《Agronomy》：Regulatory Effects of a Composite Preparation of Bacillus cereus S1 and Cinnamaldehyde on Microbial Community and Nutritional Quality During Aerobic Storage of High-Moisture Alfalfa
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本研究探究了蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）S1联合肉桂醛（cinnamaldehyde）对含水量30%苜蓿（Medicago sativa）干草在有氧贮藏条件下微生物群落动态、饲草营养品质及毒力基因相关分子风险的调控效应。贮藏实验于常温（25–
本研究探究了蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）S1联合肉桂醛（cinnamaldehyde）对含水量30%苜蓿（Medicago sativa）干草在有氧贮藏条件下微生物群落动态、饲草营养品质及毒力基因相关分子风险的调控效应。贮藏实验于常温（25–30 ℃）有氧条件下进行，设空白对照（CK）、单菌接种B. cereus S1（BS）及S1联合肉桂醛（BC）三组，于第0、8、32天采样，开展宏基因组测序，并联合碳水化合物活性酶（CAZy）与病原-宿主互作（PHI）数据库进行功能注释，以解析BC处理如何调控微生物演替、营养性状与分子层面生物安全风险。第32天时，CK组腐败相关属（如曲霉属 Aspergillus、不动杆菌属 Acinetobacter、大洋芽孢杆菌属 Oceanobacillus）大量增殖；BS与BC均抑制杂菌过度繁殖并稳定群落结构，其中BC调控最优。BC处理驱动群落由肠球菌属（Enterococcus）向接种功能菌B. cereus S1演替，并持续富集AA10家族裂解多糖单加氧酶（LPMO）这类关键纤维素降解酶，伴随中性洗涤纤维（NDF）与酸性洗涤纤维（ADF）显著下降；同时致死型与毒力增强型PHI基因积累受抑，曲霉丰度与高风险PHI基因呈显著正相关（r = 0.556，p < 0.01）。第32天BC组干物质保存率94.22%、粗蛋白（CP）28.91%、体外干物质消化率90.88%。该研究针对30%水分有氧苜蓿首次机制性阐释芽孢杆菌-肉桂醛复合体系可重塑微生物组、抑制产毒真菌、改善饲草品质并降低分子生物安全风险，为高湿饲草绿色生物调节剂开发提供理论依据。
研究背景与问题提出
苜蓿（Medicago sativa）是高蛋白豆科饲草，但收获期受降雨与晾晒条件限制，常需以30%水分进行短期有氧干草贮藏。该模式不同于密闭厌氧青贮，持续接触氧气，高湿环境加速腐生真菌如曲霉（Aspergillus）与青霉（Penicillium）增殖，造成粗蛋白、粗脂肪流失，中性洗涤纤维（NDF）与酸性洗涤纤维（ADF）升高，并可能因产毒真菌携带毒力相关基因带来霉菌毒素与食物链安全顾虑。传统化学防霉剂有残留风险，单一芽孢杆菌接种偏重纤维降解而抗真菌不足，单一肉桂醛（cinnamaldehyde）抗真菌但无木质纤维素降解能力。已有研究多聚焦厌氧青贮或体外平板抑菌，缺乏对有氧高湿贮藏下微生物演替、碳水化合物活性酶（CAZy）与毒力基因积累的时序整合分析。
研究人员开展的工作与核心结论
研究人员构建蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）S1与肉桂醛复合体系（BC），以空白对照（CK）与单菌（BS）为参照，在25–30 ℃有氧条件下贮藏30%水分苜蓿，于0、8、32天取样，通过宏基因组测序联合CAZy与病原-宿主互作（PHI）数据库注释，揭示“生物竞争+化学选择性抑制”双屏障机制：BC抑制曲霉等产毒真菌，促使优势属由肠球菌（Enterococcus）转向B. cereus S1，持续富集AA10家族裂解多糖单加氧酶（LPMO），降低NDF、ADF与酸不溶木质素（ADL），保留干物质与粗蛋白，并将PHI高风险毒力基因积累显著压低，从而同步实现减损、提质与分子层面生物安全控制。
主要关键技术方法
研究以山西农业大学“中苜一号”苜蓿为样本，经电子束灭菌后重建微宇宙接种体系；采用宏基因组测序与混合组装、非冗余基因集构建，基于Kraken2/Bracken进行属种水平分类，以CAZy数据库注释碳水化合物活性酶，以PHI数据库注释毒力功能基因并作CPM标准化；营养指标通过近红外反射光谱（NIRS）分析；统计学采用单因素方差与Tukey检验、Pearson相关性分析。
研究结果
3.1 不同处理下贮藏苜蓿营养特征
BC组第32天干物质保留率、粗蛋白（CP）与体外真消化率（IVTDM）显著高于CK与BS，NDF、ADF、ADL显著降低，说明复合处理在保氮与降纤维上协同最优。
3.2 微生物群落α多样性
CK组Chao1丰富度在8天与32天高于处理组，反映腐败菌无序增殖；BS与BC丰富度更低且结构更稳定，表明功能菌群成功压制杂菌扩张。
3.3 属水平群落相对丰度
0天与8天各组成熟前以肠球菌为主；32天CK富集Oceanobacillus、Paenibacillus、Aspergillus等腐败属，BS仍为Enterococcus主导，BC则完成向Bacillus（即B. cereus S1）的主导演替。
3.4 CAZy注释
辅助活性（AA）家族为主，其中AA10 LPMO是纤维素氧化降解核心。BC组LPMO相对丰度全程高于其余组，对应纤维结构破坏与消化率提升；CK后期LPMO回升主要来自曲霉自身同源基因，但伴随营养流失。
3.5 PHI数据库病原-宿主互作注释
随贮藏时间，CK与BS中PHI基因总量上升，CK致死/毒力增强型占比最高；BC总量平稳且62%为毒力减弱型。曲霉丰度与高风险PHI基因显著正相关（r = 0.556，p < 0.01），证明曲霉是营养劣变与分子风险的中枢。
讨论部分总结
讨论指出，肉桂醛对真菌膜的选择性损伤低毒于芽孢杆菌，形成化学筛选压力；B. cereus S1通过营养抢占与脂肽/聚酮类代谢物拮抗真菌，二者构成“竞争+靶向抑制”双屏障。有氧条件利于锰过氧化物酶与漆酶等木质素氧化酶表达，使BC组ADL由5.83%降至1.78% DM。LPMO持续高丰度驱动细胞壁木质素-碳水化合物复合体（LCC）解构，降解产物被功能菌转化为微生物蛋白，实现纤维降级与氮保留协同。PHI层面，竞争排斥与抗菌代谢使高风险毒力基因不再累积，但研究仅作分子标记评估，未量化黄曲霉毒素等真实浓度。
结论部分翻译
研究表明，蜡样芽孢杆菌S1联合肉桂醛（BC）处理在30%初始水分苜蓿有氧贮藏中，借助肉桂醛靶向抗真菌与S1生态位竞争，抑制曲霉等产毒真菌大量增殖；驱动优势群落由肠球菌向B. cereus S1演替，缓解真菌代谢产物对功能菌酶活的抑制；维持AA10家族LPMO高丰度，显著降低ADL、NDF与ADF，保留干物质与粗蛋白并提升体外消化率；同时抑制PHI注释的致死型与毒力增强型病原毒力基因积累。曲霉相对丰度与高风险PHI毒力基因显著正相关（r = 0.556，p < 0.01）。生物安全评估仅基于宏基因组分子标记，未做霉菌毒素定量与菌落计数。该工作从纤维降解基因激活与病原毒力基因抑制双视角，解析了双剂复合调控机制，为高湿饲草绿色保存剂开发奠定理论基础。
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