中国新近审定48个普通小麦品种（系）的叶锈病抗性评价及Lr基因鉴定

《Agronomy》：Leaf Rust Resistance Evaluation and Identification of Lr Genes in 48 Selected Common Wheat Cultivars in China

　　

为阐明中国主要小麦产区品种的叶锈病抗性水平及Lr基因分布，研究人员对2020—2022年间国家审定的48个普通小麦品种，通过多小种田间抗性测定与基因推导进行表型鉴定，并对全部供试材料开展平行分子标记基因分型，检测9个已报道Lr基因（Lr1、Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24、Lr26、Lr28和Lr34）的存在情况，进一步将基因分型结果与系谱追溯分析相结合，验证全部供试材料的抗性基因组成。本研究系统表征了该组统一组装的48个新近审定国家小麦品种，为当前中国商业小麦育种项目中的Lr基因分布格局提供了更新的全面概述。结果表明，供试小麦品种中存在9个正式命名的Lr抗性基因，主要以多种金字塔组合形式存在。Lr1和Lr26在全套品种中检出频率最高。此外，在少数供试材料中推定存在Lr10、Lr11、Lr14a、Lr15、Lr28、Lr33和Lr39基因。所有品种均不携带Lr9、Lr19、Lr20或Lr24。7个品种对所有供试病原小种均表现感病。2个供试小麦品种被确认携带有效的成株期抗性（APR），另有2个品种被归类为携带典型的慢锈性抗性表型。总体而言，上述结果为中国家小麦生产体系中的区域化品种布局、持久叶锈病抗性育种及新抗性基因发掘提供了关键实证依据和可操作的理论参考。

小麦是中国主要粮食作物之一，对保障国家粮食安全至关重要，其品质与产量必须得到保障。小麦叶锈病（由Puccinia triticina，Pt引起）是一种全球广泛分布的病害，可造成显著产量损失，流行年份严重感染可导致产量损失超过30%。近年来，全球气温升高和降水带北移使中国叶锈病流行的发生率、频率和严重程度显著增加，给可持续病害管理带来日益严峻的挑战。培育和合理布局抗病品种仍是防控该病最经济、安全且环境友好的方法。国家审定小麦品种是大面积推广的主要或后备候选品种，因此具有重要战略意义。在此背景下，及时评估其抗性水平并鉴定其主要抗性基因，对于指导国家小麦品种布局和病害综合管理框架至关重要。小麦对叶锈病的抗性经典上遵循基因对基因假说。叶锈病抗性基因的鉴定主要依赖三种互补方法：基因推导、分子标记检测和系谱分析。基因推导是一种快速分析技术，通过用具有不同毒性谱的标准病原菌株面板接种寄主植物，并将受试品种上的侵染反应与携带已知抗性基因的鉴别寄主上的反应进行比较，从而推断推定抗性基因。针对已报道的叶锈病抗性基因，已广泛开发了大量紧密连锁和共分离的分子标记，可对育种群体中的这些基因进行精确、高通量检测。分子标记辅助选择利用其准确性、高效性和环境稳定性等优势，显著加速叶锈病抗性基因向优良育种品系和商业品种的定向导入。系谱分析利用品种详细的遗传记录，有助于可靠追溯抗性基因来源并系统阐明品种遗传背景。将这三种方法相结合的综合分析框架通常能获得更稳健、更准确的抗性基因鉴定与验证结果。迄今为止，全球已鉴定100多个小麦叶锈病抗性基因，其中85个已正式命名（Lr1至Lr85）。这些基因大致分为两类：全生育期抗性（ASR）基因和成株期抗性（APR）基因。ASR基因如Lr1、Lr9、Lr19、Lr20、Lr24和Lr26，在小麦整个生命周期（从苗期到成株期）均赋予抗性。此类抗性通常具有小种特异性，可被病原菌进化所克服。相反，APR基因包括Lr34、Lr46、Lr67和Lr68，主要在后期生长阶段赋予抗性。APR通常非小种特异性，其特征为病害进展缓慢、潜育期延长、孢子堆减小和产孢量降低，从而提供更持久的抗性。某些APR基因在特定环境条件下还可赋予对其他病害的抗性。然而，中国大多数广泛种植品种中部署的抗性基因仍主要局限于Lr1、Lr26、Lr34和Lr46，其中小种特异性ASR基因（尤其是Lr1和Lr26）占最大份额。由于其显著的小种特异性，田间病原菌群体毒性小种的持续进化使这些基因极易被克服。相比之下，具有慢锈性特征的APR基因如Lr34和Lr46赋予更持久的抗性，但其在当前栽培品种中的覆盖率仍相对较低。因此，系统筛选和表征具有慢锈性或成株期抗性的小麦种质，对于推进中国小麦改良项目中的持久抗性育种具有重要实践意义。近年来，中国主要Pt群体的生理小种组成发生了显著的时间演变。一项为期15年（2007—2021）的国家监测研究涉及从20个省、市、自治区采集的2900个Pt分离株，结果显示小种THTT、THTS、THTQ、THTR、THKT和THTK在不同时期和小麦种植区先后或同时成为优势小种。值得注意的是，在中国最大小麦产区黄淮海麦区，2020年前后小种组成进一步向THTT、THTS及其近缘变异型偏移，这些小种对Lr1、Lr2c、Lr10、Lr14a和Lr26具有高毒性频率。同时，此前对Lr9、Lr24、Lr28和Lr38无毒的毒性组合在某些年份也呈现频率上升趋势。这一动态变化意味着，一些此前在黄淮海地区表现良好的品种，其抗性基础可能已被或正被当前田间流行的优势小种所克服。目前，仅Lr9、Lr24、Lr28、Lr38和Lr42等有限基因对中国流行小种仍保持有效，而Lr2c、Lr10、Lr12、Lr14a、Lr22a、Lr33和Lr36等基因的抗性已基本丧失。因此，对2020—2022年国家审定小麦品种开展抗性基因鉴定，不仅对于阐明当前推广品种的抗性基础至关重要，而且对于响应黄淮海麦区小种组成的新变化、促进品种布局策略的及时调整也具有重要意义。本研究选取2020—2022年期间获批释放的48个国家审定小麦品种，采用整合基因推导、分子标记检测和辅助系谱分析的多模式分析流程，表征这些品种携带的叶锈病抗性基因。所得结果为抗性品种的合理空间布局、有效田间病害管理方案的制定以及小麦锈病抗性育种项目中优良抗性供体的定向筛选奠定了坚实的理论基础。研究材料为48个国家审定小麦品种，以及38个近等基因系（NILs），每个NIL均具有普通小麦品种Thatcher的统一遗传背景并携带单个已报道的Pt抗性基因，以及感病品种郑麦5389。用于基因推导的16个Pt分离株代码为FGDT、FGST、FGTT、FJPS、FGPT、FGPK、NHJT、TKTS、FKTT、THPT、THTK、TKTR、FGRT、FJTT、THTT和TKTK。所有材料由中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室提供。所有分离株均从自然采集样品中分离鉴定，繁殖不超过5代。这些分离株按Pt北美命名系统命名。苗期抗性评估按照国家标准GB/T 45211.2-2025进行。所有品种依次播种于育苗盘（40 cm×20 cm×15 cm），每品种每穴5—7粒种子（每盘约40个品种）。第一叶完全展开后（即播种后约7—10天），通过将夏孢子与矿物油（Soltrol? 170）按每100 mL油10 mg孢子比例混合制备各Pt分离株的孢子悬浮液。使用GM0.5A真空泵（天津金腾实验设备有限公司，中国天津）将悬浮液均匀喷雾接种于幼苗。接种后，幼苗在黑暗、饱和湿度室（保持20 °C、100%相对湿度）中孵育24 h，随后转移至保持26 °C（16 h）/18 °C（8 h）、光周期16/8 h的温室中发病。接种后14—18天采用GB/T 45211.2-2025规定的0、;、1、2、3和4分级标准评估侵染型（ITs）。评估每品种所有完全展开的接种叶片。当感病对照（郑麦5389）IT为3或4时，评估视为有效。基因推导按照Dubin等的方法进行。统计分析使用SAS 9.1.3软件（Statistical Analysis Systems，Cary，NC，USA）进行。田间试验在河北廊坊进行。每品种根据其审定年份连续两年评估，以病害严重度最高年份的结果作为最终评估。评估方案严格遵循国家标准GB/T 45211.2-2025的操作规范。每品种种植单行1 m长、行距0.33 m，每品种3个重复行，随机完全区组设计。每20个测试行后种植感病品种郑麦5389作为诱发行。分蘖期使用当前两个优势Pt生理小种（PHT（A/V：2a，9，24/1，2c，3，3ka，16，17，26，30）和THT（A/V：9，24/1，2a，2c，3，3ka，11，16，17，26，30））等量混合的孢子悬浮液接种，浓度约为每L水1 g夏孢子并添加1 mL 0.05% Tween 20。从乳熟期开始，每隔10—15天进行三次病害评估，记录侵染型、普遍率和严重度。按GB/T 45211.2-2025要求计算病情指数以获得综合评价结果，三次评估中最严重的病害等级记录为最终结果。使用Plant Genomic DNA Kit（天根生化科技（北京）有限公司，中国北京）从测试小麦植株叶片提取基因组DNA。每品种取3个单株，等比例混合组织制备DNA提取样品。DNA浓度使用ND-1000 NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）定量，随后用ddH2O稀释至50 ng/μL工作浓度用于下游分析。为筛选48个国家审定小麦品种中的特定叶锈病抗性基因，选择以下Lr基因的紧密连锁或共分离分子标记：Lr1、Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24、Lr26、Lr28和Lr34。所有引物由北京擎科生物科技有限公司（中国北京）合成。每次PCR运行包括三类对照：（i）阳性对照，由相应Lr基因近等基因系（TcLr1、TcLr9、TcLr10、TcLr19、TcLr20、TcLr24、TcLr26、TcLr28）提取的基因组DNA组成，以验证各标记的特异性和正确片段大小；（ii）阴性对照，由不携带任何测试Lr基因的感病品种郑麦5389基因组DNA组成，以确认无非特异性扩增；（iii）空白对照，以无菌ddH2O代替DNA模板，检测潜在试剂污染。所有对照在与测试品种相同的PCR条件下处理并在同一凝胶上电泳以确保结果可比性。PCR反应体系总体积20 μL，包含50 ng DNA模板、正反向引物各1 ng、10 μL 2× Unique Taq Super Master Mix（诺禾致源，中国北京）和7 μL ddH2O。各引物对的具体退火温度见表2。扩增后，PCR产物在1.5—2%琼脂糖凝胶上200 V电泳20—25 min。使用集成凝胶成像系统可视化、记录并保存条带。结果显示，在这些品种中，19个（40%）具有Lr1的诊断分子标记，3个（6%）具有Lr10，33个（69%）具有Lr26，6个（13%）具有Lr28。Lr9、Lr19、Lr20、Lr24和Lr34的分子标记在所有测试品种中均未检测到。16个Pt分离株（具有不同毒性谱）与38个近等基因系（NILs）的互作表型分析表明，该组分离株可用于推定19个Lr基因，如Lr1、Lr2a、Lr2b、Lr3、Lr11、Lr14a、Lr15、Lr18、Lr20、Lr21、Lr25、Lr26、Lr30、Lr32、Lr33、Lr37、Lr39、Lr40和Lr41。对48个国家审定小麦品种的分析推定出7个叶锈病Lr基因（Lr1、Lr11、Lr14a、Lr15、Lr26、Lr33和Lr39），以单一或组合形式存在。然而，对于7个品种（国红12、扬麦39、商道29、新世纪878、中研麦688、西农625和大平原1），无法推定任何Lr基因。5个品种（合麦32、泛麦803、徐麦44、秦农168和农麦176）被推定仅携带未知Lr基因。Lr1基因除对NHJT、TKTS、THPT、THTK、TKTR、THTT和TKTK表现感病（高侵染型）外，对所有Pt分离株均赋予抗性（低侵染型）。15个品种对所有对Lr1无毒的Pt分离株表现抗性。值得注意的是，它们对FGRT分离株的侵染型略低于Lr1携带者，表明这些品种中存在Lr1加未知Lr基因。Lr11对FGDT、FJPS、FGPT、FGPK和THPT分离株表现低侵染型。6个品种对这些分离株表现出相应抗性模式。此外，它们对FGPK分离株的侵染型略低于Lr11携带者，表明Lr11与未知Lr基因共存。Lr14a对TKTR分离株赋予特异性抗性，在21个品种中也观察到该模式，表明存在Lr14a。类似地，新麦163和另外3个品种被推定携带Lr15加未知Lr基因；连丰707和另外32个品种被推定携带Lr26；连丰707和另外5个品种被推定携带Lr33。此外，穗1615被推定除Lr14a和Lr26外还携带Lr39。通过整合分子检测和基因推导结果，研究人员发现两者存在差异。例如，品种徐麦44的分子标记基因分型与基因推导结果之间存在显著差异。尽管徐麦44扩增出Lr1的诊断标记WR003（753 bp片段），但其对全部16个Pt分离株的苗期侵染型（IT 3—4）不符合预期的Lr1介导抗性表型（IT 0—1）。Lr1诊断标记的存在与功能性Lr1抗性表型缺失之间的这种脱节表明，WR003标记在该遗传背景中可能不再与功能性Lr1等位基因紧密连锁，或徐麦44携带无功能或沉默的Lr1等位基因。该材料在抗性基因部署策略中值得特别关注。此外，由于Lr10和Lr28基因对所有测试菌株均表现高度感病侵染型，无法用于基因推导。然而，研究人员对这两个基因进行了分子标记检测。因此，研究人员认为携带分子标记的品种也是相应两个基因的携带者。例如，国红12同时携带Lr10和Lr28基因。在48个测试品种中，分子标记筛选和基因推导分析共在39个品种（81.25%）中鉴定出已表征的Lr基因（Lr1、Lr10、Lr11、Lr14a、Lr15、Lr26、Lr28、Lr33和Lr39），以单一或各种组合形式存在。其余9个品种（18.75%）基于本研究所用标记不携带任何已表征Lr基因。在这9个品种中，4个品种（扬麦39、商道29、新世纪878和中研麦688）在苗期对所有测试Pt小种表现感病侵染型，缺乏有效ASR基因；其余5个品种（10.4%）在苗期对至少一个Pt分离株表现抗性反应，表明存在未表征的、可能为新抗性基因。在评估叶锈病APR的48个国家审定小麦品种中，仅2个品种洛麦27和穗1615表现高抗（HR）反应。商麦178和徐科6表现慢锈性抗性。7个品种表现中抗（MR）：连丰707、顺麦10、中植麦13、梁山108、郑品麦25、沃麦33和普麦116。其余37个品种被归类为中感（MS）或高感（HS）。共有11个品种表现抗性（MR、HR和SR），占所有测试品种的23%。所有抗性品种均携带已知和未知抗性基因。已知基因赋予的抗性大多已被流行生理小种克服。其抗性可能来源于未知基因或多基因的累积效应。这些品种均可作为抗性来源利用，尤其是洛麦27、穗1615、商麦178和徐科6。讨论部分指出，中国小麦叶锈病的系统研究曾因显著的历史中断而停滞，导致该国内研究领域的发展轨迹相对滞后于持续的国际进展。同时，全球气候变化和病原菌毒性的适应性进化正在加剧叶锈病的威胁，对中国粮食安全构成逐年升级的威胁。有效部署抗性小麦品种是病害管理的基石策略。因此，对中国小麦品种尤其是后备主栽品种进行系统抗性评估和遗传表征至关重要。这项工作将为抗性基因布局奠定科学基础，从而加强中国小麦叶锈病的综合管理。Lr1基因最初由Mains等在品种'Malakoff'中鉴定。此后其在全球小麦品种中的普遍性得到证实。本研究中，Lr1基因在15个测试品种中被推定并分子检测到，表明该基因在中国小麦种质中仍广泛分布。系谱分析表明，'连丰707'、'沃麦1211'、'中麦34'、'沃麦33'和'普麦116'等品种具有源自'周麦16'的共同血缘。因此推测这些品种中的Lr1基因遗传自'周麦16'。类似地，'顺麦10'、'中植麦13'、'源丰519'和'中麦5215'等品种均追溯至'周麦22'。'周麦22'的亲本为'周麦12'/'温麦6'//'周麦13'，而'温麦6'是已知的Lr1基因携带者。因此推测该组品种中的Lr1基因来源于'温麦6'。'温麦801'中的Lr1基因可能来源于'百农64'。'徐科6'和'华麦169'均具有来自'周麦16'和'周麦22'的血缘，表明其Lr1基因可能遗传自其中一个或两个祖先品系。尽管在'徐麦44'中检测到Lr1的分子标记，且该品种也源自'周麦16'，但基于表型数据的基因推导揭示了不一致性。具体而言，'徐麦44'仅对分离株THTK表现低侵染型，而对其他15个测试分离株表现高侵染型。其抗谱显著窄于携带Lr1基因的近等基因系。此外，APR评估将'徐麦44'归类为对叶锈病中感。这些结果共同表明'徐麦44'不具有功能性Lr1基因。标记存在与表型缺失之间的观察差异可能归因于叶锈病抗性在'徐麦44'育种过程中不是选择目标，可能导致Lr1基因的丢失或失活，尽管连锁标记区域得以保留。Lr26基因位于1BL/1RS黑麦-小麦染色体易位片段上，该片段以赋予多种农艺优良性状而著称，包括增强的抗病性、产量潜力和降低株高。20世纪70年代，中国为小麦育种项目引入了许多携带该易位的品种，如Avrora、Lovrin 10、Lovrin 13、Predgornaya 2、Kavkaz和Neuzucht，导致其在中国小麦品种中广泛传播。该易位尤其普遍，存在于超过50%的冬小麦品种中。与这一历史背景一致，研究结果在33个（69%）测试品种中鉴定出Lr26基因，证实其在中国小麦中持续广泛分布。除'全麦32'、'新麦163'、'郑麦5135'、'洛麦116'和'永丰108'外，其余28个品种具有追溯至'周8425B'的共同系谱。因此，这些衍生品种中的Lr26基因可能来源于'周8425B'。'周8425B'作为黄淮海麦区的关键基础亲本，因其强大的抗病性、抗逆性、半矮秆、大穗形态和广泛适应性而受到重视。除携带1BL/1RS易位外，该品种还拥有多个锈病抗性基因，包括叶锈病抗性基因LrZH84和LrZH22/Lr13，以及条锈病抗性基因YrZH84、YrZH84.2、Yr30和YrZH22。因此，本研究中评估的'周8425B'衍生品种中检测到的未鉴定叶锈病抗性基因也可能遗传自该祖先品种。然而，测试品种中Lr26的高频率（69%）对中国小麦抗性的遗传一致性提出了重大担忧。单一抗性基因的大规模部署，尤其是位于广泛分布染色体易位上的基因，对病原菌群体施加了强烈的定向选择压力。这可能导致克服Lr26的毒性小种快速出现和增殖，从而使该基因失效并加剧流行风险。为降低这一风险，育种项目必须多样化抗性来源，纳入具有不同特异性的多个抗性基因，并优先部署持久的成株期抗性基因如Lr34和Lr46。将这些策略整合到长期、多层次的锈病管理框架中，对于维持抗性持久性和最小化病原菌群体毒性变化的影响至关重要。本研究中，在一些小麦品种中检测到Lr10的分子标记。然而，由于特异性病原菌株的可用性有限，无法对这些位点的基因进行完整推导。系谱分析表明，存在于'源丰519'和'梁山108'祖先中的'周8425B'携带Lr10。这一发现与先前研究一致，从而证实了本研究获得的分子检测结果的准确性和可靠性。值得注意的是，测试品种中Lr10的低检测频率似乎与其已知携带者'周8425B'在系谱中的广泛存在相矛盾。这种差异可能归因于该抗性基因在小麦抗病育种过程中功能效力的潜在侵蚀或"丢失"。具体潜在机制值得进一步研究。Lr34基因位于染色体7DS上，通过慢锈性表型赋予持久的成株期抗性。本研究中，使用了Lr34特异的共显性分子标记。该基因在所有测试品种中均未检测到，这一结果与先前报道一致。这种缺失表明当前中国审定小麦品种中Lr34的频率可能较低。从育种角度来看，这种缺陷可归因于国内小麦育种项目长期强调苗期抗性，苗期抗性通常由主效、小种特异性基因控制，在田间赋予易于观察和高水平的抗性。相比之下，Lr34等成株期抗性基因赋予部分、非小种特异性抗性，更难以表型鉴定，需要多环境田间试验才能准确评估。中国成株期抗性育种策略启动相对较晚且整合有限，进一步导致了Lr34的利用不足。尽管Lr34单独存在时表现出明显可识别的慢锈性表型，通常伴有叶尖坏死，但其潜力在中国小麦育种中尚未充分实现。因此，迫切需要将育种范式转向将Lr34等持久抗性基因纳入优良种质，辅以分子标记辅助选择和慢锈性性状的表型筛选，以增强中国小麦叶锈病抗性的可持续性。对测试小麦品种的系谱分析揭示了部分条目中潜在存在叶锈病抗性基因Lr11、Lr14a、Lr15、Lr33和Lr39。这些抗性基因的来源可追溯至'先农39'、'烟农19'、'百农64'、'周8425B'、'Norin 10'或'Orofen'等祖先品种。因此推测这些品种中存在的基因可能来源于各自的祖先品系。然而，由于紧密连锁分子标记或特异性病原菌株可用性等限制，这些基因的存在需要进一步验证。此外，对于少数遗传背景复杂的品种（如'全麦32'），其抗病基因的具体来源无法确定。值得注意的是，大多数测试小麦品种间的整体遗传多样性较低，观察到密切的遗传亲缘关系。大多数品种具有来自'周麦22'、'鲁麦1'、'鲁麦13'或'鲁麦14'等基础亲本的共同血缘，这些亲本本身主要来源于'周8425B'、'Lovrin 10'或'Orofen'等关键祖先品种。这一模式表明测试品种具有相对狭窄的遗传背景，可能限制这些品种的应用范围。结论部分指出，本研究分析了2020—2022年中国新审定小麦品种，特别关注华北平原品种，评估了其对小麦叶锈病的抗性并鉴定了其主要抗性基因。这些结果可为这些品种在未来生产中的合理应用提供重要参考。然而，受实验菌株毒性谱的限制，本研究仍存在一定不足。对于需要使用本文所调查小麦品种的读者，可根据具体研究需求补充额外菌株进行验证试验，以阐明一些应用频率相对较低的抗性基因的存在。此外，众多类似研究中分子标记假阳性结果的频繁出现表明，分子标记在应用于标记开发原始群体以外的遗传群体时可能表现出固有局限性。因此，在选择分子标记进行相关分析时，应充分关注目标群体的遗传背景。