原位激活的工程细菌释放复合双治疗蛋白，用于肿瘤免疫疗法

《iScience》：In situ-activated engineered bacteria release combined dual-therapeutic proteins for tumor immunotherapy

　　亮点
- 双载荷装载的S. typhimurium通过缺氧和群体感应实现肿瘤治疗
- GM-CSF和CD47nb协同增强树突状细胞、巨噬细胞和T细胞的活化
- 在位激活的工程化S. typhimurium抑制肿瘤生长并延长生存期

摘要
抗肿瘤药物的组合对有效的肿瘤免疫治疗至关重要。然而，实现精确的、原位的 therapeutic 荷载共递送仍然是一个重大挑战。在这里，我们开发了一种双载荷装载的 Salmonella typhimurium 菌株，该菌株能够在肿瘤缺氧和细菌群体感应 (QS) 的作用下释放粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 和 CD47 抗体 (CD47nb)。GM-CSF 促进树突状细胞 (DC) 的成熟，并增强 M1 型巨噬细胞的浸润，从而促进抗原呈递和 CD8+ T 细胞的活化。CD47nb 阻断 CD47-SIRPα 信号通路，从而增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。这种联合递送方式将成熟 DC 的浸润率从 13.5% 提高到 34.9%，促进 M1 型巨噬细胞的活化和 CD8+ T 细胞在肿瘤微环境 (TME) 中的积聚，抑制肿瘤生长 83.7%，并将小鼠的中位生存期从 14 天延长到 28 天。总之，我们的发现支持精确的、原位的免疫调节剂共递送作为一种有前景的肿瘤免疫治疗策略。

图形摘要

引言
肿瘤免疫治疗旨在利用和增强宿主免疫系统来消除癌细胞，在过去十年中取得了显著进展。抗原呈递细胞 (APCs)，特别是树突状细胞 (DCs) 和巨噬细胞，在这项策略中起着关键作用，它们协调 T 细胞的活化并介导肿瘤清除。然而，肿瘤微环境 (TME) 对有效的免疫反应构成了巨大障碍。由于缺氧、营养缺乏和酸中毒等不利条件，大多数肿瘤相关巨噬细胞表现出促肿瘤的 M2 表型，而不是抗肿瘤的 M1 表型。此外，免疫抑制性的 TME 会抑制 DC 的成熟，从而限制 T 细胞的启动并削弱全身抗肿瘤免疫力。更复杂的是，癌细胞利用内在的分子机制逃避免疫监视。癌细胞表面过度表达的 CD47 是一种配体，它可以与巨噬细胞上的信号调节蛋白 α (SIRPα) 结合，发出“不要吃我”的信号，从而抑制吞噬作用。因此，单用一种免疫调节剂的治疗方法往往无法引发有效的反应。此外，传统的非靶向递送平台常常导致治疗药物在局部浓度不足，影响治疗效果并增加脱靶毒性的风险。鉴于这些限制因素，迫切需要原位递送协调治疗药物以重建 TME 并增强抗肿瘤免疫治疗。由于细菌具有内在的免疫原性和对肿瘤缺氧坏死核心的自然趋向性，它们已成为局部递送多种治疗药物（包括细胞毒性蛋白、细胞因子、纳米抗体和小干扰 RNA）的有希望的载体。其中，减毒的 Salmonella typhimurium (S. typhimurium) 在细菌癌症治疗中特别受到关注。作为一种兼性厌氧菌，S. typhimurium 在肿瘤组织中的积累量约为健康器官的 10,000 倍，非常适合作为原位递送治疗蛋白的载体，且其递送效果依赖于细菌密度。此外，在工程细菌中加入对疾病部位标记物敏感的传感器元件，可以精确地协调多种治疗蛋白的递送时间和空间，显著提高治疗的安全性和有效性。在这里，我们改造了 S. typhimurium VNP20009 菌株（称为 VNPΔ-CGA），使其成为一种双载荷递送系统，能够根据肿瘤缺氧和细菌群体感应 (QS) 释放信号和免疫调节功能。在缺氧的 TME 中，VNPΔ-CGA 分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)，这种免疫刺激因子促进 DC 的成熟，并增强巨噬细胞向促炎性 M1 型表型的极化，从而促进抗原呈递和随后的 CD8+ T 细胞活化。随着细菌增殖，群体感应 (QS) 被激活，触发 CD47 抗体 (CD47nb) 的表达和释放，这种免疫检查点抑制剂靶向 CD47-SIRPα 通路，加强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。通过将载荷释放与细菌环境信号联系起来，即缺氧时释放 GM-CSF，QS 时释放 CD47nb，该系统实现了时空协调的免疫刺激。GM-CSF 和 CD47nb 的共同作用增强了工程细菌的抗肿瘤效果。总之，本研究提出了一种基于工程细菌的策略，用于在 TME 内时空协调地递送互补的免疫调节蛋白，为改进肿瘤免疫治疗提供了一种潜在方法。

结果
为了验证 GM-CSF 和 CD47nb 的有效性，我们纯化了这两种蛋白，并使用图 S1A 和 S1B 中所示的实验方法在体外验证了它们的功能。简而言之，纯化的 GM-CSF 与 RAW264.7 细胞孵育，随后测量了 CD80+ CD86+ RAW264.7 细胞的比例变化。观察到 GM-CSF 组中的 CD80+ CD86+ RAW264.7 细胞比例增加到 17.6%，而空白组仅为 0.1%（图 S1C 和 S1D）。同样，当梯度稀释的 CD47nb 与小鼠结直肠癌细胞 (CT26) 共孵育时，发现随着 CD47nb 浓度的增加，CD47阳性细胞的比例降低，表明 CD47nb 能够结合肿瘤细胞表面的 CD47（图 S1E）。
接下来，我们探讨了工程细菌是否能够在缺氧的 TME 和高细菌密度下调节治疗蛋白的释放。根据图 1A 中的设计，在 S. typhimurium 中测试了三种氧气依赖性启动子。如图 1B 所示，在厌氧条件下，yfiD-m-Lux 菌株的发光强度最高，诱导倍数达到 103.8 倍。随后，我们实施了 QS 系统，并将 sfGFP 报告基因置于 plux 启动子下游。该 QS 系统包括自诱导酶 LuxI、转录调节因子 LuxR 和 plux 启动子。LuxI 合成 N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone (3OC6HSL)，激活 LuxR 以启动 plux 后的转录（图 1C）。我们的结果证实了荧光强度与细菌细胞密度之间存在明显的正相关关系，证明了 QS 电路的密度依赖性激活（图 1D 和 1E）。基于上述验证，我们继续组装用于控制治疗蛋白分泌的功能模块。我们选择了性能优异的 yfiD-m 启动子在厌氧条件下触发 HA 标记的 GM-CSF 表达，肽 MISSSSIS 有助于其分泌（图 1F）。西方印迹 (WB) 结果证实 MISSSSIS 可以将 GM-CSF 分泌到培养基中（图 1G）。我们利用 QS 系统来调节 Flag 标记的 CD47nb 和分泌肽 OmpA 的表达，从而实现其从细菌中的释放（图 1H）。工程细菌既能表达又能分泌 CD47nb，而野生型 S. typhimurium 则不能（图 1I）。总体来看，这些结果表明，我们工程细菌底盘可以有效地通过两种关键生理刺激（缺氧的 TME 和细菌种群密度）来调节两种不同治疗载荷的释放。

为了验证 GM-CSF 和 CD47nb 的有效性，我们纯化了这两种蛋白，并使用图 S1A 和 S1B 中所示的实验方法在体外验证了它们的功能。简而言之，纯化的 GM-CSF 与 RAW264.7 细胞孵育，随后测量了 CD80+ CD86+ RAW264.7 细细胞的比例变化。观察到 GM-CSF 组中的 CD80+ CD86+ RAW264.7 细胞比例增加到 17.6%，而空白组仅为 0.1%（图 S1C 和 S1D）。同样，当梯度稀释的 CD47nb 与小鼠结直肠癌细胞 (CT26) 共孵育时，发现随着 CD47nb 浓度的增加，CD47 阳性细胞的比例下降，表明 CD47nb 能够结合肿瘤细胞表面的 CD47（图 S1E）。
接下来，我们探讨了工程细菌是否能够在缺氧的 TME 和高细菌密度下调节治疗蛋白的释放。根据图 1A 中的设计，在 S. typhimurium 中测试了三种氧气依赖性启动子。如图 1B 所示，在厌氧条件下，yfiD-m-Lux 菌株的发光强度最高，诱导倍数达到 103.8 倍。随后，我们实施了 QS 系统，并将 sfGFP 报告基因放置在 plux 启动子下游。该 QS 系统由自诱导酶合成酶 LuxI、转录调节因子 LuxR 和 plux 启动子组成。LuxI 合成 N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone (3OC6HSL)，激活 LuxR 以启动 plux 后的转录（图 1C）。我们的结果证实了荧光强度与细菌细胞密度之间的正相关关系，证明了 QS 电路的密度依赖性激活（图 1D 和 1E）。基于上述验证，我们继续组装用于控制治疗蛋白分泌的功能模块。我们选择了性能优异的 yfiD-m 启动子在厌氧条件下触发 HA 标记的 GM-CSF 表达，肽 MISSSSIS 有助于其分泌（图 1F）。西方印迹 (WB) 结果证实 MISSSSIS 可以将 GM-CSF 分泌到培养基中（图 1G）。我们利用 QS 系统来调节 Flag 标记的 CD47nb 和分泌肽 OmpA 的表达，从而实现其从细菌中的释放（图 1H）。工程细菌能够表达并分泌 CD47nb，而野生型 S. typhimurium 则不能（图 1I）。总体而言，这些结果表明，我们工程细菌底盘释放两种不同治疗载荷的效果可以有效地通过两种关键生理刺激来调节：缺氧的 TME 和细菌种群密度。

我们进一步开发了一种能够同时自主调节 GM-CSF（由缺氧条件诱导）和 CD47nb（由 QS 信号诱导）释放的工程细菌（图 3A）。为了最大化该系统的功能输出，我们基于先前报道的信号肽和 InfB 标签优化策略优化了分泌模块。具体来说，我们选择了外膜蛋白衍生的 OmpC 和 OmpF 信号肽序列，并评估了将增溶标签 InfB 放在 GM-CSF 的 N 端或 C 端的效果（图 2A；表 S1）。同时，我们监测了 CD47nb 的产生情况。通过 ELISA 测定了培养上清液中的 CD47nb（图 2B）和 GM-CSF（图 2C）浓度。结果表明，结合 OmpF 分泌肽和 N 端 InfB 标签（OmpF-infB-GM-CSF）的电路产生了最高的 GM-CSF 和 CD47nb 的细胞外水平。这种优化的双功能菌株被命名为 VNP-CG，用于后续实验。

为了构建具有遗传稳定性的治疗细菌菌株，我们建立了一个基于 asd 基因（编码天冬氨酸半醛脱氢酶）的平衡致死宿主-载体系统。在 S. typhimurium 载体中删除了染色体 asd 基因，创建了一个营养缺陷宿主 (VNPΔasd)。然后将一个 constitutively 表达的 asd 卡匣插入治疗质粒中，使得质粒的携带成为生存的必要条件。获得的菌株被命名为 VNPΔ-CGA（图 2D）。这种稳定系统没有影响细菌的生长（图 S2A）。其有效性通过在没有抗生素的培养基中的连续传代得到了证明。对于对照菌株 VNP-CG，质粒丢失在传代早期就开始了。到第三代时，出现了无质粒的细胞亚群，表明不稳定性的开始。到第九代时，只有大约 27% 的 VNP-CG 细菌保留了工程质粒，而 VNPΔ-CGA 几乎 100% 保持了质粒（图 S2B）。功能上，VNPΔ-CGA 的 CD47nb 分泌与细菌生长相关。在细菌密度达到稳定阶段后，培养上清液中的浓度趋于平稳，最大值为 14.8 ng/mL（图 2E 和 2F）。在厌氧条件下培养 8 小时后，ELISA 测定显示 VNPΔ-CGA 培养上清液中的 GM-CSF 浓度为 77.3 ng/mL（图 2G）。
为了评估工程细菌产生的 CD47nb 和 GM-CSF 的生物活性，我们将 PBS、野生型 S. typhimurium VNP20009 培养上清液和工程细菌培养上清液与 CT26 细胞共孵育 24 小时。孵育后，我们测量了 CD47 阳性细胞的比例。在工程细菌组中，这一比例降至 6.83%，显著低于其他两组（图 2H 和 2I），表明 CD47nb 有效结合了 CD47 蛋白，阻断了 CD47-SIRPα 信号通路。同样，野生型 S. typhimurium 和工程细菌在厌氧条件下培养 12 小时，然后将 RAW264.7 细胞与 DMEM、稀释的野生型 S. typhimurium 上清液或工程细菌上清液共孵育 48 小时。流式细胞术分析显示 CD80+ CD86+ 细细胞的比率分别为 0.99%、55.1% 和 62.9%（图 2J 和 2K）。在工程细菌组中，CD80+ CD86+ 细胞的比例比阴性对照组高出7.8个百分点，这表明GM-CSF的表达可以促进RAW264.7细胞向M1型巨噬细胞的转化。为了研究质粒稳定性对工程细菌治疗效果的影响，我们首先检测了重组质粒在VNPΔ-CGA中的体内维持情况。将质粒通过静脉注射（i.v.）给予携带皮下（s.c.）CT26肿瘤的BALB/c小鼠后，24小时采集肿瘤组织，进行匀浆处理，并接种在含有链霉素（Sm）或链霉素和卡那霉素（Sm + Kan）的LB琼脂平板上。细菌生长分析显示，VNPΔ-CGA在Sm培养基和Sm + Kan培养基上的菌落数量没有显著差异，表明质粒在体内稳定维持。相比之下，VNP-CG在Sm + Kan培养基上的菌落数量减少了大约四个数量级（见图3A和3B），这表明工程质粒有显著丢失。通过引入luxCDABE报告基因盒到工程质粒中，对切除的肿瘤进行IVIS成像也证实了工程细菌中质粒的保留（见图3C）。图3显示，VNPΔ-CGA由于治疗性蛋白的稳定表达，更有效地抑制了肿瘤生长。

接下来，我们在CT26肿瘤携带的小鼠模型中评估了VNP-CG和VNPΔ-CGA的抗肿瘤效果（见图3D）。VNPΔ-CGA显示出比野生型S. typhimurium菌株VNP20009更强的抗肿瘤活性（见图3E–3G）。VNPΔ-CGA组的肿瘤重量分别为1.838克、0.922克、0.881克和0.311克，而VNP20009组的肿瘤重量分别为这些数值的六分之一和三分之一。VNPΔ-CG并未显示出比VNP20009更好的治疗效果，因为两组之间的肿瘤生长和重量没有显著差异。相反，VNPΔ-CGA显著降低了肿瘤重量（见图3G）。这些结果表明，稳定的质粒维持对于实现工程细菌的抗肿瘤潜力是不可或缺的。

为了评估携带双重和单一治疗蛋白的S. typhimurium的抗肿瘤效果，我们构建了VNPΔ-CA和VNPΔ-GA菌株（见图S3A和S3B）。在VNPΔ-CA中，CD47nb的表达受QS系统调控（见图S3C），而在VNPΔ-GA中，GM-CSF的产生受缺氧反应元件调节（见图S3D）。在CT26细胞皮下接种到BALB/c小鼠体内7天后，当肿瘤体积达到50–100立方毫米时，小鼠被随机分为五组：PBS（对照组）、S. typhimurium VNP20009、VNPΔ-CA（QS调控的CD47nb）、VNPΔ-GA（缺氧调控的GM-CSF）和VNPΔ-CGA（同时调控CD47nb和GM-CSF）。除PBS组外，所有组的小鼠均通过尾静脉注射接受2 × 10^6 CFU（菌落形成单位）的细菌（见图4A）。接种后三天，采集肿瘤组织进行WB和ELISA分析，以验证CD47nb和GM-CSF的体内表达（见图4B和4C）。数据表明，工程菌株被肿瘤内的缺氧微环境和QS信号激活，导致治疗性蛋白的局部释放。每隔两天监测一次肿瘤体积和体重，直至第12天（见图4D–4I）。与PBS处理相比，所有细菌处理组的肿瘤生长都有所减缓，其中工程细菌组的肿瘤抑制效果更显著（见图4D）。在研究结束时，肿瘤重量分析进一步证实了VNPΔ-CGA的优越疗效（见图4J）。VNPΔ-CGA处理的肿瘤重量显著低于VNP20009处理组，而VNPΔ-CA和VNPΔ-GA与VNP20009相比没有显著差异。生存分析进一步证明了VNPΔ-CGA的治疗益处（见图4K）。VNPΔ-CGA组的生存时间显著延长（p < 0.0001），中位生存时间为28天，而PBS组为14天。在所有处理组中，VNPΔ-CGA的中位生存时间最长，而VNP20009、VNPΔ-CA和VNPΔ-GA分别为24天（见图4K）。值得注意的是，在36天的观察期间，VNPΔ-CGA组有25%（2/8）的小鼠存活（见图S4A–S4E）。小鼠体重的变化保持在伦理可接受的范围内（< 20%的减轻）（见图S5）。为了进一步验证VNPΔ-CGA的抗肿瘤效果，我们建立了MC38肿瘤模型。VNPΔ-CGA治疗抑制了肿瘤生长并降低了肿瘤重量，同时保持了体重的稳定（见图S6）。

尽管用VNPΔ-CA、VNPΔ-GA和VNPΔ-CGA处理的小鼠的体重减轻与VNP20009组相似，我们还在治疗早期（第3天）和治疗结束时（第12天）评估了细菌的生物分布。接种后第3天，所有细菌菌株都在肿瘤组织中有效定植，检测到相似的细菌载量。治疗结束时，对肿瘤组织和主要健康器官（脾脏和肝脏）中的残留细菌进行定量分析，发现四组之间的肿瘤内细菌载量相似，平均约为每克组织8 × 10^8 CFU。相比之下，我们的工程菌株在健康器官中的持久性明显低于VNP20009（见图S7）。为了进一步评估细菌治疗的全身安全性，在治疗早期阶段和治疗结束时测量了血清中的促炎细胞因子和肝功能相关标志物。与对照组相比，VNPΔ-CGA处理的小鼠没有观察到炎症细胞因子或肝损伤相关标志物的显著升高（见图S8和S9），表明工程细菌菌株在治疗期间没有引起可检测到的全身毒性。

为了阐明细菌治疗引发的免疫反应，我们分析了接受工程S. typhimurium治疗后皮下CT26肿瘤携带小鼠TME中的免疫细胞群体，重点关注包括巨噬细胞和树突状细胞（DCs）在内的APCs。我们发现，CD45+细胞中的免疫活化M1型巨噬细胞（F4/80+ CD80+）比例如下：PBS处理组为13.0%，VNP20009组为11.9%，VNPΔ-CA组为10.7%，VNPΔ-GA组为18.1%，VNPΔ-CGA组为20.4%。值得注意的是，VNPΔ-GA和VNPΔ-CGA组中M1型巨噬细胞的比例显著增加（见图5A和5B）。此外，VNPΔ-CA组中免疫抑制性M2型巨噬细胞（CD206+）的比例最低，为5.4%，而VNPΔ-CGA、VNPΔ-GA和VNP20009组的比例分别为10.6%、12.4%和12.5%，对照组为19.8%（见图5C和5D）。这些数据表明GM-CSF可以增强M1型巨噬细胞的招募，而CD47nb可以减弱TME中的M2型巨噬细胞浸润。对DCs的分析显示，GM-CSF促进了DC的成熟，表现为高CD80和CD86表达。成熟DC的比例分别为PBS处理组12.1%，VNP20009组13.5%，VNPΔ-CA组17.8%，VNPΔ-GA组21.3%，VNPΔ-CGA组最高（见图5E和5F）。相应地，M1型巨噬细胞与M2型巨噬细胞的比例分别为PBS组的0.7、VNP20009组的1.0、VNPΔ-CA组的2.1、VNPΔ-CGA组的2.4，表明VNPΔ-CGA组有升高趋势（见图S10）。鉴于APCs的增加，我们接下来通过流式细胞术和免疫荧光染色检查了细胞毒性CD8+ T细胞的浸润情况。流式细胞术分析显示，VNPΔ-CGA处理增加了肿瘤组织中的CD3+ CD8+ T细胞比例（见图5G和5H）。CD8免疫荧光染色也显示VNPΔ-CGA组的CD8+细胞数量增多，定量分析证实每个视野中的CD8+ T细胞数量显著增加（见图S11A和S11B）。结合VNPΔ-CGA处理后DC成熟的增加，这些结果表明双载量工程细菌促进了抗原呈递相关的免疫激活，并增强了TME中的细胞毒性T细胞浸润。进一步测量了肿瘤中的细胞因子水平，以评估细菌治疗后的局部炎症反应。虽然一些细菌处理组的肿瘤组织中TNF-α、IL-6和IL-γ水平有所升高，但各组之间没有统计学上的显著差异（见图S12A–S12C）。然而，细菌处理后IL-10水平升高（见图S12D）。最近的研究表明，IL-10可能在细菌肿瘤免疫治疗中发挥有益作用，通过促进细菌在肿瘤中的持久性和参与CD8+ T细胞相关的免疫重塑。因此，VNPΔ-CGA处理后观察到的IL-10水平升高可能反映了由细菌在TME中定植诱导的IL-10相关免疫调节过程。

总之，这些发现表明VNPΔ-CGA能够实现CD47nb和GM-CSF的局部递送。CD47nb用于靶向并结合肿瘤细胞上过度表达的CD47，阻断肿瘤细胞的“不要吃我”信号，增强巨噬细胞的吞噬作用。同时，GM-CSF与TME中M1型巨噬细胞特性的增加相关，并促进DC成熟，从而促进抗原呈递并增强CD8+ T细胞介导的肿瘤清除。在肿瘤组织中，GM-CSF的水平约为30.8 ng/g组织，而VNPΔ-CGA的积累水平比健康组织高约1000至10000倍。基于这种优先在肿瘤中积累的特性，使用了细菌的QS系统来优先促进肿瘤定植细菌中的CD47nb表达，这可能有助于减少对正常细胞（如红细胞）不必要的CD47阻断。这些结果共同支持了VNPΔ-CGA作为肿瘤免疫治疗工程细菌策略的潜力。VNPΔ-CGA的抗肿瘤活性主要在s.c. CT26肿瘤模型中进行了评估，这是一个广泛用于免疫治疗研究的同源结直肠癌模型，为评估细菌肿瘤定植、治疗效果和免疫重塑提供了实用平台。在这个模型中，VNPΔ-CGA显示出增加TME中M1样巨噬细胞与M2样巨噬细胞比例的趋势，促进了DC的成熟，并提高了CD8+ T细胞的浸润。然而，原位肿瘤或具有不同免疫背景的肿瘤可能表现出不同的解剖学和免疫学特征，在其他肿瘤模型中的评估将进一步有助于确定这种策略的更广泛适用性。生存分析显示VNPΔ-CGA与单载荷菌株之间存在中等程度的分离，在第36天时VNPΔ-CGA组有25%的小鼠存活。这一结果表明，尽管当前的双载荷设计在某种程度上改善了治疗效果，但对工程细菌平台的进一步改进可能会增强其抗肿瘤效果。值得注意的是，VNPΔ-CGA治疗增加了TME中免疫激活细胞群体的浸润，包括M1样巨噬细胞、成熟的DC（比VNP20009高出近20%）和CD8+ T细胞，表明这种工程细菌策略可以促进TME中的抗肿瘤免疫重塑。未来对该平台的优化可能侧重于改进载荷组合或整合互补的治疗模块以进一步增强肿瘤抑制作用。一个可能的方向是增加来自肿瘤细胞的肿瘤相关抗原(TAAs)或肿瘤特异性抗原(TSAs)的可用性，或者利用工程细菌生产TSAs，从而进一步提高抗肿瘤效果。此外，GM-CSF在肿瘤免疫中具有依赖环境的作用：相对低剂量的GM-CSF可以增强疫苗诱导的免疫反应，而较高剂量可能无法改善免疫反应，甚至可能通过招募或扩增髓系抑制细胞而产生免疫抑制作用。因此，通过工程细菌进行局部和调控的GM-CSF递送对于增强抗肿瘤免疫激活同时减少不希望的全身性或依赖环境的效果可能很重要。

研究的局限性
未来的研究应解决几个方面以进一步改进和评估这一策略。首先，VNPΔ-CGA的抗肿瘤效果主要在s.c.同源肿瘤模型中进行了评估，需要额外的原位或临床相关模型来评估其更广泛的适用性。此外，增加VNPΔ-CGA的可给药剂量而不加剧宿主毒性仍然是一个重要的目标。一种可能的策略是通过将细菌的存活能力与肿瘤相关信号（如缺氧或乳酸水平升高）联系起来，进一步提高肿瘤选择性细菌的存活能力。此外，TSAs和TAAs的有限可用性是否限制了T细胞的活化仍有待确定。因此，增加i.t.抗原的可用性可能代表了一个进一步的方向，以促进活化T细胞的浸润并提高抗肿瘤效果。

资源可用性
如需更多信息和资源及试剂的请求，请联系Ying Zhou（[e-mail]）。

材料可用性
本研究中生成的所有材料均可通过联系人获取。

数据和代码可用性
•本文报告的数据将应要求由联系人提供。
•本文没有报告原始代码。
•重新分析本文报告的数据所需的所有其他项目均可应要求从联系人处获得。

致谢
这项工作得到了中国国家重点研发计划（2024YFA0917100）和中国国家自然科学基金（32501359和22134003）的支持。

作者贡献
B.-C.Y.、Y.Z. 和 Z.-P.Z. 设计并监督了该项目。X.-G.W. 进行了主要实验。Y.-L.H. 和 X.-R.S. 参与了实验。Z.-P.Z. 和 X.-G.W. 撰写了论文。B.-C.Y.、Y.Z. 和 Z.-P.Z. 审阅了论文。

利益声明
作者声明没有竞争利益。

STAR

★方法
关键资源表
试剂或资源
来源
标识符

抗体
anti-Mouse IgG (H + L), HRP Conjugate
Transgen Biotech
Cat#HS201-01, RRID:AB_2629433
anti-DYKDDDDK Mouse Monoclonal Antibody
Transgen Biotech
Cat# HT201-01, RRID:AB_2927465
anti-HA Mouse Monoclonal Antibody
Transgen Biotech
Cat#HT301-01, RRID:AB_3076171
anti-mouse CD16/32
BioLegend
Cat#156603, RRID:AB_2783137
anti-CD47-FITC
Bioscience
Cat#11-0471-82, RRID:AB_837105
anti-CD86-PE
Proteintech
Cat#PE-65068, RRID:AB_2883865
anti-CD80-FITC
Proteintech
Cat#FITC-65076, RRID:AB_2883762
anti-CD45? CoraLite?594
Proteintech
Cat#CL594-65087, RRID:AB_3084658
anti-F4/80- eFluor? 450
BioLegend
Cat#48-4801-82, RRID:AB_1548747
anti-CD11b- APC-Cyanine7
Proteintech
Cat#AY7-65055, RRID:AB_3672359
anti-CD206-APC
BioLegend
Cat#17-2061-82, RRID:AB_2637420
anti-CD11c-APC
Proteintech
Cat#APC-65130, RRID:AB_2883012
anti-CD3-FITC
Proteintech
Cat#CL488-65077, RRID:AB_2883163
anti-CD8-APC-Cyanine7
Proteintech
Cat#AY7-Fc
A98472-2, RRID:AB_3746715

实验模型：生物体/菌株
VNP20009
Lab storage
N/ABL21
Transgen Biotech
Cat#CD601-02

化学品、肽和重组蛋白
DAP (2,6-二氨基吡甲基酸)
Sigma
Cat#33240
RIPA lysis buffer
Yeasen
Cat#20101
ES60
Collagenase IV
Biotopped
Cat#CG6160
CDNase I
Biotopped
Cat#D6071
CPercoll
Yeasen
Cat#40501
ES60

关键商业试剂盒
QuantiCyto? Mouse GM-CSF ELISA kit
NeoBioscience
Cat#EMC111.96
QuantiCyto? Mouse TNF-α ELISA kit
NeoBioscience
Cat#EMC102a.96
QuantiCyto? Mouse IL-6 ELISA kit
NeoBioscience
Cat#EMC004.96
QuantiCyto? Mouse IL-10 ELISA kit
NeoBioscience
Cat#EMC005.48
Zombie R718? Fixable Viability Kit
BioLegend
Cat#423115

实验模型：细胞系
CT26
Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Cat#TCM37
RAW264.7
Lab storage
N/A

实验模型：生物体/菌株
BALB/c
Shanghai Model Organisms Center
Cat#SM-003

软件和算法
GraphPad Prism 8
GraphPad
https://www.graphpad.com/
FlowJo 10.8.1
FlowJo, LLC
https://www.flowjo.com/
SnapGene 3.2.1
SnapGene
https://www.snapgene.com/

实验模型和参与者详情
伦理
来自上海模型生物中心的6周龄雌性BALB/c小鼠。所有动物程序均按照华东理工大学的实验动物护理和使用指南进行，并获得了华东理工大学动物伦理委员会的批准（ECUST-21038）。

细菌和细胞培养
所有菌株均以含有50%甘油的甘油库存形式储存在-80°C下。对于细菌培养，将10 μL的甘油库存涂布在含有相关抗生素（链霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素25 μg/mL和/或氨苄西林100 μg/mL）的LB固体平板上，在37°C或30°C下培养12小时。挑出菌落并接种到含相应抗生素的700 μL LB液体培养基中，在微孔摇床中（37°C或30°C，1000 rpm）培养过夜。之后，将活化的培养物稀释200倍到新鲜培养基中并继续培养至对数期。细胞在37°C、5% CO2湿润的环境中维持。CT26细胞（小鼠结肠癌，CRL-2638）购自中国科学院细胞库，在添加了10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-链霉素的1640培养基中培养。RAW264.7细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。

建立CT26肿瘤小鼠模型
从上海模型生物中心购买的6周龄雌性BALB/c小鼠（Cat#SM-003），在实验前进行了一周的适应。为了建立CT26皮下肿瘤模型，将5 × 10^5 CT26细胞以100 μL PBS的体积皮下注射到每只小鼠体内进行治疗效果实验，而用于生存曲线实验的则为1 × 10^6 CT26细胞以100 μL PBS的体积。当肿瘤体积达到50–100 mm^3时，小鼠被随机分配到不同的治疗组。第0天定义为小鼠首次接受PBS或细菌治疗的日子。处于对数生长阶段的工程细菌用冷PBS清洗两次后重新悬浮在PBS中。在第0天和第6天，通过尾静脉以每只小鼠2 × 10^6 CFU的剂量向小鼠体内注射PBS或细菌。每两天测量一次肿瘤体积和体重。肿瘤体积使用以下公式计算：体积 = (长度 × 宽度)/2。对于肿瘤生长和肿瘤重量测量，每组包含五只小鼠。对于流式细胞术免疫细胞分析，每组包含三只小鼠。对于血清细胞因子和肝功能分析，每组包含三只小鼠。对于肿瘤和主要器官中的细菌定植分析，每组包含五只小鼠。

方法详情
菌株和质粒的构建
本研究构建的所有菌株列在表S1（补充信息）中，关键的引物和相关基因序列列在表S2中。使用λ-Red重组方法通过CmR从VNP20009中敲除了asd基因。通过含有25 μg/mL氯霉素的LB琼脂平板选择正确的基因缺失克隆。质粒是通过pSC101的起点复制构建的。由于VNP20009对SmR的抗性，将pSC101的SmR抗性基因替换为KanR。MISSSSIS-GM-CSF-HA片段由Tsingke合成。用于本研究的OmpA、OmpC、OmpF、InfB肽、asd基因以及氧依赖性启动子和骨架的基因序列通过聚合酶链反应（PCR）扩增并通过重叠PCR或同源重组连接在一起。luxR-OmpA-Flag-CD47nb-luxI和yfiD-m-OmpF-infB-GM-CSF-HA片段通过PCR和重叠PCR获得。这些片段通过与pSC101骨架的同源重组连接。所得质粒分别命名为pWT-C、pWT-G、pWT-CG。插入asd基因后，它们被命名为pWT-CA、pWT-GA、pWT-CGA，其中C、G和A分别代表CD47nb、GM-CSF、asd基因。所有质粒均通过电穿孔转化到VNP20009或VNP20009Δasd中。

CD47nb和GM-CSF的表达和纯化
pET-28a-CD47nb或pET-28a-GM-CSF质粒分别转移到E. coli BL21菌株中。蛋白质根据E. coli BL21菌株的标准协议进行表达和纯化。具体来说，首先将细菌接种到5 mL LB培养基中并在37°C摇床中培养过夜。第二天，将细菌溶液接种到新鲜LB培养基中并培养至对数生长阶段。然后加入1 mM IPTG，在18°C下诱导目标蛋白表达16小时。之后，通过离心（8000 rpm，10分钟）收集细菌并用PBS洗涤，再用超声波细胞破碎器破碎。含有完整蛋白质的上清液通过离心（10000 rpm，10分钟）收集。完整蛋白质加载到用10 mM咪唑平衡的镍柱上。用20 mM咪唑洗涤柱子以去除杂质，然后用250 mM咪唑洗脱目标蛋白质并收集到离心管中。超滤管用PBS（4500 rpm，10分钟）洗涤，再将完整蛋白质溶液加入超滤管中浓缩。最后获得浓缩的目标蛋白质。

发光和OD600的测量
为了测量细菌在有氧和无氧环境下的发光信号，将活化的细菌分别接种到两个96孔板中，每孔加入200 μL新鲜LB培养基并培养至对数阶段。然后，其中一个转移到无氧环境中培养8小时。另一个在微孔摇床中（37°C，1000 rpm）继续摇荡以保持有氧状态。之后，将细菌转移到96孔白色板中，使用微孔读取器（BioTek Instruments, Winooski, VT, USA）测试OD600和发光信号。RLU/OD600表示归一化的发光信号。

Western blotting
为了检测CD47nb，将活化的细菌接种到新鲜培养基（1:200稀释）中培养约12小时。为了检测GM-CSF，将活化的细菌接种到新鲜培养基（1:200稀释）中培养至对数阶段，然后在无氧环境中诱导约8小时。之后，通过离心获得沉淀物和上清液。沉淀物用PBS重新悬浮，上清液通过超滤浓缩。诱导后的上清液储存在-80°C。沉淀物溶液和上清液与6 × protein loading buffer（TransGen Biotech）混合并在95°C下孵育10分钟。样品加载到12.5% SDS-PAGE凝胶（Beyotime biotechnology）的不同孔中，然后转移到PVDF膜（Merck）上，按照标准程序进行WB测试，使用抗-HA小鼠抗体和抗-Flag小鼠抗体（1:5000稀释）（TransGen Biotech）作为一级抗体来检测GM-CSF和CD47nb，使用辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗小鼠IgG（1:5000稀释）（TransGen Biotech）作为二级抗体。

酶联免疫吸附测定（ELISA）
对于CD47nb的检测：纯化的CD47nb与一系列稀释梯度一起在96孔ELISA板上孵育1小时，然后在37°C下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时。之后加入抗-Flag小鼠抗体（1:2000稀释）到96孔ELISA板中，在37°C下孵育1小时。随后加入辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗小鼠IgG并在37°C下孵育1小时。最后，使用TMB进行显色，并用2 M H2SO4终止反应，然后用微孔读取器测试OD450。在每个步骤之间需要用PBST洗涤板三次。**GM-CSF检测：**所有上清液样本均使用QuantiCyto Mouse GM-CSF ELISA试剂盒（NeoBioscience）进行检测，并按照制造商的说明操作。**评估工程细菌分泌的CD47nb和GM-CSF的生物活性：**所有上清液样本均通过0.22 μm滤膜过滤。对于CD47nb：将CT26细胞接种到24孔板中培养12小时，然后加入上清液并在37°C下与CT26细胞一起孵育过夜。之后，收集细胞并用流式细胞术缓冲液（PBS中含0.5% BSA）洗涤两次（500×g，5分钟）。随后，将细胞与FITC抗CD47抗体（eBioscience，11-0471-82）在4°C下孵育30分钟。再次洗涤细胞后，使用CytoFLEX S（Beckman Coulter）进行分析。对于GM-CSF：将RAW264.7细胞接种到24孔板中培养12小时，然后加入稀释后的上清液并在37°C下与RAW264.7细胞一起孵育48小时。之后，收集细胞并用流式细胞术缓冲液洗涤两次（500×g，5分钟）。随后，将细胞与PE抗CD86抗体（Proteintech，PE-65068）和FITC抗CD80抗体（Proteintech，FITC-65076）在4°C下孵育30分钟。再次洗涤细胞后，使用CytoFLEX S进行分析。

**测定荷瘤小鼠肿瘤和健康组织中的细菌数量：**将100 μL的工程细菌通过静脉注射到小鼠体内，并在特定时间点（24小时或治疗结束时）处死小鼠。前者用于检测细菌中的工程质粒稳定性；后者用于分析细菌在肿瘤和健康组织中的分布。将肿瘤和健康组织浸泡在500 μL的PBS中，并使用组织匀浆器（Servicebio）进行匀浆。将匀浆后的样本稀释并涂布在含有相应抗生素的LB琼脂板上，12小时后计数菌落。根据菌落计数、稀释比例和组织重量计算细菌滴度（CFU/g组织）。

**检测工程细菌分泌的肿瘤中的CD47nb：**将肿瘤组织置于RIPA裂解缓冲液（Yeasen）中匀浆，然后离心得到上清液。将上清液与6倍蛋白加载缓冲液（TransGen Biotech）混合并在95°C下孵育10分钟。后续步骤与上述相同。

**检测工程细菌分泌的肿瘤中的GM-CSF：**将肿瘤组织置于PBS中匀浆，然后离心得到上清液。使用QuantiCyto Mouse GM-CSF ELISA试剂盒（NeoBioscience）进行检测。

**肿瘤组织的免疫组化分析：**将样本切片固定在 slides 上（5 μm），并用苏木精和伊红染色。免疫组化分析由Servicebio完成。照片由倒置显微镜拍摄。

**肿瘤内细胞因子分析：**将肿瘤组织置于PBS中匀浆，然后离心得到上清液。使用QuantiCyto Mouse TNF-α ELISA试剂盒、QuantiCyto Mouse IL-6 ELISA试剂盒、QuantiCyto Mouse IFN-γ ELISA试剂盒和QuantiCyto Mouse IL-10 ELISA试剂盒（NeoBioscience）进行检测，并按照制造商的说明操作。

**通过流式细胞术分析肿瘤组织中的免疫细胞浸润：**为了分析免疫细胞类型，CT26荷瘤小鼠在接种第0天和第6天分别接受PBS或细菌静脉注射。初次给药后12天，处死小鼠，收集肿瘤组织并浸泡在2 mL的冰冻RPMI 1640培养基中，然后用手术刀切成1–3毫米的小块。随后，使用1 mg/mL的胶原酶IV（Absin）和50 μg/mL的DNase I（Biotopped）在37°C下孵育1小时。通过70 μm细胞滤网过滤消化后的组织液以获得单细胞悬浮液。通过不同浓度的Percol溶液（Yeasen）进行密度梯度离心去除细胞碎片。最后，将细胞用流式细胞术缓冲液重新悬浮。使用zombie R718 Fixable Viability Kit（BioLegend，423115）区分活细胞。此外，将细胞在4°C下用Fc阻断缓冲液（BioLegend，156603）孵育15分钟以防止非特异性结合。样品在冰上用特异性抗体染色30分钟。CoraLite594抗小鼠CD45抗体（Proteintech，CL594-65087）、eFluor 450抗F4/80抗体（Biolegend，48–4801-82）、APC-Cyanine7抗小鼠CD11b抗体（Proteintech，AY7-65055）、PE抗CD86抗体（Proteintech，PE-65068）和FITC抗CD80抗体（Proteintech，FITC-65076）用于鉴定M1型巨噬细胞；CoraLite594抗小鼠CD45抗体（Proteintech，CL594-65087）、eFluor 450抗F4/80抗体（Biolegend，48-4801-82）、APC-Cyanine7抗小鼠CD11b抗体（Proteintech，AY7-65055）、APC抗小鼠CD206抗体（Proteintech，17-2061-82）用于鉴定M2型巨噬细胞；CoraLite594抗小鼠CD45抗体（Proteintech，CL594-65087）、APC抗小鼠CD11c抗体（Proteintech，APC-65130）、PE抗CD86抗体（Proteintech，PE-65068）和FITC抗CD80抗体（Proteintech，FITC-65076）用于鉴定树突状细胞（DCs）；CoraLite594抗小鼠CD45抗体（Proteintech，CL594-65087）、FITC抗小鼠CD3抗体（Proteintech，CL488-65077）、APC-Cyanine7抗小鼠CD8（Proteintech，AY7-FcA98472-2）用于鉴定CD8+ T细胞。在这些实验中，细胞需要在用APC抗小鼠CD206抗体（Biolegend，17-2061-82）孵育前用流式细胞术固定缓冲液（Proteintech，PF00016）固定并用流式细胞术透膜缓冲液（Proteintech，PF00017）透膜。之后，用流式细胞术缓冲液或perm buffer洗涤样品，并通过CytoFLEX S（Beckman Coulter）进行分析。数据使用FlowJo软件（Becton, Dickinson & Company, USA）进行分析，每个样本记录至少105个细胞事件。

**定量和统计分析：**数据统计分析和图形输出使用计算机程序Prism（GraphPad Prism8）进行。数据以平均值±标准误（SEMs）表示；单因素方差分析（one-way ANOVA）使用Tukey多重比较 post-test来分析两组之间的显著差异，三组或更多组的数据分析使用Tukey多重比较 post-test。双因素方差分析（two-way ANOVA）用于涉及两个因素的数据分析。双向重复测量方差分析（two-way repeated-measures ANOVA）用于纵向肿瘤生长分析。生存曲线使用Kaplan-Meier方法分析，并通过log rank检验进行比较。ns表示p > 0.05，?p ≤ 0.05，??p ≤ 0.01，??p ≤ 0.001，???p ≤ 0.0001，???p ≤ 0.0001。

**补充信息（2）：**
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