按微管结合域重复序列数目可分为4R tau与3R tau，AD的NFT中两者均存在。目前尚不清楚AD相关的不同tau磷酸化位点是出现在tau错误折叠与聚集之前还是之后。部分tau蛋白病尤其是AD在神经解剖相连脑区呈现刻板的分期模式（Braak分期），结合实时震荡诱导转化（RT-QuIC）和蛋白错误折叠循环扩增（PMCA）等体外扩增试验所显示的tau种子活性，形成了tau病理可经朊病毒样机制在脑内播散的假说。根据该假说，某些病理性tau种类作为种子，能够招募正常tau并传递其核心结构。然而，对病程长达数十年的AD所涉及的细胞机制进行精细解析仍具挑战。多数临床前研究依赖过表达人突变tau的tau蛋白病小鼠模型，其中THY-tau30（tau30）小鼠表达携带P301S和G272V两种致病突变的人1N4R tau异构体，约3月龄自发出现tau病理，随后出现记忆缺陷，约1年时出现神经元丢失；其tau病理可被脑内注射AD患者来源的人脑材料所增强。体内模型虽强大但复杂度高，细胞模型虽便捷却多难以再现神经元特征与脑网络。器官型脑切片培养因保留细胞多样性、空间结构和突触连接性，可弥合二者之间的差距，近期研究显示此类培养物可支持tau病理发展，例如3xTg-AD小鼠幼崽切片、病毒载体诱导过表达双突变或三突变人tau的切片、以及过表达突变tau重复域（RD）的OHSC均可出现病理，P301S tau转基因幼崽OHSC亦可经同源种子过程发展tau病理，但这些种子均为小鼠来源。因此，建立AD种子诱导的OHSC将为研究人AD脑来源tau种子所诱导的tau病理提供有价值的离体模型。基于此，研究人员改良已有方案，用AD患者来源的人脑匀浆（BH）处理tau30幼崽制备的OHSC，在不到两周内增强tau病理，并研究tau病理发展的顺序性特征。
研究人员开展的研究及结论：研究人员用人AD患者（AD1至AD5）与非痴呆对照者（Ctl1至Ctl5）的BH处理tau30及野生型（WT）同窝幼崽制备的OHSC，证实AD BH可在14天体外培养（DIV）内诱导MC1+病理，且仅AD BH处理tau30 OHSC出现该信号，对照BH处理tau30 OHSC及AD BH处理WT OHSC均为阴性；每切片MC1+胞体数及离体产生的tau种子量与初始BH的种子潜力相关；tau免疫去除（tau-ID）显著减少MC1+胞体，验证了tau种子的关键作用；AD种子OHSC在培养中新生成了tau种子。研究进一步揭示tau病理先见于神经突、后见于胞体，且错误折叠（MC1+）先于病理性磷酸化（pS422、pT217）。其重要意义在于，该模型能在类脑环境中快速、可靠地再现tau病理，成为衔接细胞模型与动物模型的高价值工具，可用于解析tau种子过程的分子细胞机制并测试治疗策略。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员建立出生后第7天（P7）tau30及WT幼崽的器官型海马切片培养（OHSC），于2 DIV将人脑匀浆（BH，80 μg/mL总蛋白）加入切片培养基过夜以诱导种子活动；采用蛋白免疫印迹（Western blot）表征BH的tau含量与磷酸化；采用基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器细胞系（表达突变tau RD-P301S偶联CFP/YFP）经流式细胞术定量tau种子活性；采用免疫荧光（MC1、pS422、pT217、pS396、AT8等）及共聚焦/转盘显微镜观察并计数MC1+胞体与神经突斑点；采用免疫去除（tau-ID）验证tau种子作用；以碘化丙啶（PI）评估细胞活力。人脑样本来源于Lille Neurobank（5例AD、5例非痴呆对照）。
研究结果：（1）AD与非痴呆对照人脑匀浆的表征：经免疫印迹显示AD BH中磷酸化tau（2H9识别pS422、AT100识别pT212/pS214）明显高于对照，总tau除AD3外亦较高；FRET生物传感器细胞试验显示所有AD BH均具种子活性而对照BH无，AD1、AD2、AD4活性较高。（2）AD种子诱导OHSC的建立：2 DIV加入AD1 BH后14 DIV可见MC1+细胞，对照BH处理tau30 OHSC及AD BH处理WT OHSC均无MC1+信号，证明信号非源于所加匀浆残留；80 μg/mL为优化浓度且不损害活力（PI试验），MC1+胞体数随培养时间增加，且仅位于CA1区。（3）离体tau病变与tau种子相关：五种AD BH均诱导MC1+胞体而对照BH均不能；MC1+胞体数与BH种子活性相关性最高（rs=0.9374、0.8878），与2H9+ tau（rs=0.8340）、AT100+ tau（rs=0.8340、0.9245）相关；tau免疫去除后MC1+胞体显著减少，验证tau种子的关键贡献。（4）AD种子OHSC中tau种子的新生：14 DIV OHSC匀浆的FRET信号在AD BH处理tau30 OHSC中持续高于对照，证明种子主要在两周培养中生成而非残留；MC1+胞体数与OHSC种子含量强相关（rs=0.8728、0.7486）。（5）离体模型解析tau病理顺序事件：14 DIV未见神经元丢失及小胶质细胞反应（NeuN、Iba1）；MC1+细胞均pS396+，但pS396+亦见于对照BH处理及未处理切片，AT8类似；pS422仅见于AD种子OHSC，MC1+胞体均pS422+且反之亦然；7 DIV时神经突MC1+斑点已存在而极少pS422+，提示MC1+转构象先于pS422；MC1+斑点仅部分pT217+，提示转构象亦先于pT217；部分神经元神经突有MC1+斑点而胞体阴性，支持神经突为初始种子位点。
讨论部分总结：本研究建立了AD种子tau30 OHSC离体模型，可在应用AD BH后约12天即观察到前缠结结构，首次证明AD脑来源人tau种子可增强OHSC中的tau病理；数据确认tau种子的关键作用，但不排除AD BH中Aβ等其他因素参与。模型显示错误折叠与异常过度磷酸化tau种类，并证实种子活性新生；但切片匀浆与BH的种子活性测定存在变异，可能部分源于生物传感器细胞批次差异及种子含量随时间变化（两次测定相隔14个月），同一试验内重复间变异则归因于模型固有变异，故该模型更适合解析机制与测试治疗策略而非广泛比较人组织种子活性。模型还揭示病理tau（MC1+）转构象先见于神经突后见于胞体，提示初始种子位点并非仅由tau丰度决定，神经突可能因降解能力较低而具特殊易感性，尚需进一步研究。器官型切片培养的优势在于可研究tau病理与神经网络及非神经元细胞的相互作用；本研究14 DIV未见神经元丢失或小胶质细胞反应，但与既往报道的差异可能与培养时长、过表达类型与水平、脑区及伴随突变蛋白等因素有关；对照BH处理及未处理OHSC中可见pS396与AT8，符合这些修饰可发生于生理情境的文献；pS422仅见于AD种子OHSC，严格关联病理，且在种子情境下出现于MC1+转构象之后，但不排除其在自发聚集或起始转构象中先行出现；pT217同样出现于MC1+转构象之后。
研究结论翻译：本研究成功建立了AD种子tau30 OHSC模型，用于研究由人源tau种子最初介导的tau病理发展过程中tau转构象、磷酸化与定位的机制。该模型在类脑环境中以加速而可靠的方式忠实模拟tau病理，构成衔接细胞模型与动物模型的高价值工具。研究局限性：不同时间点切片培养间存在变异，限制其广泛比较人组织种子活性，更适合解析机制与测试治疗策略；AD涉及野生型tau，而本模型过表达双突变tau，但人突变tau的过表达显著加速了tau病理动力学，是该离体模型的关键优势。
