可编程DNA-丝蛋白水凝胶：具备时间可控的机械强化功能，可用于间充质干细胞的分化及加速伤口愈合

《iScience》：Programmable DNA-Silk hydrogel with temporal mechanical reinforcement for mesenchymal stem cell differentiation and accelerated wound healing

　　亮点：
- 具有时间性机械增强的DNA-丝素纤维蛋白水凝胶
- 一种一体成型组装水凝胶，具有优异的稳定性和生物相容性
- DNA-丝素纤维蛋白水凝胶促进成骨和成软骨分化
- DNA-丝素纤维蛋白水凝胶提供快速止血并加速伤口愈合

摘要：
基于DNA的水凝胶因其可编程性、生物相容性和可调功能而在生物医学应用中受到了广泛关注。然而，由于其高昂的合成成本、有限的机械强度、较差的稳定性和复杂的合成工艺，其在临床应用中的推广受到了阻碍。我们提出了一种DNA-丝素纤维蛋白混合水凝胶，通过结合DNA的生物功能性和丝素纤维蛋白的优异的生物力学特性，克服了这些限制。使用丰富且低成本的鲑鱼来源DNA，通过简单且可扩展的工艺与丝素纤维蛋白结合形成混合网络。所开发的水凝胶表现出时间性机械增强和延长的稳定性，体外研究表明该水凝胶能够增强间充质干细胞的成软骨和成骨分化能力。此外，止血和体内实验表明这种DNA-丝素纤维蛋白水凝胶作为快速止血和加速伤口愈合的生物材料具有潜力。总体而言，DNA-丝素纤维蛋白混合水凝胶为间充质组织工程、止血辅助和伤口愈合提供了一个平台。

引言：
DNA是一种天然选择的遗传信息载体生物聚合物，现在被认为是一种重要的结构材料，因为它在基因组和分子水平上都具有很高的可修饰性。如今，利用DNA带负电荷的糖-磷酸骨架的水合性和可预测的沃森-克里克碱基配对技术，已经开发出具有复杂结构、固有可编程性、生物相容性和响应刺激能力的3D交联自组装DNA水凝胶，广泛应用于药物递送、基因治疗、生物传感、伤口愈合、组织工程和3D细胞培养等领域。然而，尽管取得了显著进展并具有广泛的应用潜力，基于DNA的水凝胶仍存在一些主要限制，这些限制阻碍了其在生物医学、生物传感、环境和组织工程领域的广泛应用。其中一个主要限制是DNA合成的高成本。由于水凝胶需要大量的聚合物含量来保持水分和维持网络结构，因此通常需要毫克的DNA，这使得大规模生产变得昂贵。当使用精确序列或化学修饰来开发自组装水凝胶时，成本进一步增加。另一个主要限制是DNA水凝胶的机械强度和稳定性较差，这在用于伤口愈合和组织工程等应用时尤为明显。由于DNA的固有结构特性，这些水凝胶往往表现出低刚度和弱的韧性，限制了其在承载应用中的使用。然而，在生理条件下DNA水凝胶的稳定性是最令人关注的问题。在生物环境中，DNA水凝胶的细胞和酶降解通常会导致其快速降解和功能丧失，操作寿命只有几小时。此外，在添加血清的细胞培养基中，DNA水凝胶也会迅速降解。因此，尽管基于DNA的水凝胶具有独特的材料设计潜力，但其目前的局限性仍然存在，必须解决这些问题才能实现其广泛的实际应用。

为了解决基于DNA的水凝胶的上述限制，一种有前景的方法是开发混合水凝胶，在这种水凝胶中，DNA与其他聚合物结合使用，以提供机械强度、化学多样性和改进的稳定性，同时保留DNA的固有优势。为此，我们成功开发了一种具有优异机械性能、更高稳定性、易于合成和低成本合成的DNA-丝素纤维蛋白混合水凝胶。为了降低与DNA合成相关的成本，我们使用了丰富的鲑鱼DNA，从而使水凝胶具有成本效益，并能够扩大临床应用的规模。我们选择丝素纤维蛋白作为水凝胶的支架，因为丝素纤维蛋白是一种天然聚合物，具有出色的生物相容性、可控的降解性和优异的机械性能。丝素纤维蛋白的加入提供了结构增强，而相互连接的DNA-丝素网络减少了DNA的快速降解。为了评估其生物医学潜力，该水凝胶被作为间充质干细胞向软骨和骨组织分化的支架进行了研究。此外，考虑到DNA在中性粒细胞凝块形成中的作用，该水凝胶还被评估为伤口愈合的止血材料。总体而言，我们提出的DNA-丝素纤维蛋白混合生物材料克服了纯基于DNA材料的主要限制，为间充质细胞分化、快速止血和伤口愈合等应用提供了可能策略。

结果：
**DNA-丝素纤维蛋白水凝胶的合成和形态学表征**
DNA-丝素纤维蛋白水凝胶的合成通过简单的一体成型工艺实现（图2A）。首先，从B. mori茧中提取丝素纤维蛋白溶液，将鲑鱼睾丸中的DNA溶解在无核酸酶的水中。然后将DNA以不同比例与丝素纤维蛋白溶液混合，形成水凝胶预凝胶溶液（表1）。不含丝素纤维蛋白的纯DNA溶液作为DNA对照（1.5G），不含DNA的纯丝素纤维蛋白溶液作为丝素纤维蛋白对照（2S和4S）。鲑鱼精子DNA的浓度保持在1.5%（w/v），因为低于1.5%（w/v）的浓度会导致纯DNA水凝胶的机械完整性不足和结构稳定性差。在1.5%（w/v）的鲑鱼精子DNA浓度下，我们获得了适合研究的适当刚度的水凝胶，尽管增加DNA浓度可以进一步提高凝胶的刚度和机械强度，但高含量的DNA会显著增加材料成本，并可能在凝胶分解后产生过多的核酸降解产物，从而对细胞反应产生负面影响。因此，我们将浓度维持在1.5%（w/v）。丝素纤维蛋白的浓度分别取为2%（w/v）和4%（w/v），因为这两种浓度都产生了适合伤口愈合和间充质分化研究的适当机械强度的水凝胶。此外，丝素纤维蛋白浓度超过4%（w/v）可能会导致以丝素纤维蛋白为主的网络，可能掩盖DNA的结构和生物学贡献。

**交联和超分子网络的形成**
通过将水凝胶预凝胶溶液加热到93°C来实现DNA链之间的交联和超分子网络的形成。这种高温处理会破坏碱基对之间的氢键，使DNA变为单链状态。然后迅速将单链DNA冷却至37°C以促进非特异性碱基配对，从而导致快速的凝胶形成。这种非特异性交联在15分钟内形成了缠结的丝素纤维蛋白聚合物网络。然而，初始DNA-丝素水凝胶的透明溶液表明其中的丝素纤维蛋白链仍处于随机卷曲形态，尚未转变为β-折叠结构。48小时后，DNA-丝素水凝胶开始变得半透明，表明丝素纤维蛋白链发生了显著的β-折叠转变（图2B）。丝素纤维蛋白从随机卷曲到β-折叠的转变通常需要一个月的时间，这可以归因于合成过程中丝素纤维蛋白的高温暴露和随后的交联，这种交联限制并使丝素纤维蛋白链聚集在一起，从而实现β-折叠转变。为了确认DNA-丝素水凝胶中β-折叠的形成，我们在第3天分析了1600–1700 cm?1范围内的FTIR峰（图S1）。观察到一个特征峰位于1623 cm?1，这与β-折叠相关，表明DNA-丝素水凝胶中的丝素纤维蛋白发生了β-折叠转变（图2C）。为了进一步观察DNA-丝素水凝胶的形态和结构，我们拍摄了在37°C下保存5天的水凝胶的SEM显微照片（图2D）。观察到1.5D2S和1.5D4S水凝胶都具有高度多孔的结构，其中1.5D2S和1.5D4S水凝胶的孔径分别为87.66 ± 20.85 μm和60.13 ± 16.22 μm（图2E）。这些观察结果表明，随着水凝胶中丝素纤维蛋白浓度的增加，水凝胶的孔径减小。相比之下，纯DNA水凝胶在表面呈现相互连接的纤维网络，底部形成致密的薄膜结构，孔隙很少。这种相互连接的纤维网络可能是由于合成过程中DNA链的交联造成的，证实了DNA链的非特异性交联导致了超分子网络的形成。然而，在DNA-丝素水凝胶中并未观察到这种相互连接的纤维网络；相反，观察到的是高度多孔的结构，这表明丝素纤维蛋白作为分子支架，改变了DNA水凝胶的纤维结构为多孔结构。

**DNA-丝素纤维蛋白水凝胶的化学和机械表征**
为了进一步了解DNA-丝素纤维蛋白水凝胶在分子水平上的形成机制，我们对DNA、丝素纤维蛋白和DNA-丝素纤维蛋白水凝胶进行了FTIR分析。DNA水凝胶的特征FTIR光谱在1050 cm?1和1220 cm?1处显示出相应的DNA磷酸骨架（POC/PO2?）振动峰（图3A）。此外，3200–3400 cm?1范围内的宽带以及1650 cm?1处的峰分别对应于DNA碱基和糖的OH和NH伸缩，以及核苷碱基中的C=O和C=N伸缩，证实了DNA成分（磷酸、糖和碱基）的存在。同样，在丝素纤维蛋白的情况下也观察到了蛋白质的特征FTIR光谱，其特征峰分别在1625 cm?1、1527 cm?1和1230 cm?1，分别对应于酰胺I、酰胺II和酰胺III。然而，在DNA-丝素纤维蛋白中（两种成分的混合物），观察到了几个显著的变化（表2）。首先，在DNA-丝素纤维蛋白中观察到了DNA和丝素纤维蛋白的复合峰，表明水凝胶包含完全交织且均匀的DNA和丝素纤维蛋白混合物。此外，在3283 cm?1附近观察到OH/NH伸缩的宽化，表明DNA的磷酸基团与丝素的酰胺NH基团之间可能存在更强的氢键相互作用（图S2A）。同样，在DNA-丝素纤维蛋白中，磷酸伸缩峰（1053 cm?1）略有偏移和宽化，这可能表明DNA与丝素纤维蛋白之间存在静电相互作用（图S2B和S2C）。另外，酰胺I（减弱、略微偏移）和酰胺II（强度降低）峰的变化表明丝素纤维蛋白的β-折叠结构可能由于与DNA的相互作用而部分破坏或发生构象变化（图S2D）。总体而言，FTIR数据验证了DNA-丝素纤维蛋白水凝胶的成功形成，并提供了强有力的证据，表明存在非共价相互作用（如氢键和静电吸引），这些相互作用导致了部分结构重组，形成了稳定的混合材料。

**结论**
DNA-丝素纤维蛋白混合水凝胶为间充质组织工程、止血辅助和伤口愈合等应用提供了平台，克服了基于DNA材料的主要限制，为这些应用的有效利用提供了可能策略。虚线代表与波数相关的相应官能团。(B) 对开发的DNA-丝素蛋白水凝胶的流变性质进行时间依赖性分析。(C) 利用频率扫描和振幅扫描比较第5天孵化的纯DNA水凝胶（1.5D）和DNA-丝素蛋白水凝胶（1.5D2S和1.5D4S）的流变性质。所有实验均独立进行了三次（n = 3）。

光谱特征
水凝胶的变化
解释
-OH/N-H伸缩（约3283 cm?1）
变宽
DNA与丝素之间的氢键增强

酰胺I（约1623 cm?1）
减弱，轻微移动
丝素β-折叠结构的破坏

酰胺II（约1527 cm?1）
强度降低
丝素二级结构改变

磷酸伸缩（1000–1250 cm?1）
变宽，轻微移动
静电/H-键相互作用

整体峰尖锐度
降低
融合成新的水凝胶网络

表2
DNA-丝素蛋白水凝胶的FTIR光谱变化及其解释

为了进一步了解丝素蛋白的加入对DNA-丝素蛋白水凝胶机械性能的影响，进行了流变学研究。由于丝素蛋白从无规卷曲构象向β-折叠构象的转变在DNA-丝素蛋白水凝胶中并非瞬间发生，而是需要几天时间，因此我们想要探究这种渐进式转变是否也会影响水凝胶的机械性能。因此，每24小时评估了一次DNA-丝素蛋白水凝胶的机械性能。我们观察到，在5天的时间内，1.5D2S和1.5D4S水凝胶的机械强度持续增加，之后没有再观察到进一步的强度增长（图3B）。两种水凝胶的储能模量（G′）都有显著提高，这表明由于加入了丝素蛋白，DNA-丝素蛋白水凝胶的交联密度增加，结构得到增强，从而提高了水凝胶的稳定性和机械坚固性。此外，通过频率和振幅扫描分析了纯DNA水凝胶和DNA-丝素水凝胶的粘弹性行为。我们发现，1.5D2S和1.5D4S水凝胶的储能模量都显著高于1.5D水凝胶，这表明在DNA网络中加入丝素蛋白可以显著提高纯DNA水凝胶的机械强度（图3C）。同时，1.5D4S水凝胶的机械增强效果比1.5D2S水凝胶更明显，说明机械增强的程度依赖于丝素蛋白的浓度；随着丝素蛋白浓度的增加，增强速率和强度也随之增加。总体而言，这些结果表明，将丝素蛋白加入纯DNA水凝胶可以克服DNA水凝胶机械强度低的限制。此外，由于DNA-丝素蛋白水凝胶中β-折叠结构的渐进式转变，形成了一种具有动态硬化的新型水凝胶。这些结果进一步扩展了DNA-丝素水凝胶的应用潜力，例如在组织工程中，DNA-丝素水凝胶可以提供时间依赖性的机械支撑，逐渐模拟再生组织（如软骨、肌肉或血管移植物）的发展强度。同样，这种水凝胶也可以用于药物输送系统，在局部释放治疗性药物的同时降低扩散速率。

总体而言，具有动态机械增强的开发水凝胶可用于各种生物应用，使其成为下一代生物材料的潜在候选者。

DNA-丝素蛋白水凝胶的降解行为
纯DNA基水凝胶的一个显著局限是其在生物物理环境中的稳定性有限。这种稳定性在体内和细胞培养基中都存在，可能是由于核酸酶对DNA链的切割以及盐诱导的DNA膨胀所致。DNA浓度较低的水凝胶特别容易受到DNase I的切割，因为它们的交联密度较低，使得DNase I更容易对其产生影响，从而导致水凝胶逐渐降解和完全溶解。尝试通过增加DNA浓度来提高交联密度可以增加其抗降解性，但会显著增加合成成本，因为需要更多的DNA。此外，高盐的存在也会导致浓缩水凝胶的不稳定，进而引发酶促降解。降解的开始与高盐诱导的DNA水凝胶膨胀有关，其中单价阳离子（如Na+和K+）会破坏浓缩结构，使DNA链暴露于酶的切割之下。大多数细胞培养基还含有胎牛血清等血清，其中包含多种核酸酶，从而导致水凝胶分解。因此，生理离子组成和核酸酶共同导致了水凝胶在体内和细胞培养条件下的不稳定性和快速降解，严重限制了DNA基水凝胶的应用。大多数研究报道了DNA水凝胶在水或PBS中的稳定性，但在这些环境中没有DNase酶，因此无法准确估计DNA水凝胶的稳定性。因此，我们研究了DNA-丝素蛋白水凝胶在PBS和细胞培养基中的降解情况。我们旨在探究DNA-丝素蛋白是否能够抵抗DNA降解，从而延长水凝胶的稳定性，特别是对于需要缓慢降解率的应用（如伤口愈合、药物输送和组织工程）。为了探讨DNA-丝素蛋白水凝胶的稳定性，将水凝胶分别与PBS和DMEM细胞培养基一起培养。在特定时间点收集PBS和DMEM细胞培养基，并测量溶液中的DNA浓度。实验结果表明，纯DNA水凝胶1.5D在PBS中非常稳定，21天内仅损失了1.6%的DNA总量（图4A）。同样，1.5D2S和1.5D4S在PBS中也表现出很高的稳定性，降解百分比与1.5D相比没有显著差异。这些结果表明，DNA水凝胶在PBS环境中非常稳定，即使PBS中含有会导致DNA网络膨胀的盐分，缺乏DNase酶对DNA降解的影响也很小。接下来，我们在含有胎牛血清的DMEM细胞培养基中测试了DNA-丝素蛋白水凝胶的稳定性，其中既含盐分也含有核酸酶。与PBS中的降解研究类似，我们将DNA-丝素蛋白水凝胶在DMEM培养基中培养，并在特定时间点收集培养基并定量DNA总量。正如预期的那样，纯DNA水凝胶（1.5D）在一天内就发生了显著的降解（图4B）。24小时后，1.5D水凝胶的DNA损失了31%，到第3天时DNA损失了近91%。然而，1.5D2S和1.5D4S在第四天时仅损失了15.53%和8.73%的DNA总量，而纯DNA水凝胶则完全溶解。此外，1.5D2S和1.5D4S在21天时仍然稳定，分别损失了70%和55%的DNA重量。与1.5D2S水凝胶相比，1.5D4S水凝胶表现出更高的稳定性，这归因于其中丝素蛋白的浓度更高。这些结果表明，将丝素蛋白引入DNA网络可以显著提高其稳定性；通过调整丝素蛋白的浓度可以控制降解速率。总体而言，DNA-丝素蛋白水凝胶克服了DNA水凝胶的稳定性限制，为需要可控降解率的DNA基混杂水凝胶的应用铺平了道路。

图4 DNA-丝素蛋白水凝胶的DNA降解研究

图注：
(A) 使用UV-Vis光谱法研究了DNA-丝素蛋白水凝胶在PBS和细胞培养基中的21天DNA降解情况。数据以平均值±标准差表示。*表示各自组内的统计显著性。***、****、********表示p < 0.05、p < 0.001和p < 0.0001，n.s.表示无显著差异。显著性使用单因素方差分析（one-way ANOVA）计算。数据点代表独立进行了三次的实验平均值（n = 3）。

DNA-丝素蛋白水凝胶的生物相容性
通过体外活/死细胞染色和MTT细胞活力测定评估了开发的DNA-丝素蛋白水凝胶的细胞相容性。活/死细胞荧光染色显示，在水凝胶培养基中培养后，绿色荧光的活细胞占主导，红色荧光的死细胞极少或没有，表明1.5D2S和1.5D4S DNA-丝素蛋白水凝胶几乎没有细胞毒性（图5A）。此外，与1.5D纯DNA水凝胶组相比，生长在DNA-丝素蛋白水凝胶上的细胞表现出延长形态和延长的伪足，表明DNA-丝素蛋白水凝胶为细胞附着和增殖提供了有利环境。MTT测定量的定量评估显示，在水凝胶培养基处理的组中，1.5D2S和1.5D4S的细胞活力在24小时和48小时后分别保持在84%以上和93%以上（图5B）。然而，在1.5D纯DNA水凝胶组中，48小时后细胞活力显著下降至60%以下。这种细胞活力下降可以归因于1.5D培养基中存在大量降解的DNA，这些DNA已知会参与活性氧的产生和细胞的应激反应。

观察到的优异细胞相容性可以归因于水凝胶的天然成分组成和不含细胞毒性渗出物，以及其水合的多孔结构，这有助于营养物质的扩散。总体而言，这些发现证实了DNA-丝素蛋白水凝胶具有出色的生物相容性，适用于需要与活细胞直接长期相互作用的生物应用，包括伤口愈合、组织工程和药物输送系统。基于这一优异的生物相容性，后续的体外实验进一步深入研究了细胞-材料相互作用，重点关注增殖、形态和延长培养时间下的功能行为。

图5 DNA-丝素蛋白水凝胶的生物相容性和体外细胞培养
(A) 在DNA-丝素蛋白水凝胶上生长的RPE-1细胞的活/死细胞染色。培养3天后，活细胞（绿色）用Calcein AM染色，死细胞（红色）用Propidium iodide (PI)染色。盖玻片上的细胞作为阳性对照（PC），乙醇处理的细胞作为阴性对照（NC）。刻度尺，250 μm。展示了每组的代表性染色图像。实验独立重复了三次（n = 3）。
(B) 使用MTT测定法对生长在水凝胶上的RPE-1细胞的细胞活力进行了定量评估。数据以平均值±标准差表示。***、****表示p < 0.01和p < 0.001，n.s.表示无显著差异。显著性使用单因素方差分析（one-way ANOVA）计算。实验独立重复了三次（n = 3）。数据点代表每次实验的六个技术重复值。
(C) 在DNA-丝素蛋白水凝胶上生长的RPE1细胞的体外细胞培养。展示了第3天和第7天通过phalloidin染色的F-actin结晶体显微镜图像，用于观察RPE细胞的生长模式。每个组的代表性染色图像。实验独立重复了三次（n = 3）。刻度尺，250 μm。

DNA-丝素蛋白水凝胶在细胞培养应用中的潜力
在之前关于DNA-丝素薄膜的研究中已经证明了DNA-丝素蛋白混合生物材料的细胞培养潜力，这类系统支持角质形成细胞的生长和存活；因此，在DNA-丝素蛋白水凝胶优异的细胞相容性基础上，我们接下来评估了该水凝胶支持细胞增殖的能力，具体是使用直接在水凝胶表面培养的人类视网膜色素上皮（RPE1）细胞。细胞以25,000细胞/cm2的密度接种，并在标准培养条件（37°C，5% CO2）下培养3天和7天，每2天更换一次培养基。为了观察细胞骨架的排列，细胞被固定并用phalloidin染色以标记丝状肌动蛋白（F-actin），然后使用共聚焦显微镜成像。我们观察到1.5D2S和1.5D4S水凝胶上RPE1细胞形成了密集且相互连接的网络，表明DNA-丝素蛋白水凝胶促进了广泛的肌动蛋白细胞骨架组织，细胞的伪足跨越水凝胶表面形成网络状图案（图5C）。相比之下，纯DNA水凝胶（1.5D对照）上无法生长细胞，因为细胞培养基中的DNA在2天内过度降解，导致细胞毒性和死亡。共聚焦显微镜图像进一步表明，RPE1细胞紧密附着在水凝胶上，广泛扩散，并建立了强大的细胞-水凝胶相互作用。连续且广泛的肌动蛋白丰富区域的存在进一步暗示了细胞骨架的完整性和强大的焦点黏附复合体，这对于细胞增殖和功能至关重要。总体而言，DNA-丝素纤维蛋白水凝胶作为一种有前景的支架材料，可用于细胞培养应用，可以用来维持、增殖甚至分化细胞。

在观察到DNA-丝素纤维蛋白水凝胶作为细胞培养应用的良好支架材料后，我们研究了它是否可以作为基质来支持间充质干细胞的生长、增殖和分化。因此，我们将源自山羊的IFP-MSCs接种在37°C下培养3天的DNA-丝素纤维蛋白水凝胶中。14天后，通过使用油红O（脂肪生成）、阿尔辛蓝（软骨生成）和碱性磷酸酶（骨生成）染色来评估DNA-丝素纤维蛋白水凝胶的分化潜力。在脂肪生成方面，我们观察到1.5D2S和1.5D4S水凝胶中的脂滴密度明显低于阳性对照（图6A）。这种脂滴密度的减少可能是由于这些水凝胶的硬度和交联增加所致，可能不适合IFP-MSCs的脂肪生成分化。对于软骨生成分化，阿尔辛蓝染色显示1.5D2S和1.5D4S水凝胶中的糖胺聚糖（GAG）沉积增加了（图6B）。细胞周围的深蓝色染色表明1.5D2S和1.5D4S水凝胶支持MSCs的软骨生成分化，并促进了软骨生成信号通路和细胞外基质的合成。然而，1.5D2S和1.5D4S组之间的阿尔辛蓝染色强度没有显著差异。这些结果表明，1.5D2S和1.5D4S水凝胶之间的机械强度差异并未影响它们之间的软骨生成分化程度。不过，1.5D2S和1.5D4S之间的机械强度差异对MSCs向骨生成方向分化的潜力产生了影响。首先，1.5D2S和1.5D4S水凝胶都显示出比阳性对照更高的碱性磷酸酶活性，表明与组织培养皿相比，MSCs更倾向于在DNA-丝素纤维蛋白水凝胶中分化（图6C）。此外，在1.5D2S和1.5D4S之间，1.5D4S水凝胶的碱性磷酸酶染色更强，这表明更高的交联密度和增加的机械硬度可能为MSCs提供了骨生成的信号，从而导致更高的骨生成分化。DNA-丝素水凝胶的骨生成潜力可能归因于其中存在的DNA，已知DNA可以通过作为磷酸钙的成核位点来促进骨矿化。总体而言，这些结果展示了DNA-丝素水凝胶在软骨和骨组织工程中的潜力。1.5D4S DNA-丝素水凝胶因其优异的骨生成诱导能力，可以用作骨再生的支架，而1.5D2S则可用于软骨修复和关节组织工程。因此，DNA-丝素纤维蛋白水凝胶可以作为潜在的生物材料，用于设计能够指导干细胞命运的机械适应性水凝胶，以应用于组织工程。

近年来，大量研究致力于开发不仅可用于伤口愈合，还能在伤口部位应用以防止创伤性出血的材料。水凝胶作为一种潜在材料，因其能够在伤口部位吸收大量血液、防止血液流失，并能适应伤口形状以促进伤口愈合而受到关注。在不同的生物材料中，DNA水凝胶相比其他聚合物具有显著优势，因为它们可以模仿中性粒细胞的胞外陷阱（NETs），这是一种由中性粒细胞在损伤时释放的DNA和蛋白质网络，用于捕获病原体和血小板以促进血液凝固。因此，DNA水凝胶可以作为一种优秀的材料，用作敷料材料来防止血液流失并促进伤口愈合。接下来，我们研究了DNA-丝素纤维蛋白水凝胶是否可以用作既能凝血又能促进伤口愈合的止血生物材料。首先，我们测试了DNA-丝素纤维蛋白水凝胶的血液相容性。为了测试其血液相容性，我们进行了溶血实验，测量红细胞破裂后溶液中的血红蛋白含量。对于我们的研究，用0.1% Triton-X溶液处理的红细胞溶液（导致红细胞破裂并释放血红蛋白到溶液中）作为阳性对照，而悬浮在1× PBS中的红细胞（无红细胞破裂）作为阴性对照。结果显示，1.5D2S和1.5D4S水凝胶都具有高度的血液相容性，其中1.5D2S的溶血率可忽略不计，而1.5D4S的溶血率为1.5%（图7A）。由于溶血率低于5%（ASTM标准），这些开发的水凝胶具有血液相容性，因此可以用于生物应用。接下来，我们评估了DNA-丝素纤维蛋白水凝胶的血液凝固能力。我们进行了体外止血测试，观察到1.5D2S和1.5D4S水凝胶都在10分钟内导致了血液凝固，表现为离心管底部没有血液（图7B）。结果表明，DNA-丝素水凝胶具有吸收和凝固血液的能力。为了进一步测试其止血能力，我们测量了水凝胶的血液凝固指数。我们观察到，与对照组（没有水凝胶，表示没有血液凝固能力）相比，1.5D2S和1.5D4S水凝胶都吸收并凝固了血液，这从培养皿中清澈的溶液可以看出（图7C）。我们进一步通过测量培养皿溶液中血红蛋白的吸光度来量化血液凝固指数，发现1.5D2S和1.5D4S水凝胶的血液凝固指数分别为28.36 ± 7.187%和19.02 ± 6.955%，显著低于对照组（图7D）。总体而言，这些结果证明了DNA-丝素纤维蛋白水凝胶的血液相容性和血液凝固能力，并表明它可以作为止血材料，在受伤时停止出血，从而开启了DNA-丝素水凝胶作为伤口愈合敷料材料的潜力。

由于DNA-丝素纤维蛋白水凝胶优异的血液相容性和止血能力，接下来我们研究了其在BALB/c小鼠全层皮肤缺损治疗中的伤口愈合能力。通过测量11天内的伤口面积减少情况来监测该水凝胶的治疗效果。在第3天、第6天、第9天和第11天测量了伤口面积。通过计算伤口闭合百分比，我们量化了DNA-丝素纤维蛋白水凝胶的愈合能力。观察到与阴性和阳性对照组相比，DNA-丝素纤维凝胶促进了更快的伤口愈合（图8A和8B）。在1.5D2S和1.5D4S水凝胶之间，1.5D4S水凝胶在伤口面积减少方面表现更好。伤口面积的量化及愈合程度的计算进一步证实了这些结果，第3天结束时，1.5D2S和1.5D4S水凝胶分别导致了40.09%和44.19%的显著伤口收缩（图8C）。相比之下，阴性对照组（未经处理的小鼠）和阳性对照组（硝酸银凝胶处理的小鼠）的伤口收缩分别为9.61%和14.49%。在第6天结束时也获得了类似的结果，1.5D4S水凝胶的伤口闭合程度显著高于对照组。在第9天和第11天，DNA-丝素水凝胶的伤口愈合程度也持续高于对照组。总体而言，基于伤口闭合率，DNA-丝素水凝胶，尤其是1.5D4S，显示出比对照组更快的伤口愈合速度。为了进一步研究DNA-丝素水凝胶在组织水平上的伤口愈合效果，对伤口部位的皮肤进行了组织学评估。皮肤组织的苏木精-伊红（H&E）染色显示，两个对照组都存在上皮重塑不全、肉芽组织紊乱和新生血管生成有限。相比之下，水凝胶处理组表现出更好的组织结构和新上皮（NE）的形成、增强的新生血管生成，在1.5D4S组中还观察到了新的毛囊（图8D）。特别是，1.5D2S和1.5D4S组都表现出连续的上皮层和良好的真皮结构，表明伤口愈合加速。此外，我们还进行了Sirosir Red染色以进一步突出胶原的沉积和排列。阴性对照组显示出稀疏且排列松散的胶原纤维（CFs），而1.5D4S组表现出增加的胶原积累，胶原纤维密集且分布均匀，表明基质重塑和成熟度提高。与这些观察结果一致，Masson’s Trichrome染色显示胶原含量和疤痕结构的显著差异。对照组显示出明显的疤痕组织（ST）形成和不良的组织结构。相比之下，1.5D2S水凝胶处理组显示出减少的疤痕组织，1.5D4S组显示出良好的组织结构、密集的胶原矩阵，没有疤痕组织，表明细胞外基质的重塑和改善。总体而言，DNA-丝素纤维凝胶促进了伤口愈合，包括上皮再生、新生血管生成、毛囊再生以及胶原沉积和组织的改善，导致疤痕形成减少和组织再生优于对照组。

由于DNA-丝素纤维凝胶在血液相容性和止血能力方面的优越性，接下来我们研究了其在BALB/c小鼠全层皮肤缺损治疗中的伤口愈合能力。通过测量11天内的伤口面积减少情况来监测该水凝胶的治疗效果。在第3天、第6天、第9天和第11天测量了伤口面积。通过计算伤口闭合百分比，量化了DNA-丝素纤维凝胶的愈合能力。观察到与阴性和阳性对照组相比，DNA-丝素纤维凝胶促进了更快的伤口愈合（图8A和8B）。在1.5D2S和1.5D4S水凝胶之间，1.5D4S水凝胶在伤口面积减少方面表现更好。伤口面积的量化及愈合程度的计算进一步证实了这些结果，第3天结束时，1.5D2S和1.5D4S水凝胶分别导致了40.09%和44.19%的显著伤口收缩（图8C）。相比之下，阴性对照组（未经处理的小鼠）和阳性对照组（硝酸银凝胶处理的小鼠）的伤口收缩分别为9.61%和14.49%。在第6天结束时也获得了类似的结果，1.5D4S水凝胶的伤口闭合程度显著高于对照组。在第9天和第11天，DNA-丝素水凝胶的伤口愈合程度也持续高于对照组。总体而言，基于伤口闭合率，DNA-丝素凝胶，尤其是1.5D4S，显示出比对照组更快的伤口愈合速度。为了进一步研究DNA-丝素凝胶在组织水平上的伤口愈合效果，对伤口部位的皮肤进行了组织学评估。皮肤组织的苏木精和伊红（H&E）染色显示，两个对照组都存在上皮再生不完全、肉芽组织紊乱和新生血管生成有限。相比之下，水凝胶处理组显示出改善的组织结构和新上皮（NE）的形成、增强的新生血管生成，在1.5D4S组中还观察到了新的毛囊（图8D）。特别是，1.5D2S和1.5D4S组都表现出连续的上皮层和良好的真皮结构，表明伤口愈合加速。此外，我们进一步进行了Sirius Red染色以突出胶原的沉积和排列。阴性对照组显示出稀疏且排列松散的胶原纤维（CFs），而1.5D4S组表现出增加的胶原积累，胶原纤维密集且分布均匀，表明基质重塑和成熟度提高。Masson’s Trichrome染色显示胶原含量和疤痕结构的显著差异。对照组显示出明显的疤痕组织（ST）形成和不良的组织结构。相比之下，1.5D2S水凝胶处理组显示出较少的疤痕组织，1.5D4S组显示出良好的组织结构、密集的胶原矩阵，没有疤痕组织，表明细胞外基质的重塑和改善。总体而言，DNA-丝素纤维凝胶促进了伤口愈合，包括上皮再生、新生血管生成、毛囊再生以及胶原沉积和组织的改善，导致疤痕形成减少和组织再生优于对照组。下图显示了虚线框标记区域的放大图像（刻度尺，200微米）。星号表示新生成的血管，箭头指向新的毛囊，NE表示新上皮组织，CF表示胶原纤维，ST表示疤痕组织。刻度尺，500微米。体内研究在每组3只小鼠中进行，每个数据点代表每只小鼠的愈合程度。

**讨论**
我们研究的目的是开发一种水凝胶，以解决传统基于DNA的水凝胶的关键局限性，包括成本高、机械强度低、稳定性差和合成过程复杂等问题。通过使用鲑鱼来源的DNA作为经济高效且可持续的来源，并结合丝素蛋白作为机械性能强且生物相容性好的支架，我们开发出了一种具有优越机械性能、增强结构稳定性和可控降解性的混合材料。首先，为了避免复杂的多人步骤合成过程，我们采用了一种简单的一锅热组装策略来合成DNA-丝素蛋白水凝胶，形成了一个双网络结构，其中每个网络都发挥着独特的结构作用。第一个网络通过DNA链的热变性和随后的再退火形成，使得DNA片段之间发生非特异性交联，并在15分钟内快速凝胶化。同样的热处理结合在形成的DNA网络中的限制作用，逐渐将丝素蛋白链从无规卷曲结构转变为β-折叠结构，从而建立了第二个相互渗透的网络。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，DNA-丝素蛋白水凝胶具有高度多孔的结构，孔径与丝素蛋白浓度成反比，这表明可以通过调整丝素与DNA的比例来控制水凝胶的内部结构。这种DNA-丝素蛋白水凝胶的可调性为根据不同组织工程或细胞培养应用的需求定制水凝胶孔隙度提供了实用的设计参数。此外，丝素蛋白链从无规卷曲结构向β-折叠结构的转变是时间依赖的，这导致水凝胶在5天内的机械强度逐步增强。这种机械强度的逐步增加表明网络的形成不仅限于初始凝胶化过程，还涉及持续的网络成熟。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析表明，丝素蛋白结构的逐步转变促进了与DNA的更强分子相互作用，从而增强了水凝胶网络。进一步地，机械强度的增加与水凝胶中丝素蛋白的浓度成正比，这表明可以通过调节丝素蛋白浓度来调节机械强度的增强程度，突显了根据目标组织类型的需求开发具有可调机械性能的水凝胶的潜力。然而，水凝胶机械性能的时间依赖性为其带来了动态特性，使其区别于传统的静态材料。这种时间依赖性的硬化特性可以用于各种生物应用，其中生物过程的命运由系统的机械性能决定。为了验证这一假设并评估这种机械时间系统的实用性，我们研究了DNA-丝素蛋白水凝胶作为间充质干细胞（MSCs）分化的机械适应性支架的潜力。我们选择MSCs是因为它们的分化方向受到细胞外基质机械性能的强烈影响，使其特别适合评估机械变化水凝胶的生物学后果。我们观察到，所开发的水凝胶促进了成骨和软骨分化，而抑制了脂肪分化。脂肪分化的减少可以归因于细胞培养过程中DNA-丝素蛋白水凝胶机械强度的增加。由于脂肪细胞更喜欢较软的细胞外基质，DNA-丝素蛋白水凝胶机械强度的增加阻止了MSCs向脂肪细胞方向分化。相比之下，1.5D2S和1.5D4S之间的相似软骨分化反应表明，这两种配方产生的机械环境可能已经足以支持软骨分化，进一步的硬化带来的额外收益有限。然而，DNA-丝素蛋白水凝胶特别促进了成骨分化。这种增强的成骨分化可以归因于基质硬度的增加以及DNA自身的矿化相关特性。先前的研究表明，基于DNA的材料特别有利于成骨分化，并已被证明可以支持骨组织修复。DNA水凝胶支持成骨分化的能力主要归因于DNA负电荷的磷酸骨架及其腺嘌呤含量。腺嘌呤已被证明通过上调胶原蛋白表达和增强碱性磷酸酶活性来促进成骨细胞分化。此外，细胞外磷酸盐也被证明可以通过上调非经典Wnt信号通路来促进早期分化的成骨分化。因此，在DNA-丝素蛋白水凝胶中观察到的优先成骨分化可能是由于基质硬度的增加以及DNA内在的矿化相关特性的共同作用。除了细胞培养和组织工程应用外，网络逐渐成熟还可能改变基质内的分子扩散，为调节释放的治疗剂的程度提供了潜在手段。总体而言，这些发现突显了DNA和丝素蛋白在先进生物医学应用中的协同潜力，其中互补的生物化学和机械线索的整合可以用于先进的生物应用。

除了其物理化学优势外，这种混合水凝胶还表现出出色的生物相容性，在体外支持细胞的牢固附着、扩散和增殖。此外，DNA作为中性粒细胞胞外陷阱（NET）基质的关键成分，赋予了水凝胶固有的止血潜力，促进了快速凝血，表明其作为伤口止血辅助剂的潜力。重要的是，DNA-丝素水凝胶结合了低溶血反应、高效的血液凝固和水合环境，这些特性在伤口敷料材料中通常难以同时实现。考虑到有效伤口愈合需要从快速止血到后续组织再生的过渡，这些特性尤为重要。因此，考虑到水凝胶作为伤口愈合材料的潜力，我们接下来在全层皮肤缺损小鼠模型中评估了其效果。尤其是1.5D4S水凝胶观察到的增强伤口闭合、改善的再上皮化、新血管形成、胶原沉积和减少的疤痕形成表明，DNA-丝素蛋白水凝胶不仅加速了伤口闭合，还支持了多个组织修复阶段。这些发现共同确立了DNA-丝素蛋白水凝胶作为一种多功能生物材料平台的地位，能够促进干细胞分化、实现快速止血和促进组织修复。

**研究的局限性**
该研究强调了DNA-丝素蛋白水凝胶作为间充质组织工程、止血辅助剂和伤口愈合的多功能生物材料的潜力。然而，需要进一步的研究来充分确立其潜力并扩展其在生物医学研究中的应用。首先，尽管水凝胶在PBS和细胞培养基中表现出优异的降解行为，但仍需评估其在体内条件下的降解行为，以确定其长期稳定性和生物相容性。此外，目前的研究主要侧重于将DNA-丝素蛋白水凝胶作为多功能支架的各种应用；未来的工作应侧重于阐明这些功能结果的分子机制。更深入地理解负责MSC分化的信号通路和机械转导机制可以进一步支持使用DNA-丝素蛋白水凝胶作为骨组织工程的有希望的支架。此外，由于我们没有使用雄性和雌性来源的细胞系来评估细胞-材料相互作用，因此无法报告生物学性别对我们的发现的影响，这对外界普遍适用性的研究是一个限制。另外，由于DNA在体内条件下已被证明会引起炎症反应，因此需要进一步研究这些水凝胶的炎症行为，特别是在免疫系统与人类相似的大型动物模型中。最后，将生长因子、抗菌剂或药物输送能力整合到混合水凝胶中可以进一步拓宽其应用范围，包括再生医学、可植入支架、先进伤口敷料和药物输送系统。

**资源可用性**
如需更多信息和资源，请联系首席联系人Dhiraj Bhatia（[e-mail]）。

**材料可用性**
本研究没有生成新的独特试剂，研究中生成的水凝胶样本可根据首席联系人Dhiraj Bhatia（[e-mail]）的要求提供。

**数据和代码可用性**
- **数据**：本文报告的所有数据将在收到请求时由首席联系人提供。
- **代码**：本文没有报告原始代码。
- **其他信息**：如需重新分析本文报告的数据，可向首席联系人请求额外信息。

**致谢**
感谢D.B.研究小组的所有成员提供的建设性意见和对手稿的严格审查。衷心感谢印度甘地讷格尔理工学院（IITGN）在基础设施和财务方面的支持。N.S.、B.P.和A.S.感谢印度政府的教育部，A.S.还感谢总理研究奖学金。场发射扫描电子显微镜和共聚焦显微镜分析是在IITGN的中央仪器设施的帮助下进行的。作者还感谢古吉拉特邦艾哈迈达巴德的Nirma大学提供的体内实验设施和资源。D.B.感谢科学和工程研究委员会（SERB）和印度政府提供的核心研究资助、IITGN的启动资助，以及GUJCOST-DST、GSBTM和STARS-MoES提供的额外研究资金。D.B.还被认可为印度国家青年科学院的成员。

**作者贡献**
- **概念化**：N.S. 和 D.B.
- **方法学**：N.S.、B.P.、A.J.、D.G.、A.S.、R.S.、V.K.、S.S. 和 D.B.
- **正式分析和调查**：N.S.、A.J. 和 D.G.
- **验证**：N.S.、B.P.、V.K. 和 D.B.
- **写作 - 原始草案准备**：N.S.
- **写作 - 审核和编辑**：N.S.、A.J.、D.G.、S.S. 和 D.B.
- **资金获取**：D.B.
- **资源**：S.S. 和 D.B.
- **监督**：D.B.
- **项目管理**：D.B.

**利益声明**
作者声明没有利益冲突。

**方法**
- **关键资源表**

| 物质 | 来源 | 标识符 |
|------|------|------|
| 生物样本 | 山羊膝关节（雄性） | N/ |
| 毛桑茧 | 当地丝绸厂供应商 | N/A |
| 化学品、肽和重组蛋白 |
DNA钠盐 | Sigma-Aldrich | Cat# D1626; CAS: 438545-06-3 |
| 溴化锂 | Sigma-Aldrich | Cat# 213225; CAS: 7550-35-8 |
| 无水氯化钙 |imedia | Cat# TC097; CAS: 10043-52-4 |
| 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | Cat# P4170; CAS: 25535-16-4 |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | Cat# I9278; CAS: 11061-68-0 |
| 阿ポ-转铁蛋白（人） | Sigma-Aldrich | Cat# T4382; CAS: 11096-37-0 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | Cat# H3375; CAS: 7365-45-9 |
| 二钠甘油磷酸盐五水合物 | Himedia | Cat# TC463; CAS: 13408-09-8 |
| 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐 | Sigma-Aldrich | Cat# 49752; CAS: 66170-10-3 |
| 硒酸钠 | Sigma-Aldrich | Cat# 214485; CAS: 10102-18-8 |
| 吲哚美辛 | Sigma-Aldrich | Cat# I7378; CAS: 53-86-1 |
| 碳酸钠 | Sigma-Aldrich | Cat# 223484; CAS: 497-19-8 |
| 聚乙二醇（MW:20000 Da） | Himedia | Cat# MB151; CAS: 25322-68-3 |
| 脯氨酸 | Loba Chemie | 05470; CAS: 147-85-3 |
| 维生素D3 | SRL | Cat# 97389; CAS: 67-97-0 |
| 地塞米松 | Himedia | Cat# TC277; CAS: 50-02-2 |
| 乙醇 | CSS Fine Chemicals | CAS: 64-17-5 |
| 钙黄AM | Invitrogen | Cat# C1430 |
| MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物） | Invitrogen | Cat# M6494; CAS: 298-93-1 |
| 胎牛血清（FBS） | ThermoFisher Scientific | Cat# A5256701 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | ThermoFisher Scientific | Cat# 1514012 |
| 实验模型：细胞系**
人类：视网膜色素上皮-1（hTERT-RPE1）细胞 | ATCC | Cat# CRL-4000; RRID: CVCL_4388 |
山羊髌下脂肪垫来源的间充质干细胞（IFP-MSCs） | 山羊膝关节（雄性） | N/ |
小鼠：红细胞 | 从雄性BALB/c小鼠中提取 | N/A |
| 实验模型：生物体/菌株**
小鼠：雄性BALB/c | Zydus Research Centre | N/A |
**软件和算法**
ImageJNIH | https://imagej.net/ij/download.html |
GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | https://www.graphpad.com/ |
OriginPro 2026 | OriginLab Corporation | https://www.originlab.com/demodownload.aspx |
**其他**
- 扫描电子显微镜（SEM）：JeolJSM7600F | https://www.jeol.com/products/scientific/sem/JSM-7600F.php |
- 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）：PerkinElmer | PerkinElmer Spectrum Two | https://shop.perkinelmer.com/en-GB/product/L160000A |
- 共聚焦激光扫描显微镜：LeicaTCS SP8 | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8 |
- 日本尼康光学显微镜：NikonNikon Eclipse TS2 | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2 |
- 流变仪：Anton Paar | Anton Paar Modular Compact Rheometer | https://www.anton-paar.com/in-en/products/details/modular-compact-rheometer |

**实验模型和研究参与者详情**
- **全层皮肤缺损小鼠模型**
伤口愈合研究是在体重18-23克的雄性BALB/c小鼠模型上进行的，这些小鼠来自古吉拉特邦艾哈迈达巴德的Zydus Research Centre（ZRC）。小鼠被饲养在具有12小时光照-黑暗周期和22°C温度的聚丙烯笼子中。体内伤口愈合研究通过标准协议在小鼠身上创建全层皮肤缺损来进行，遵循伦理和生物安全指南。该研究在艾哈迈达巴德Nirma大学的机构动物伦理委员会（IAEC）的批准下进行：ISNU/PHD/39/2025/33。实验遵循授权协议进行，同时仔细关注动物的安全和福利。
- **细胞培养**
人类视网膜色素上皮-1（hTERT-RPE1）细胞来自女性供体，并从美国类型培养收集中心（ATCC）获得。细胞在分发前通过短串联重复（STR）谱型分析进行了鉴定。hTERT-RPE1和IFP-MSCs均进行了支原体污染检测。山羊IFP-MSCs根据标准发布的协议从雄性山羊膝关节中获取。收获后，对山羊IFP-MSCs进行了菌落形成单位（CFU）测试和分化潜能测试，以评估其自我更新质量和适应性。hTERT-PE-1细胞在添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中培养，并用于生物相容性测试。山羊IFP-MSCs在DNA-Silk杂化水凝胶上进行分化研究。山羊IFP-MSCs在DMEM扩增培养基（低糖DMEM，10% FBS，100 U/mL青霉素-链霉素和2.5 μg/mL两性霉素B）中维持培养。所有体外细胞培养实验均在37°C和5% CO2的培养箱中进行。

**材料**
DNA钠盐、溴化锂、氯化钙、碘化丙啶、胰岛素、转铁蛋白、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、β-甘油磷酸盐、2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐、亚硒酸钠、吲哚美辛和碳酸钠从Sigma-Aldrich购买。聚乙二醇（MW:20000 Da）、脯氨酸和地塞米松从Himedia购买。乙醇从CSS Fine Chemicals购买。Calcein AM和MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）从Invitrogen, ThermoFisher Scientific购买。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、青霉素-链霉素（10,000 U/mL）和胎牛血清（FBS）从Gibco, ThermoFisher Scientific购买。家蚕茧从本地丝绸厂供应商处购买。

**从家蚕茧中提取丝素蛋白**
按照已发表的协议从家蚕茧中提取丝素蛋白。将5克家蚕茧切成小块（5毫米×5毫米），在2升0.02 M碳酸钠溶液中煮沸30分钟。煮沸后，将获得的丝纤维在1升超纯水中冲洗3次，每次20分钟。然后将丝素纤维放入通风橱中过夜干燥。接着，将1克丝素纤维溶解在10毫升9.3 M溴化锂溶液中，60°C下溶解4小时。完全溶解后，将丝素盐溶液在2升超纯水中透析3天，每隔6小时更换一次水。透析完成后，将丝素蛋白水溶液在4°C下以12700 g离心20分钟。为了浓缩丝素蛋白溶液，将其在10 w/v%聚乙二醇溶液中透析12小时。通过干重分析方法确定丝素蛋白溶液的浓度。具体步骤是：将0.5毫升丝素蛋白溶液加入称量瓶中，在60°C下干燥，干燥后除以0.5毫升以计算溶液中的丝素蛋白浓度。

**制备DNA-Silk杂化水凝胶**
制备DNA-Silk杂化水凝胶时，将DNA钠盐溶液与丝素蛋白（SF）溶液按不同重量比例混合（表1）。所有实验中DNA的浓度保持在1.5 w/v%，SF溶液的比例不同。1.5D作为DNA对照组，2S和4S作为丝对照组。混合后，将DNA-Silk溶液加热至93°C，1000 rpm下持续7分钟，并在搅拌过程中加入乙醇以促进快速凝胶化（乙醇浓度相对于反应体积为20%）。搅拌完成后，将DNA-Silk溶液置于相对湿度超过90%的环境中，保持37°C。

**物理表征**
DNA-Silk水凝胶的形态学分析通过扫描电子显微镜（SEM）进行。SEM分析前，先将DNA-Silk水凝胶冷冻干燥，然后喷涂金，并在5 kV加速电压下观察。机械表征方面，使用流变仪对DNA-Silk水凝胶进行流变分析。时间依赖性分析中，将水凝胶置于相对湿度超过90%的封闭环境中，保持37°C。每个时间点收集一个DNA-Silk水凝胶样本进行分析。在25°C下，以1%的恒定剪切应变进行频率扫描，频率范围从1 Hz到100 Hz。在25°C下，以1%的恒定剪切应变进行振幅扫描。

**FTIR表征**
使用PerkinElmer Spectrum Two FT-IR光谱仪进行DNA-Silk丝素蛋白水凝胶的化学结构和分子间相互作用分析，该光谱仪配备LiTaO3检测器，采用衰减全反射（ATR）模式。每次测量的光谱分辨率为4 cm?1，平均4次扫描结果。冷冻干燥后的水凝胶样品被粉碎，并在400-4000 cm?1的频谱范围内进行分析。数据解释前，使用OriginPro软件对FTIR光谱进行基线校正。将FTIR光谱数据上传至OriginPro软件，使用Peak Analyser软件分析峰值。使用二阶导数方法选择基线基准点，从原始光谱中减去基线参考数据以获得基线校正后的光谱。处理后的光谱用于识别DNA和丝素蛋白的特征吸收峰，包括DNA的磷酸振动峰以及丝素蛋白的酰胺I、酰胺II和酰胺III峰。同样，使用OriginPro软件进行峰解卷积，以识别FTIR光谱中的复杂峰。将原始光谱导入OriginPro软件，通过二阶导数方法进行峰解卷积，以识别隐藏的组分峰，并估计峰位。使用二次Savitzky-Golay函数进行平滑导数处理，多项式阶数为2。然后使用高斯混合峰函数进行多峰拟合，直至获得最小残差误差的最佳拟合结果。

**DNA-Silk杂化水凝胶的降解研究**
为了研究DNA-Silk杂化水凝胶的降解情况，将（培养3天的）水凝胶在含10% FBS的PBS或DMEM培养基中，37°C下孵育不同天数（1、2、3、4、7、10、14天）。在相应时间点后，收集上清液，并使用分光光度计（NanoDrop 2000/2000c）测量DNA含量。

**生物相容性测试**
使用MTT和Live-Dead测定法评估DNA-Silk杂化水凝胶的体外细胞相容性。对于MTT测定，将RPE-1细胞与人造DNA-Silk丝素蛋白杂化水凝胶（培养3天）处理后的培养基共同孵育。人造DNA-Silk丝素蛋白杂化水凝胶培养基是通过将水凝胶在37°C和5% CO2条件下与500 μL DMEM高糖培养基共同孵育24小时和48小时获得的。最初，将RPE-1细胞以25000细胞/毫升的接种密度接种在96孔板中，孵育24小时。之后，将RPE-1细胞分别与处理后的培养基共同孵育24小时和48小时。未处理过的纯DMEM培养基中的RPE-1细胞作为对照组。24小时或48小时后，去除处理后的培养基，将细胞在含有0.5 mg/mL MTT染料（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）的DMEM无血清培养基中孵育4小时，37°C下进行测量。4小时后，去除MTT染料，在DMSO中370 nm处测量吸光度以量化细胞活力。对于Live/Dead测定，将RPE-1细胞与DNA-Silk丝素蛋白杂化水凝胶处理后的培养基共同孵育3天。3天后，将细胞在37°C、5% CO2条件下，在细胞培养箱中与1.5 μg/ml Calcein AM和碘化丙啶共同孵育10分钟。染色后，用1X PBS洗涤细胞，并使用共聚焦激光扫描显微镜成像。作为阴性对照，将细胞用乙醇处理10分钟，然后用Calcein AM和碘化丙啶染色。

**山羊髌下脂肪垫来源的间充质干细胞的分化研究**
山羊IFP-MSCs在DNA-Silk杂化水凝胶上进行分化研究。所有体外细胞培养实验均在37°C和5% CO2的培养箱中进行。在分化研究中，将IFP-MSCs接种在细胞培养孔板中的水凝胶上，孵育3天。对于脂肪生成、软骨生成和骨生成，分别以25000细胞/平方厘米、50000细胞/平方厘米和25000细胞/平方厘米的密度接种在细胞培养板中。细胞在相应的诱导培养基中生长（脂肪生成诱导培养基：添加了25 mM D(+)葡萄糖、1 μM地塞米松、10 μg/mL胰岛素和100 μM吲哚美辛的DMEM扩增培养基；软骨生成诱导培养基：添加了10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1 mM脯氨酸、100 nM地塞米松、10 μg/mL胰岛素、5.5 μg/mL转铁蛋白、6.7 ng/mL亚硒酸钠、1.25 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）的DMEM扩增培养基；骨生成诱导培养基：添加了50 μg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐、25 mM D(+)葡萄糖、10 mM β-甘油磷酸盐、10 nM地塞米松和10 nM维生素D3的DMEM扩增培养基，每3天更换一次培养基）。作为阴性对照（未诱导），细胞在添加了25 mM D(+)葡萄糖的DMEM扩增培养基中的组织细胞培养板中生长。作为阳性对照，细胞在添加了相应诱导培养基的组织细胞培养板中生长。细胞培养持续到第14天，之后对IFP-MSCs进行组织学染色以观察细胞分化。对于脂肪生成，根据先前报道的标准组织学协议使用油红染色观察油滴。同样，对于软骨生成，使用阿尔辛蓝染色评估基质中的蛋白聚糖含量；对于骨生成，使用碱性磷酸酶染色评估碱性磷酸酶活性。

**血液相容性测试**
通过测定红细胞的溶血百分比来评估DNA-Silk水凝胶的血液相容性。从小鼠中收集新鲜血液，以1500 g离心10分钟以分离红细胞。收集的红细胞沉淀物用1X PBS洗涤三次，然后以2%的比例（v/v）重新悬浮在1X PBS中。将10毫克DNA-Silk丝素蛋白水凝胶（培养3天）与500 μL 2%红细胞溶液孵育1小时，37°C下以200 rpm振动。1小时后，以1500 g离心10分钟以分离红细胞，收集上清液进行UV吸光度测量。溶血百分比通过以下公式计算：溶血百分比（%）= (As/Ao) × 100，其中As是样本的吸光度，Ao是阳性对照的吸光度。测试中，用0.1% Triton-X溶液处理的红细胞溶液作为阳性对照，用1X PBS悬浮的红细胞作为阴性对照。

**DNA-Silk水凝胶的体外止血性能**
为了研究DNA-Silk丝素蛋白水凝胶的止血性能，将500 μL DNA-Silk水凝胶加入2毫升离心管中。将水凝胶在37°C下孵育10分钟，然后加入200 μL抗凝小鼠血液。水凝胶与血液共同孵育5分钟，接着加入50 μL 25 mM氯化钙孵育5分钟。每30秒倾倒一次离心管，观察血液是否凝固。凝固后，倒置离心管并拍照。

**血液凝固指数测试**
进行BCI测试以评估DNA-Silk丝素蛋白水凝胶的止血能力。首先将DNA-Silk水凝胶预加热至37°C 10分钟，然后将200 μL DNA-Silk水凝胶置于90毫米培养皿中心。接着加入50 μL新鲜收集的小鼠血液，保持5分钟。5分钟后加入10 μL 0.2 M氯化钙溶液，再保持5分钟。之后加入10毫升蒸馏水，轻轻摇晃培养皿以收集未被水凝胶捕获的红细胞。5分钟后，收集含有自由红细胞的溶液，并在540 nm处测量其UV吸光度。血液凝固指数（BCI）的计算公式为：BCI (%) = (As/Ao) × 100，其中As是样本的吸光度，Ao是对照组的吸光度。对于对照组，将50 μL新鲜收集的小鼠血液直接加入到不含任何水凝胶的培养皿中，然后加入氯化钙。

**体内伤口愈合研究**
在伤口愈合研究中，雄性BALB/c小鼠被分为4组，每组3只：
- **阴性对照组**（未接受处理）；
- **阳性对照组**（使用市售的0.2%硝酸银凝胶（Silverex）进行处理）；
- **1.5D2S组**；
- **1.5D4S组**。
在体内研究中，使用了在37°C、90%湿度条件下保存了3天的DNA-丝素蛋白水凝胶。首先剃除动物背部的毛发，然后用乙醚对小鼠进行轻微麻醉。使用活检冲压器在动物背部制造一个直径为5毫米的圆形伤口，随后将水凝胶敷在伤口处，并用敷料覆盖以防止感染。每隔3天更换一次敷料并重新涂抹水凝胶。在每次更换敷料时（第3天、第6天、第9天和第11天）拍摄伤口图像，并根据以下公式计算伤口闭合百分比：
$$
\text{伤口闭合百分比} = \frac{\text{伤口闭合面积}_{最终} - \text{伤口闭合面积}_{初始}}{ \text{初始伤口面积}} \times 100
$$
11天后，当观察到伤口完全闭合时，对小鼠进行安乐死。收集伤口部位的皮肤样本并进行组织病理学研究。

**组织病理学研究**
从第11天采集的伤口部位皮肤样本用4%甲醛固定24小时。固定后的组织块嵌入石蜡中，并使用切片机切成5 μm厚的组织切片。为了观察伤口愈合后的组织形态、再生情况以及胶原蛋白分布，按照标准程序使用苏木精和伊红（H&E）及Sirius red染色对组织切片进行染色。

**量化和统计分析**
所有实验至少独立重复进行三次，数据以平均值±标准差表示。展示的是三次实验的代表性结果。统计分析使用GraphPad Prism 8软件进行，采用单因素方差分析（ANOVA）和配对t检验，并在适当情况下使用Tukey事后检验或Welch校正方法。符号“?”表示组内统计学显著性；“?”、“??”、“???”、“????”分别表示p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001和p < 0.0001，而“n.s.”表示无显著差异。p值小于0.05被认为具有统计学意义。

**补充信息（1）**
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文档S1：图S1和图S2