壳聚糖寡糖基纳米载体负载植物提取物对尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的体外抑制及香蕉苗期病害减缓作用

《Agronomy》：Time-Window-Dependent Nonlinear Decline and Asymptotic Convergence of Temporal Stability of Soil Carbon, Nitrogen, Phosphorus, and pH in Tibetan Grasslands

　　

香蕉枯萎病由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc）引起，威胁全球香蕉生产；尽管多种杀菌剂在受控条件下可抑制Foc，但尚无一种能提供可靠的田间防治效果。本研究在体外评估了两种完整的壳聚糖寡糖（chitosan oligosaccharide, COS）基纳米载体（nanocarrier, NC）制剂——分别负载茜草（Rubia tinctorum）或猫爪草（Uncaria tomentosa）提取物——对Foc亚热带4号生理小种（subtropical race 4, STR4）和热带4号生理小种（tropical race 4, TR4）的抑制作用，并在初步植株试验中评估其对TR4的效果。两种制剂对两个生理小种均有抑制作用，EC50值为320.0–571.7 μg·mL^?1，二者毒力无差异。在每条件两管的描述性时间-杀菌试验中，茜草制剂自48 h起未回收到菌落，而猫爪草制剂在72 h仍产出3–7 CFU·mL^?1。以单次浸根方式施用于接种TR4的‘Grand Nain’植株，在每处理9株、每处理一托盘及一批次施用的单次控制环境试验中，茜草制剂的标准ized病害进展曲线下面积较接种对照低34.9%，而猫爪草的7.8%差异无法与该对照区分；各接种组发病率均为100%。该植株比较属有待确证的观察结果，而非重复估计的防效，且不能归因于任一单一制剂组分；其结果将茜草制剂确定为需开展独立重复试验的候选制剂。

研究背景：香蕉（Musa spp.）是全球最重要的水果及经济作物之一，种植于130多个国家，全球产量1.17亿吨、种植面积550万公顷，预计2028年增至1.35亿吨。由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc）引起的香蕉枯萎病（Fusarium wilt of banana, FWB）是最具毁灭性的病害之一，估计受影响面积10万公顷、经济损失近20亿美元。Foc按寄主反应传统上分为4个生理小种，其中4号生理小种危害Cavendish（AAA基因组）及对1、2号小种感病的品种，并依气候适应性和毒力分为亚热带4号生理小种（subtropical race 4, STR4）与热带4号生理小种（tropical race 4, TR4）；STR4需冷胁迫等诱因致病，而TR4在广泛环境条件下即可使Cavendish显症，为毒力最强类型。TR4克隆于20世纪90年代在台湾出现，随后迅速扩散至东南亚、中国、澳大利亚、印度、巴基斯坦、中东及非洲，近期在美洲（哥伦比亚、委内瑞拉、厄瓜多尔、秘鲁）亦有记录。FWB防治面临多重困难：病原在无寄主土壤中长期存活并可存于无症状交替寄主；作为维管束病原，一旦进入木质部即难以触及；病原易经繁殖材料、污染土壤、人员、机械和灌溉水传播。尽管育种已产生具TR4抗性且农艺与果实品质可接受的商业品种，但尚无在各产区兼具稳定高抗与Cavendish全部优良性状、被普遍采用的出口级替代品种。在加那利群岛（欧盟主要香蕉产区，约9100 ha、8000余生产者），FWB发病率为2–12%，局部暴发可达30%，虽尚未检出TR4但已有STR4发生；当地主栽Dwarf Cavendish（‘Peque?a Enana’）对TR4感病，现行措施包括氢氧化钙土壤改良、硫酸锌或硅处理、维持土壤有机质高于3%及施用植物防御诱抗剂，并依赖检疫与材料认证阻止TR4传入。鉴于合成杀菌剂的环境顾虑与法规限制，植物源生物活性天然产物成为有前景的替代途径；茜草（Rubia tinctorum L.）根富含茜素（alizarin）和红紫素（purpurin）等蒽醌类，具显著抗真菌活性，猫爪草（Uncaria tomentosa (Willd. ex Schult.) DC.）树皮含生物碱、喹诺酸糖苷和多酚等具抗菌活性成分。但植物提取物直接施用面临活性成分快速降解、生物利用度有限和水溶性差等挑战。纳米技术通过纳米载体（nanocarrier, NC）实现活性分子的高效运输与控释；壳聚糖基NC因可生物降解、生物相容及内在抗菌性而受关注，引入石墨相氮化碳（graphitic carbon nitride, g-C₃N₄）的先进NC系统具低毒性、优良生物相容性和高效包封能力，羟基磷灰石（hydroxyapatite, HAp）亦已成功用作生物活性化合物递送剂。对植物提取物而言，包封预期通过三方面克服游离施用的局限：稳定性（聚合物基质遮蔽光降解、氧化和微生物分解）、靶标处可利用性（难溶成分以纳米颗粒分散于水悬液，阳离子壳聚糖表面利于黏附于带负电的根表和真菌细胞）和释放（随基质溶胀、溶解或酶解逐步释放，而非快速稀释、吸附或降解的单次脉冲）；壳聚糖本身还具诱抗活性。这些特性尤其适用于经根侵入、定殖木质部后难以防治的土传病原TR4：移栽时根部施用可将活性化合物置于侵染起始部位。本研究所用载体系统已报道高包封率和酶触发释放，但本研究仅评估完整制剂，未检验上述相对游离提取物的预期优势是否在Foc上实现。鉴于Foc TR4对全球香蕉生产的严重威胁及常规防治的局限，本研究旨在评估两种先前开发的COS基纳米载体制剂（负载茜草提取物的COS-g-C₃N₄ NC与负载猫爪草提取物的COS-HAp-g-C₃N₄ NC）对Foc STR4和TR4的抗真菌活性，并在受控条件下初步评估其对香蕉植株TR4的防效，时间-杀菌曲线及植株生理和生长指标作为次要或探索性结果。研究检验两个假设：其一，两种完整提取物负载制剂均能在体外抑制Foc STR4和TR4；其二，两者均能减轻接种香蕉植株在受控条件下的病害进展。

关键技术方法：供试真菌为Foc STR4（加那利本地菌株3GI-I，营养体亲和群（vegetative compatibility group, VCG）0120，分离自香蕉茎）与Foc TR4（菌株54006II5，VCG 01213/16，由西班牙科尔多瓦大学Antonio Di Pietro教授提供）。茜草标本采自西班牙帕伦西亚Carrión河岸，按Langa-Lomba等的方法制备并表征水解甲醇提取物；猫爪草树皮采自秘鲁La Merced（Chanchamayo），按Sánchez-Hernández等的方法制备氨水提取物。香蕉材料为CULTESA提供的‘Grand Nain’Cavendish（AAA基因组）组培苗。载体方面，壳聚糖寡聚体（平均MW < 2 kDa，多分散指数1.6）按Santiago-Aliste等制备；g-C₃N₄纳米片由三聚氰胺氰尿酸盐在加盖坩埚中600 °C空气气氛热解50 min获得；HAp按Santiago-Aliste等以H₃PO₄与Ca(OH)₂湿化学沉淀制备。COS-g-C₃N₄ NC按Santiago-Aliste等及西班牙专利ES2958909（WO 2024/018098 A1）制备，COS:g-C₃N₄重量比1:0.5；COS-HAp-g-C₃N₄ NC按Santiago-Aliste等及西班牙专利ES2991400（WO 2024/246386 A1）制备，COS:HAp:g-C₃N₄重量比2:1:0.5。提取物包封中，茜草于COS-g-C₃N₄ NC按COS:g-C₃N₄:茜草重量比1:0.5:0.25（提取物14.3% w/w），猫爪草于COS-HAp-g-C₃N₄ NC按2:1:0.5:1（提取物22.2% w/w），混合物超声1 h并维持温度低于60 °C、pH 4–5。体外药效以琼脂稀释法测定（62.5–1500 μg·mL^?1，每处理每浓度两独立试验共6个独立平板，25 °C黑暗培养6 d），以两参数log-logistic模型拟合EC50与EC90；时间-杀菌试验在3000 μg·mL^?1下进行，初始接种约1.7 × 10² CFU·mL^?1，于0、24、48、72 h取样涂布PDA计数，每处理×菌株组合两独立管；以fosetyl-Al（Fosbel?，80% w/w）为参考杀菌剂平行测定菌丝生长抑制（STR4于5 dpi、TR4于6 dpi读数）。初步生长箱试验设6组、每组9株：非接种对照、茜草NC、猫爪草NC、Foc接种对照、茜草NC+Foc、猫爪草NC+Foc；以3000 μg·mL^?1（琼脂稀释试验完全抑制浓度的2倍）浸根2 min，2 h后以150 mL 1 × 10⁶ conidia·mL^?1的TR4孢子悬液灌根；于11–79 dpi按0–4九点序数标度评估病情，计算AUDPC、标准化AUDPC（SAUDPC）、死亡率、发病率和病情强度指数（disease intensity index, DII）；于终收期测定叶绿素荧光与气体交换（LI-600）、DUALEX叶光学指数及生长参数。统计以平板或试管为体外试验单位，植株为观测单位，采用Kruskal–Wallis、Dunn、Tukey HSD、Friedman、bootstrap重采样及Benjamini–Hochberg校正等。

研究结果：
3.1 纳米载体表征：两种NC系统的表征此前已有详细报道。透射电镜显示COS-g-C₃N₄为平均直径85.5 ± 21.3 nm（分散指数0.25）的球形颗粒，COS-HAp-g-C₃N₄为250 ± 84.4 nm（分散指数0.34）；傅里叶变换红外光谱确认组分成功交联；茜草提取物于COS-g-C₃N₄的包封率为95–97%，猫爪草于COS-HAp-g-C₃N₄为82%；壳聚糖酶降解的释放效率分别为74–81%和84–89%。对本试验所用载药制剂的动态光散射给出：COS-g-C₃N₄-茜草Z-average直径53.65 ± 0.87 nm、多分散指数0.330 ± 0.044，主强度加权峰位于83.3 nm；COS-HAp-g-C₃N₄-猫爪草为429.0 ± 1.0 nm、多分散指数0.490 ± 0.071，主峰位于209.7 nm（每制剂单次制备三次测量，0.45 μm过滤）。强度加权峰与透射电镜直径吻合；含HAp制剂的Z-average高于其峰位且多分散指数高，提示分布宽并有粗尾，而g-C₃N₄制剂Z-average低于峰位，符合过滤去除0.45 μm以上材料后中度多分散群体的累积量估计。滤过部分中两制剂强度加权峰相差约2.5倍；被滤除材料及批间变异未表征，故这些数值仅部分描述制剂。
3.2 体外抗真菌活性：3.2.1 有效浓度——两种NC制剂对Foc STR4和TR4的体外活性明显呈浓度依赖性（图1），菌落直径在62.5–1500 μg·mL^?1范围内持续下降，各菌株×制剂组合的浓度效应均极显著（平板水平菌落直径Kruskal–Wallis，H(10) = 58.5–60.9，p < 0.001）；两小种在两NC处理下均于1500 μg·mL^?1达完全抑制。由平板水平剂量-反应拟合的EC50与EC90及按提取物载量换算的等效提取物浓度见表1。两制剂对TR4的活性明显高于STR4，COS-g-C₃N₄-茜草的EC50低37%（347.2 vs. 552.7 μg·mL^?1），COS-HAp-g-C₃N₄-猫爪草低44%（320.0 vs. 571.7 μg·mL^?1）；重采样平板证实该小种差异有数据支持，EC50(STR4)/EC50(TR4)的bootstrap比值对茜草制剂为1.60（95% CI 1.42–1.80）、对猫爪草制剂为1.79（1.58–2.01），两区间均不含1。而在同一小种内，两制剂无法区分，其间bootstrap比值在STR4（0.97；0.89–1.05）和TR4（1.08；0.93–1.26）均含1。但以包封提取物计，茜草制剂更强（对TR4和STR4的EC50分别为49.7和79.0 μg·mL^?1提取物，猫爪草为71.0和126.9 μg·mL^?1），因其单位质量纳米载体递送的提取物更少。3.2.2 时间-杀菌动力学——因每处理、每小种、每独立试验仅一液体培养管，每管三平板平均为单一CFU·mL^?1估计，结果作描述性报告，每格仅两次独立观测，不足以支持正式假设检验。T0时两小种三组无差异（2.00–2.06 log₁₀(CFU·mL^?1 + 1)），对照培养随后指数增长，72 h达2.1 × 10⁷–2.5 × 10⁷ CFU·mL^?1（7.34–7.44 log₁₀单位）。COS-g-C₃N₄-茜草NC在24 h内几乎完全抑制Foc（两小种均为0.43 log₁₀单位，即两管中一管回收单菌落），48和72 h两小种均未回收到活菌落，log₁₀降低分别为6.53–6.80和7.34–7.44（表2）；在该试验条件下，无菌落回收使活菌数低于各取样时点涂布的检测限，即48 h（涂布10^?1稀释）为33 CFU·mL^?1、72 h（原液涂布）为3.3 CFU·mL^?1；相对这些检测限，降低至少为48 h的5.0–5.3 log₁₀单位和72 h的6.7–6.8 log₁₀单位，均非完全清除的测量。COS-HAp-g-C₃N₄-猫爪草NC在24 h降低活菌数逾2个log₁₀单位（2.58–2.59）。其后进程须结合涂布稀释度解读（48 h为10^?1稀释，单菌落对应100 CFU·mL^?1、三平板均值为33 CFU·mL^?1下限；24和72 h为原液，对应10和3.3 CFU·mL^?1）：对TR4，48 h未回收到菌落、72 h计数3.3–6.7 CFU·mL^?1，该密度低于48 h评估的检测下限，两项观测不矛盾，无需推断再生长；对STR4，48 h计数（两管均66.7 CFU·mL^?1）对应10^?1平板上1–2个菌落，处于该涂布的颗粒度范围内，可解释其名义上高于24 h原液计数（13.3–20 CFU·mL^?1）；72 h两小种均产出3–7 CFU·mL^?1，所得log₁₀降低（6.56–6.66）小于茜草制剂（48和72 h均无菌落回收）。上述均为描述性比较：每菌株×处理×时间组合仅两独立管、无正式检验、每个零值受其涂布检测限约束，该试验刻画可回收活力丧失的速率，并不将任一制剂归类为杀菌或抑菌。阴性对照（仅PDB及加任一NC制剂的PDB）各取样时点均无菌，确认无污染，两小种全程表现相似，未见对小种特异的响应差异；但这些观察为描述性，试验旨在刻画杀菌动力学而非支持处理间显著性检验。3.2.3 对参考杀菌剂fosetyl-Al的敏感性——fosetyl-Al对两Foc分离株菌丝生长呈强浓度依赖性抑制，两小种读数时间不同（表3）。STR4于5 dpi读数，浓度对菌落半径效应极显著（Kruskal–Wallis，H(9) = 75.51，p < 0.001）：62.5–125 μg·mL^?1未见抑制，250 μg·mL^?1出现中度抑制（19.0%），随后陡升至500 μg·mL^?1的74.0%和750 μg·mL^?1的86.3%，≥1000 μg·mL^?1抑制超过90%，2000–3000 μg·mL^?1完全抑制；该陡峭反应反映为低EC50（383.9 μg·mL^?1，95% CI 368.7–399.2；R² = 0.986）和高斜率（b = 3.22）（表4）。TR4于6 dpi读数，反应更平缓（H(9) = 57.89，p < 0.001），≤125 μg·mL^?1抑制可忽略，500–1000 μg·mL^?1为中间值（28.4–44.2%），2000 μg·mL^?1最大94.4%，测试范围内未达完全抑制，故EC50较高（960.7 μg·mL^?1，95% CI 901.1–1020.2；R² = 0.958）。两估计之比约2.5不应解读为小种间内在敏感性差异：两试验读数日不同，且至6 dpi时未处理TR4对照已长至平板边缘（23.40 ± 0.00 mm），限制了表达抑制所参照的对照生长并使TR4估计偏高；TR4在2000–3000 μg·mL^?1的残余生长极小且常局限于接种块一侧，提示部分由接种块携带的营养维持。两类活性物质对小种的排序相反：TR4对fosetyl-Al的EC50更高、对两种载药NC的EC50更低；NC试验两小种均于6 d读数、在该方面匹配，而fosetyl-Al试验不匹配，故此对比作为观察报告而非已证实的与小种相关敏感性差异（表1）。
3.3 针对Foc TR4的初步控制环境评估：3.3.1 病情严重度与病害进展曲线下面积——自11至79 dpi以基于受害组织百分比的0–4严重度标度监测，首批外部叶部症状于18 dpi出现。因严重度为序数评分且非接种组存在地板效应、接种对照存在天花板效应，三个病原挑战处理在各评估日作非参数比较。Friedman检验确认各处理症状随时间进展极显著（χ² = 75.6–78.9，df = 10，p < 0.001），非接种组全程无症状。各评估日严重度评分见表5；各评估日的探索性比较中，处理效应自38 dpi起可检出（Kruskal–Wallis，H(2) = 6.78–8.28，p = 0.016–0.034，38–79 dpi间），更早则无（18–31 dpi，p ≥ 0.051）。79 dpi时接种对照中位严重度达4.00 [IQR 3.00–4.00]（均值3.61 ± 0.20，n = 9），茜草NC降至2.50 [2.00–3.00]（均值2.61 ± 0.31），猫爪草NC降至3.50 [3.00–4.00]（均值3.39 ± 0.18）。Bonferroni校正的Dunn检验显示茜草NC自38 dpi至试验结束各评估日均与接种对照显著不同（p = 0.016–0.034），而猫爪草NC尽管数值持续居中，从未与其显著不同。各评估日比较为十次未校正的总体检验，经Benjamini–Hochberg校正后38 dpi起各日仍显著（q = 0.048），18–31 dpi仍不显著（q = 0.064–0.499）。整个11–79 dpi监测期积分的AUDPC见表6；非接种组无症状（AUDPC = 0）且方差为零，排除于正式比较。病原挑战组间处理效应显著（Kruskal–Wallis，H(2) = 7.63，p = 0.022）。以AUDPC除以68天监测期得SAUDPC：接种对照3.04、茜草NC 1.98、猫爪草NC 2.80，分别对应34.9%和7.8%的降低。Bonferroni校正的Dunn检验表明茜草NC与Foc对照显著不同（p = 0.021），猫爪草NC则否（p = 1.000），两NC处理间无差异（p = 0.196）。同数据的参数敏感性分析结果一致（单因素方差分析，F(2,24) = 5.33，p = 0.012；茜草NC对接种对照Tukey HSD p = 0.013），而Bonferroni校正的成对Mann–Whitney检验（各对单独排序而非联合排序）使该对比处于显著边缘（p = 0.051）。这些比较是在本次运行所观测植株间作出的；因每处理占一托盘并由一批悬液施用（见2.7节），它们不估计施用批次、托盘或运行间变异：34.9%差异是运行内观测对比，而非重复估计的处理防效。因严重度评分结转，直接检验了该惯例对曲线下面积的贡献：再生长首见于58 dpi，故52 dpi及之前记录的评分不受其影响；在11–52 dpi窗口重新积分得茜草NC差异40.7%（Kruskal–Wallis H(2) = 6.30，p = 0.043；对接种对照Dunn p = 0.041），大于全期34.9%；11–45 dpi点估计为42.5%，尽管该日总体检验未达显著（p = 0.055）；故该惯例对处理效应是保守的而非夸大。以全监测期对接种对照的植株水平效应量表示，茜草NC的Cliff's δ为?0.68（95% CI ?1.00至?0.21），猫爪草NC为?0.31（?0.81至+0.28）。非接种植株（含两NC处理）各评估日均无症状（SAUDPC = 0）；三个接种组发病率均达100%，三个非接种组均为0%，首批外部症状于18 dpi出现。这些观察表明症状与接种同步；因未在植株组织中再分离或定量病原，它们不能确定症状组织中的分离株，也不能区分定殖减少与耐受性增加。终收期代表性植株与根系的视觉记录（展示处理间症状发展与根系健康差异）见图2。两种载药制剂的死亡率和病情强度指数数值更低，而各接种处理的发病率均保持100%（表6）。79 dpi死亡率：接种对照9株中6株死亡（66.7%；Wilson 95% CI 35.4–87.9%），猫爪草NC 3/9（33.3%；12.1–64.6%），茜草NC 2/9（22.2%；6.3–54.7%）；比例差异虽大，在此样本量下均无统计学支持（对接种对照Fisher精确检验，p = 0.347和p = 0.153）；预先设定的主要结局AUDPC提供了主要的运行内证据。3.3.2 对COS-NC处理的生理响应——以植株为观测单位分析叶绿素荧光与气体交换变量（每处理每叶位n = 9株；表7）。叶绿素荧光：光系统II有效量子产额（ΦPSII）在最幼（叶1，F(2,24) = 0.61，p = 0.553）或最老叶位（叶3，F(2,24) = 0.37，p = 0.696）无处理间差异；中间叶位（叶2）检出显著处理效应（F(2,24) = 4.97，p = 0.016），由猫爪草NC植株（0.390 ± 0.034）低于对照（0.500 ± 0.018；Tukey HSD p = 0.013）驱动，茜草NC植株（0.427 ± 0.019）与二者均无显著差异。电子传递速率（ETR）呈相同模式，叶1（p = 0.647）和叶3（p = 0.726）无差异，叶2显著（F(2,24) = 4.07，p = 0.030），对照（60.2 ± 2.0 μmol·m^?2·s^?1）高于猫爪草NC（48.0 ± 4.2；Tukey HSD p = 0.024），茜草NC居中（52.9 ± 2.5）且与二者不可区分。这些荧光差异限于三个叶位中的一个，出现于两个近乎共线的参数、属未校正探索性比较族，是处理对光化学影响的弱证据，不作进一步解读。气体交换：气孔导度（gsw）、总导度（gtw）和表观蒸腾速率（Eapparent）各组均近于零，茜草NC组处理均值略呈负值（物理上不可能），这些读数低于该条件下porometer可靠量化的范围；照实报告但不作统计比较、不给p值，因对与仪器噪声不可区分的值作检验无信息量；边界层导度（gbw）由仪器腔室决定，各植株基本恒定（2.908 mol·m^?2·s^?1），符合预期。叶-气水汽压亏缺（VPDleaf）仅在最老叶位（叶3，F(2,24) = 5.55，p = 0.010）有处理间差异，猫爪草NC（1.291 ± 0.046 kPa）高于对照（1.172 ± 0.011 kPa；Tukey HSD p = 0.019）和茜草NC（1.177 ± 0.014 kPa；p = 0.025）；叶1（p = 0.061）和叶2（p = 0.216）无显著差异。总体上，气体交换数据在本试验条件下未提供处理特异影响气孔行为的证据，绝对値偏低说明在作任何气孔调节结论前需专门的测量活动。DUALEX测量：终收期叶光学指数评估显示与次生代谢相关指数的处理相关变化，而叶绿素指数无变化（表8）。叶绿素指数在各叶位均无处理间差异（叶1 p = 0.537；叶2 p = 0.666；叶3 p = 0.845）；类黄酮含量则差异强烈（Kruskal–Wallis H(2) = 18.70，p < 0.001），茜草NC（0.628 ± 0.019）和猫爪草NC（0.571 ± 0.028）均约为对照（0.318 ± 0.019）的两倍，增幅分别为97%和79%，二者间无差异（对对照Dunn p < 0.001和0.007）；花青素含量亦受影响（H(2) = 6.14，p = 0.046），茜草NC（0.232 ± 0.013）高于对照（0.169 ± 0.018；Dunn p = 0.041），增37%，猫爪草NC居中（0.212 ± 0.019）且与二者无差异。氮平衡指数（NBI，叶绿素/类黄酮之比）在两处理组均急剧下降（H(2) = 17.91，p < 0.001），由对照的117.46 ± 11.97降至茜草NC的51.54 ± 2.74和猫爪草NC的58.20 ± 4.36（对对照Dunn p < 0.001和p = 0.004）；因叶绿素未变，该下降完全归因于类黄酮积累。花青素是唯一检出与对照名义差异的叶光学指数：茜草NC高于对照（p = 0.041），猫爪草NC居中且与两组均无差异，故未证明两制剂间差异；但这是未校正探索性族中p = 0.041的单一比较、于终收期在非接种植株测得，经该族校正将不能存活，作为值得在能检验它的设计中跟进的一项生理观察报告。3.3.3 可见药害筛查与生长参数——在79天控制环境试验中，测试浓度下未检出可见药害症状，即与未处理植株相比，叶、假茎、根或球茎均未见褪绿或坏死（图2）；评估通过终收期对对照和两NC处理组每株每叶的直接检视完成，未记录叶水平图像，故图2展示处理而非证明无药害；形态计量与生物量数据支持该结论，两处理组均未相对对照降低。该定性筛查限于测试条件下的明显组织损伤，不构成总体安全性评估。终收期若干形态计量测量在两处理组均高于对照（表9）。两处理组叶尺寸均大于对照：叶宽在三个叶位均显著不同（叶1–3分别为p = 0.010、0.004和0.011），两制剂均超过对照；叶长在叶位1和2不同（p = 0.025和<0.001），叶位3不同不显著（p = 0.100）；株高无处理间差异，假茎周长和直径（相关的假茎围度度量，一并解读）亦无（p = 0.065、0.280和0.092）。鲜重处理间显著不同（F(2,24) = 5.76，p = 0.009）：茜草NC达99.30 ± 3.93 g，对照85.30 ± 1.94 g，增16.4%（Tukey HSD p = 0.007）；干重则不受影响（p = 0.213），故较高鲜重与较高组织含水量一致，而非结构生物量积累。

讨论部分总结：4.1 体外抗真菌活性与有效浓度——COS基NC在体外对Foc STR4和TR4均显示显著抗真菌活性，EC50为320.0–571.7 μg·mL^?1（相当于49.7–126.9 μg·mL^?1提取物）。研究人员汇编近期壳聚糖制剂和植物提取物对镰刀菌属的比较效力数据（表A1）：壳聚糖基系统因分子量、乙酰化度和制剂策略不同效力差异很大，壳聚糖溶液对Fusarium solani (Mart.) Sacc.的MIC90通常为3 mg·mL^?1，纳米颗粒制剂MIC为0.5–1.2 mg·mL^?1；对Fusarium graminearum Schwabe，壳聚糖聚合物（乙酰化度DA = 10%；聚合度DPn = 90）IC50低于50 μg·mL^?1、MIC约100 μg·mL^?1，部分乙酰化COS活性较弱、IC50超过100 μg·mL^?1；壳聚糖聚合物与寡糖的协同组合可在单组分活性极低的浓度下完全抑制生长。植物提取物对镰刀菌属的效力跨数个数量级（表A1），从高效粗提物（Millettia grandis (E.Mey.) Skeels MIC = 10 μg·mL^?1）到需≥1000 μg·mL^?1才有明显抑制的制剂；植物提取物文献中极少专门针对Foc STR4或TR4，直接比较困难。本研究的EC50（以包封提取物计49.7–126.9 μg·mL^?1）使COS基NC制剂处于粗提或半纯化天然产物制剂的上部效力区间。本研究无法与未配制壳聚糖（溶液中MIC通常3000 μg·mL^?1）或粗植物提取物比较，因二者均未在此测定；本研究仅评估两种完整载药制剂，未纳入游离提取物、空载体、游离COS及负载两种提取物的匹配载体基质，故不能从这些数据估计纳米包封或任一制剂组分的贡献；这些载体系统早期研究报道了载药制剂与相应未配制提取物对其他植物病原体的差异，为将载药制剂推进至此提供依据；同样两种制剂此后在葡萄针对Botrytis cinerea Pers.的重复田间试验中与相应游离提取物及商业壳聚糖比较，纳米包封使体外完全抑制所需提取物浓度降低1.8–6.7倍，并将灰霉严重度从未处理对照的80%降至18–25%（游离提取物和壳聚糖为35–40%）；两条证据均含游离提取物比较，但来自其他病理系统，不能转移至Foc或香蕉。需用适当制剂对照检验的机制包括：（i）保护生物活性化合物免于快速降解；（ii）持续释放动力学实现与靶真菌的延长接触；（iii）通过NC介导递送改善细胞摄取；（iv）壳聚糖载体基质与包封植物化学物间的协同相互作用（如Attjioui等对壳聚糖聚合物-寡糖组合的记载）；g-C₃N₄和羟基磷灰石掺入载体基质是否通过包封效率或pH响应释放进一步贡献效力，同样有待确定。所观察活性可能反映含COS载体和包封提取物的共同贡献，但本研究未检验协同；既往研究表明COS与猫爪草提取物结合产生4.67–8.87的协同因子（取决于靶病原），即组合比加性效应预测有效5–9倍；该协同通过互补机制运作：壳聚糖聚合物在胞外破坏真菌细胞壁和膜，促进寡聚体和生物活性化合物摄取，后者继而发挥胞内效应，可能与蛋白质或核酸相互作用扰乱代谢平衡；COS-茜草结合物对B. cinerea和Phytophthora cactorum (Lebert & Cohn) J. Schr?t.的协同因子分别达5.17和4.67，归因于蒽醌增强膜透化与壳聚糖直接抗微生物效应的结合。值得注意的是，COS-HAp-g-C₃N₄-猫爪草NC对TR4的EC50名义上低于COS-g-C₃N₄-茜草NC（320.0 vs. 347.2 μg·mL^?1，bootstrap对比不支持该差异），但在单次植株试验运行中未显示可比的病害对比（见4.3节）；这说明源自静态体外试验（测量单终点生长抑制）的EC50未捕捉抗真菌活性的动力学维度（即杀菌速度）；其是否与单次施用结果相关，是本设计无法检验的假设。本研究观察到的小种间差异易感性（TR4的EC50低37–44%）与TR4更高田间毒力的预期相矛盾；该悖论在其他体外研究中已有指出，可能反映致病性的多因素性质，即田间毒力不仅取决于内在抗真菌抗性，还取决于寄主定殖效率、毒力因子产生和逃避植物免疫的能力。为将数值置于实际背景，平行测定了Foc对fosetyl-Al（仍可用于维管束萎蔫病管理的少数活性物质之一）的敏感性，但为分开试验、STR4于5 dpi、TR4于6 dpi读数（表4）；在特定体外试验条件下，两制剂对TR4分离株的EC50均低于fosetyl-Al（320.0和347.2 vs. 960.7 μg·mL^?1），而对STR4则fosetyl-Al最低（383.9 vs. 552.7–571.7 μg·mL^?1）；两类活性物质对小种排序相反：检疫关注度最高的TR4对有机膦酸酯EC50更高、对载药NC更低；研究人员将此作为观察而非两类处理分子靶标不同的证据，因fosetyl-Al试验对小种读数日不同且TR4对照已达平板边缘，而NC试验两小种均于6 d读数；两点需缓和该比较：第一，NC的EC50指制剂总质量，其中仅14.3%（茜草）或22.2%（猫爪草）为包封提取物，故以提取物计效力差异大得多；第二，fosetyl-Al已知主要通过刺激寄主防御反应和在植株内释放膦酸酯间接起作用，其体外活性低估植株内表现，故该比较应作为体外基准而非相对田间效力的预测；在植株试验中纳入化学标准将增强该基准，建议未来工作采用。4.2 时间-杀菌动力学与可回收活力谱——两制剂在可回收活力丧失速率上不同。COS-g-C₃N₄-茜草NC在24 h内使活菌计数降至0.43 log₁₀ CFU·mL^?1（两管中一管回收单菌落），3000 μg·mL^?1下48或72 h两小种均未回收到菌落；因试验仅用单一浓度、每组合两独立管、无经验证的中和或洗涤步骤，且每个零值受该取样时点涂布检测限约束，这些观察描述可回收活力丧失的动力学，不确立杀菌作用。抗微生物肽对F. solani曾报道同量级的下降速率（4 h降低85.87%、24 h降低99%，通过膜透化和ROS产生）。茜草蒽醌（主要为茜素和红紫素）据报道在真菌中通过多种同时机制起作用：下调菌丝特异基因、抑制酵母向菌丝转变和生物膜形成、线粒体膜去极化，活性需C-1和C-2位游离邻羟基；本研究未测定这些机制，且证据来自Candida albicans而非Foc，总结于附录B。COS-HAp-g-C₃N₄-猫爪草NC降低活菌计数较慢，72 h两小种仍回收到菌落、密度接近检测限；在测试条件下，可回收活力的丧失较茜草制剂更慢、更不完全，这即是该试验所确立的全部内容。关于猫爪草抗微生物活性涉及吲哚生物碱、喹诺酸糖苷和多酚共同作用的报道与较慢下降一致，但本研究数据未确定作用方式。可回收群体下降速率的差异可能对病害防治有意义，因为留下存活者的处理在该化合物不再存在时允许群体重建，且仅抑制生长的化合物须持续存在才能保持有效；其是否与4.3节讨论的单次施用植株结果相关，无法从每条件两管的试验判定。4.3 分歧的植株结果及其候选解释——两制剂在植株中产生截然不同的结果，尽管EC50不可区分，须首先说明设计能作与不能作何判断。COS-g-C₃N₄-茜草与COS-HAp-g-C₃N₄-猫爪草至少在五方面同时不同：提取物身份；载体组成（一含羟基磷灰石、一不含）；粒径（强度加权峰相差约2.5倍，见3.1节）；提取物载量（14.3% vs. 22.2% w/w，使名义相等剂量3000 μg·mL^?1分别递送429和666 μg·mL^?1提取物）；以及包封和释放效率。设计未纳入游离提取物、空载体、游离COS及匹配载体比较（2.4.4节）；上述任一差异或其交互均可能解释分歧的植株结果，本试验未分离任何一项；下文指出候选解释而非在它们之间检验；然而五项之一与观察结果相反而非相符：减轻病害的制剂比未减轻者递送的提取物少36%。对Foc TR4的生物试验显示，COS-g-C₃N₄-茜草处理在本次单次运行中、11–79 dpi监测期内SAUDPC较接种对照低34.9%（Kruskal–Wallis H(2) = 7.63，p = 0.022；Dunn p = 0.021；Cliff's δ = ?0.68，95% CI ?1.00至?0.21），而COS-HAp-g-C₃N₄-猫爪草则否（名义7.8%降低；Dunn p = 1.000），故可比的体外效力未转化为可比的病害控制；观察模式仅对一种制剂与第二假设一致。将该数值置于背景比看起来更难：替代合成杀菌剂对该病害的已报道防效跨越从无效到逾80%控制的整个范围，且研究在病原小种、分离株、接种压力、寄主阶段、施用方案和评估期上不同；最接近的可比基准是单次施用木霉盆栽试验，其在45–90 dpi达43–72%控制；本记录的34.9%低于该范围，即便该比较也受上述差异限制；处于更广已发表效力范围上端的芽孢杆菌处理和需连续施用两三年才出现抑制的生物有机肥方案，与单次浸根完全不可比；最重要的是，本生长箱试验未纳入阳性参考处理，故该数值无内部基准；该遗漏连同单次运行和每处理单托盘，而非文献异质性，是差异幅度尚不能判断或视为实验验证的原因。杀菌剂使用也是Foc综合管理方案的组成部分；唑类杀菌剂（prochloraz、propiconazole、cyproconazole）和有机膦酸酯fosetyl-Al在受控条件下可将病害严重度降低至多80%，苯并咪唑类（benomyl、carbendazim、thiabendazole）在500 ppm下体外完全抑制菌丝生长，但植株内效力在各地区和菌株间不一致；重要的是，化学杀菌剂观察到的高体外-植株内效力差距与本研究猫爪草NC的模式平行，强化了体外效力本身不足以预测对维管束萎蔫病原田间表现的原则；此外，若干此类活性物质在欧洲面临日益增加的法规限制：carbendazim于2015年在欧盟被禁用，propiconazole于2019年未获续期，逐步限制生产者可用的化学工具箱；就西班牙具体情况而言，无合成杀菌剂获准用于香蕉植株防治FWB：在现行香蕉授权产品登记中，azoxystrobin和thiabendazole仅作为采后处理用于包装车间防治储藏病害，唯一获准田间施用的常规杀菌剂是硫磺（登记用于白粉病和螨类），进一步限制化学选择并凸显替代管理工具的必要性，即使其单项效力低于常规杀菌剂；综合管理方法结合多种策略通常改善控制，一些田间和温室研究报告病害降低超过50%。茜草（34.9% SAUDPC降低，p = 0.021）与猫爪草（无显著病害降低）制剂在植株内的对比结果，尽管二者均显示显著体外活性，凸显了在逐步更真实的控制环境系统以及温室和田间试验中验证候选处理的必要性，并说明体外抗真菌效力与体内效力之间众所周知的差距。若干因素可能与该差异相关，本设计均未分离：第一，两制剂在时间-杀菌谱上差异明显，茜草制剂自48 h起未回收到菌落；第二，NC组成差异（COS-g-C₃N₄ vs. COS-HAp-g-C₃N₄）可能影响植株内摄取效率或释放动力学；第三，对照与猫爪草处理植株间（表7）或与茜草处理组间未检出气孔导度差异，故不支持药害解释。猫爪草制剂无病害控制的一个候选解释是时间-杀菌试验（每条件两管）记录的较慢且不完全的可回收活力丧失，因单次浸根施用不会维持持续的根际存在；施用方案也可能有利于快速起效化合物：制剂以2 min浸根施用，植株移栽后2 h将孢子悬液灌入盆中，故茜草制剂与Foc首先在根表和周围基质相遇，且无后续施用补充制剂；其保留的任何活性因此须在其存在期间发挥，而该期间未测量，而两种制剂在液体培养中均需24–48 h才丧失可回收活力（表2）；相反，较慢降低活菌计数的制剂预期需要持续存在以阻止病原重建，因生长通常在生长抑制因子从环境移除后恢复；故单次浸根可能无法随时间维持抑制浓度；此外，作物中杀菌剂效力众所周知取决于剂量、次数和施用时机而非仅内在体外效力，故施用方案和时间-杀菌行为可能与分歧结果相关，作为本设计无法与制剂其他差异或内在体外效力差异分离的一个候选解释。一项结果须单独陈述，因其约束该方法应如何定位：各接种组（含茜草组）发病率均保持100%（表6）；茜草制剂减缓病害进展并与较低死亡率相关，但未在任何挑战植株中阻止可见病害；故此类单次浸根是综合方案的候选组分，作用于病害发展的速率和严重度，而非保护剂；它须与减少接种体或阻断侵染的措施结合，其价值取决于较慢的流行是否在田间接种压力下转化为保留产量，本试验无法解决。总之，这些观察提示假设而非确立机制；研究人员将其命名为杀菌速率假设：对此类单次施用制剂（其根际持久性可能有限，尽管此处未测量），可存活繁殖体不再可回收的速率（此处称杀菌速率）对植株内表现的约束比EC50所测单终点效力更紧；本研究无法检验它，仅作为需独立实验验证的假设提出：时间-杀菌试验每条件两管，植株比较为单次运行且与托盘和批次混杂，故这些数据未确立活力丧失速率与植株结果间的关系；两种在提取物身份、载体组成、粒径、提取物载量和释放行为上不同的制剂提供一个与假设一致的观察，而非对其的检验；检验需要一组在匹配EC50下跨越杀菌速率范围的制剂（最直接为单一载体基质负载多种提取物，或单一提取物多种载量），体外与植株内平行测定，并设制剂和赋形剂对照及独立重复。壳聚糖基NC对镰刀菌萎蔫病的效应可能由若干在不同空间和时间尺度上运作的机制支撑；本研究未测定任何一项，下文列出以确定须检验什么。直接抗真菌活性：包封生物活性化合物可发挥直接杀真菌效应，茜草蒽醌产生ROS、破坏线粒体功能、抑制麦角固醇生物合成并损害细胞壁完整性，猫爪草生物碱和多酚通过多靶标干扰真菌代谢；载体是否通过保护化合物免于降解、随时间释放或促进其渗透进入植物组织或真菌细胞而改变这些直接效应，此处未检验，且无2.4.4节所列制剂对照无法检验。植物防御诱抗：壳聚糖寡聚体是植物诱导抗性的公认诱抗剂，通过模式识别受体起作用，壳聚糖施用于香蕉根据报道可局部和系统触发水杨酸生物合成；本研究未测定任何防御标志、转录本或激素，故该文献为制剂提供理据而非对本报告结果的解释；所涉信号通路和防御基因总结于附录B。处理香蕉植株中升高的类黄酮和花青素指数（表8）表明处理相关的表皮酚类积累变化；因DUALEX提供光学指数而非直接生化测量，且测量于终收期仅在非接种植株，这些数据不证明植物防御的激活或 priming，也不能是病害效应的机制：类黄酮响应在两制剂幅度相似（高于对照97%和79%），包括无病害控制的猫爪草制剂，故有效和无效处理共有的响应不能解释二者差异；处理植株降低的NBI值（51.5–58.2 vs. 对照117.5）在叶绿素指数不变时由类黄酮指数增加算术推出，因NBI为二者之比；其是否反映资源向防御代谢的再分配，需靶向代谢物和基因表达数据。定位与释放：悬而未决的问题——浸根可能有利于NC黏附于根表并经移栽时形成的天然开口或伤口摄取；壳聚糖纳米颗粒可被根吸收并转运至维管组织、粒径和表面电荷影响摄取动力学的证据总结于附录B；然而，无示踪研究或组织分析确认NC在香蕉根中的摄取和分布，确切作用机制仍部分推测；三种非互斥情形可能：（i）NC主要留在根际，对土传接种体发挥抗真菌效应；（ii）NC被根摄取并系统转运，在Foc定殖的维管组织中释放生物活性化合物；（iii）NC从根区诱导系统防御反应赋予全株抗性；区分这些可能需未来用荧光标记NC、组织切片和显微分析NC在根、根茎和假茎中的分布。壳聚糖寡聚体基质预期提供两种功能：（i）保护包封提取物免于在基质中快速降解或淋失；（ii）随时间控制释放生物活性化合物；其pH响应行为相关：在Foc分泌有机酸形成的酸性环境（pH 4.5–5.5）中，壳聚糖质子化促进基质部分溶解和结构松散，原则上可促进优先释放提取物；本研究未测量基质降解、释放动力学和纳米载体定位，故生物活性物在侵染部位的局部触发释放仍是假设而非这些载体的已证特性。4.4 生理与生长响应——在无病原时，两处理组若干生长测量较高，茜草NC处理植株鲜重较对照增16.4%；干重处理间无差异，故鲜重增加表明组织含水量提高而非结构生物量积累；因测量于非接种植株单次收获，其与病害结果无关。以植株为观测单位的生理测量指向有限且高度局部的处理效应：叶绿素荧光唯一显著差异出现在中间叶位，猫爪草NC植株ΦPSII（0.390 ± 0.034 vs. 0.500 ± 0.018）和ETR（48.0 ± 4.2 vs. 60.2 ± 2.0 μmol·m^?2·s^?1）低于对照，茜草NC居中且与二者无差异；三个叶位中一个显著、两个近共线参数、未校正探索性族内，是处理对光化学影响的弱证据，不作进一步解读。每叶四读数平均至植株水平后，各叶位均未检出对气孔导度、总导度或表观蒸腾的处理效应（表7）；各组绝对値很低，茜草NC组处理均值略呈负值（物理上不可能），表明porometer在该测量条件下处于或低于其检测限；故本试验中任何气孔行为解读均无根据；需在使导度保持于仪器工作范围内的条件下进行专门气体交换试验，以确定制剂是否改变气孔开度；该组唯一达显著的变量是最老叶位的叶-气水汽压亏缺，猫爪草NC植株高于对照或茜草NC处理。两处理组叶类黄酮含量近倍增（茜草和猫爪草制剂分别增97%和79%）及茜草NC处理植株花青素增37%，代表叶酚类组成的显著且一致转变；三个叶位叶绿素未变，故处理植株NBI急剧下降（51.5–58.2 vs. 对照117.5）是类黄酮积累的直接结果，因NBI为叶绿素与类黄酮之比；该响应组合（类黄酮和花青素升高、叶绿素不变）与向次生代谢转变一致，但记录于终收期非接种植株（无病害可抑制），且在无病害控制的制剂中幅度相似，故不能与茜草处理的病害结果相关联；DUALEX指数无论如何是叶组成的先光学代理，机制确认需靶向生化和转录分析。猫爪草NC记录的较大叶尺寸（表9）与其未能抑制病害（表6）结合，表明在测试方案下该制剂作用于植株生长而非病害；这与体外记录的较慢可回收活力丧失一致（单次浸根暴露不会随时间维持抑制浓度），尽管设计不能确立该联系。茜草NC制剂将显著的叶类黄酮和花青素积累与减缓的病害进展相结合，但类黄酮响应与无效制剂共有，花青素差异是相对对照的单一未校正比较、未证明两制剂间差异；这些是终收期非接种植株的光学指数，不能解释不同接种植株中记录的病害对比。79天控制环境试验中测试浓度下未检出可见药害症状；香蕉植株全程保持正常色泽、组织完整性和结构发育，未检出生物量降低，叶绿素指数不受影响；该定性观察不确立总体植物、环境或食物链安全，需在额外剂量、暴露期、发育阶段和生产条件下确认；此处记录的鲜重和叶尺寸响应（两NC的叶宽和叶长、茜草NC植株鲜重）与壳聚糖寡聚体报道的促生长特性一致；在玉米中，壳聚糖与促生根际细菌结合使种子活力指数增36.44%、地上部重增65.67%、地上生物量增84.66%；铜-壳聚糖NP施用于香蕉增加株高、叶数和串重，同时抑制镰刀菌萎蔫病；壳聚糖NP在胁迫条件下显著增加香蕉植株鲜重和干重。4.5 在综合管理中的潜在作用——在镰刀菌萎蔫病综合管理框架内，递送天然抗微生物物的COS基NC是与现有实践互补的途径而非独立解决方案；茜草NC在单次生长箱运行中观察到的34.9%病害进展差异低于单次施用木霉处理的报道范围，且因4.3节所述原因不能与多数已发表生物防治效力直接比较；壳聚糖在欧盟作为基础物质获批并不延伸至此处测试的制剂（含g-C₃N₄和羟基磷灰石的工程纳米复合材料）；此类材料不属于基础物质途径，其使用需制剂特异的法规、环境归趋和生态毒理学评估；欧盟若干活性成分的逐步撤销缩小了香蕉病害管理可用的化学选择范围，这是寻找替代品的理由，而非这些制剂接近授权的证据。单次浸根后79天观察期内较低的病害进展值得研究制剂持久性（此处未测量）；单次施用后仍有效的处理将减少多数生物防治剂所需的重复施用；壳聚糖NC预期的控释行为特别适合靶向Foc，因病原分泌组含壳聚糖酶（TR4中记载GH75壳聚糖酶，1和4号小种分泌组中表征了碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes, CAZymes））；这些病原产生的几丁质分解酶提供了可检验假设，即它们可能促进侵染部位附近壳聚糖基质的降解；本研究未测量基质降解或货物释放，故不能就侵染部位特异释放作结论；量化制剂在Foc酶存在与不存在下的降解、追踪纳米载体植株内定位，是未来工作优先事项；完整制剂的生态毒理学特征此处未评估；壳聚糖本身由普遍存在的几丁质分解土壤微生物降解。本研究观察到的病害对比幅度提示，NC处理在重病土或高接种压力下作为独立干预不太可能提供足够病害控制；然而，其与其他管理实践（抗/耐品种、生物防治剂、有机质、硅和钙等土壤改良及卫生规程）的整合可能实现超过单组分的协同抑制；壳聚糖与Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare & W.Gams共聚物结合的综合方法研究显示较单独生物防治剂增强的效力，支持该假设；这些NC系统与生物防治生物制剂的兼容性尤其有前景，因壳聚糖在某些系统中已显示增强有益微生物的定殖。经济可行性将决定此类制剂能否被采用：壳聚糖和g-C₃N₄规模化生产成本低，而制剂、质量控制和分销需投资和技术能力，在小农主导系统中可能是障碍；指示性成本及应对该障碍的途径见附录B；成本-效益评估无论如何须等待本研究未提供的效力估计。4.6 研究局限——植株试验为单次控制环境运行；每处理占一托盘并由一批新制悬液施用，故处理、托盘和批次不可分离，植株水平比较描述本次运行所观测植株而非估计批次、托盘或运行间变异，34.9%差异相应为运行内观测对比而非重复估计的防效；植株证据为初步且产生假设。设计也未纳入游离植物提取物、空纳米载体、游离COS和匹配载体基质，故纳米包封、载体和提取物的贡献不可分离；未纳入植株内阳性参考，故观察对比无内部效力基准；病原定殖未定量，故不能区分定殖减少与耐受性增加。生理和生长变量为终收期在非接种植株测得的次要、探索性结果，未作多重性校正；导度和蒸腾读数低于porometer可靠量化范围。体外方面，时间-杀菌试验每条件两独立管，不足以估计管间变异，故两制剂间活力动力学差异为描述性、需更多独立重复确认。制剂在本试验所用材料上仅部分表征：包封和释放效率为这些载体系统此前报道值，粒径以动态光散射在每制剂单次制备0.45 μm过滤后测定，故仅描述可滤过部分。控制环境条件不能复现决定田间表现的土壤化学、水分动态、微生物活性和温度波动。4.7 未来方向——当务之急是独立重复试验：每制剂多批独立制备悬液，施用于独立分配的托盘并跨运行重复，连同游离提取物、空载体和匹配载体对照、植株内阳性参考及通过再分离或qPCR定量病原定殖。此外，剂量-反应和施用时机研究、替代递送途径（如土壤灌施或滴灌施肥）、制剂持久性测量及对有益土壤微生物群影响的测量，以及跨农业生态区和栽培系统的田间验证，均为确立实用性的必要工作；两种制剂已在葡萄商业田间条件下施用，无可见药害或对产量组分的影响，提示其田间试验可行；毒理学评估、环境归趋研究和适当质量控制程序是此类制剂商业开发的基本前提，符合纳米农药的科学要求和欧盟植物保护产品法规框架。

结论翻译：两种完整COS基制剂均在体外抑制Foc STR4和TR4，EC50为320.0–571.7 μg·mL^?1，在同一小种内二者效力无差异；故第一假设对两制剂和两小种均获支持。在植株中，观察模式仅对一种制剂与第二假设一致。在单次控制环境运行中，单次浸根施用茜草载药制剂使标准化病害进展曲线下面积较接种对照低34.9%，9株中2株死亡对9株中6株死亡，而猫爪草载药制剂使同一指标降低7.8%，该差异无法与该对照区分。各接种组发病率均保持100%，故病害进展被减缓，但未在任何挑战植株中阻止可见病害。这些植株发现来自单次运行，每处理一托盘和一批次施用，且无游离提取物、空载体或游离COS对照，故34.9%差异是运行内观测对比而非重复估计的防效，制剂任何组分均不能归功于此。茜草载药制剂是推进至4.7节所述独立重复试验的候选制剂。